猪附红细胞体的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪附红细胞体的检测方法，依次包括病原的分离纯化，猪附红细胞体DNA的提取，引物的设计与合成，PCR的检测，扩增产物的回收、鉴定及测序的步骤。相对于IHA、ELISA等其他检测方法而言，其特异性高、敏感性强，准确性可靠性大；能快速、简便、可靠、准确的检测出样品中的附红细胞体，也可用于附红细胞体病的流行病学调查和疗效检测。
【专利说明】猪附红细胞体的检测方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及猪附红细胞体的检测方法。
[0003]
【背景技术】
[0004]目前对附红细胞体病的诊断仍多采用镜检的方法，但由于一些人为的因素及该病多呈混合感染，常会发生误诊。临床上该病的诊断方法主要以直接镜检为主，其中包括鲜血压片和涂片染色，但是假阳性率高，动物实验方法是确诊的手段，但所费时间太长，费用高，血清学方法包括间接血凝试验、补体结合试验或酶联免疫吸附试验等，由于附红细胞体的抗体变化起伏较大，这些方法也不适用于该病的诊断。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种猪附红细胞体的检测方法，能快速、简便、可靠、准确的检测出附红细胞体病，以满足畜牧业生产和医学诊断的需求。
[0007]本发明提供的猪附红细胞体的检测方法，包括以下步骤:
一、病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样lml，4°C或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min离心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀释,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min离心10min,弃沉淀,取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4°C或一20°C保存备用；
二、猪附红细胞体DNA的提取,按GenomicDNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，4 °C或一 2 O °C保存备用；
三、引物的设计与合成，根据GenBank中登录的猪附红细胞体I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0软件设计了 I对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
四、PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最终确定反应体系为:10XPCR 缓冲液 2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min, 94°C 30s, 56°C 40s ,72°C 30 s ,30个循环，72°C延伸lOmin，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳；
五、取PCR产物5uL，进行琼脂糖核酸电泳后，按胶回收试剂盒说明进行回收，回收产物连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。在氨苄平板上筛选出可疑性克隆，阳性质粒送去Takara测序。
[0008]本发明提供的猪附红细胞体的检测方法，其有益效果在于，提供了一种检测附红细胞体病的标准方法，该方法采用的是PCR，相对于IHA、ELISA等其他检测方法而言，其特异性高、敏感性强，准确性可靠性大；能快速、简便、可靠、准确的检测出样品中的附红细胞体，也可用于附红细胞体病的流行病学调查和疗效检测；16Sr RNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析；可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16SrDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
[0009]
【具体实施方式】
[0010]下面结合一个实施例，对本发明提供的猪附红细胞体的检测方法进行详细的说明。
[0011]
实施例
[0012]本实施例的猪附红细胞体的检测方法，包括以下步骤:
一、病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样lml，4°C或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min离心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀释,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min离心10min,弃沉淀,取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4°C或一20°C保存备用； 二、猪附红细胞体DNA的提取,按GenomicDNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，4 °C或一 2 O °C保存备用；
三、引物的设计与合成，根据GenBank中登录的猪附红细胞体I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0软件设计了 I对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '；
四、PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最终确定反应体系为:10XPCR 缓冲液 2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min, 94°C 30s, 56°C 40s ,72°C 30 s ,30个循环，72°C延伸lOmin，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳；
五、取PCR产物5uL，进行琼脂糖核酸电泳后，按胶回收试剂盒说明进行回收，回收产物连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。在氨苄平板上筛选出可疑性克隆，阳性质粒送去Takara测序。
【权利要求】
1.一种猪附红细胞体的检测方法，其特征在于:包括以下步骤: 一、病原的分离纯化，严格无菌采集10份可疑病猪的血样lml，4°C或冷冻保存，于每份采集的血样中加入3倍0.01mol/L pH7.4的PBS清洗,2000r/min离心10min,去上清液,于沉淀中加入I倍的PBS稀释,56<€水浴3111；[11,立即2000r/min离心10min,弃沉淀,取上清液于另一离心管中，15000r/min离心2h，去上清液，于沉淀中加入1ml生理盐水稀释，4°C或一20°C保存备用； 二、猪附红细胞体DNA的提取,按GenomicDNA purification试剂盒使用说明，从纯化的猪附红细胞体病原及标准阳性病原中提取猪附红细胞体模板，4 °C或一 2 O °C保存备用； 三、引物的设计与合成，根据GenBank中登录的猪附红细胞体I6 S rRNA序列，用Primerpremier5.0软件设计了 I对特异性引物，预计扩增片段大小为263bp，引物序列为:上游引物P 1:5' >CACGCCGTAAACGATGGA<3/ ;下游引物P 2:5' >CACGAG CTGACGACAACC<3 '； 四、PCR的检测，通过对引物浓度和退火温度等条件进行优化，最终确定反应体系为:IOXPCR 缓冲液 2.5ul，dNTP 2ul，rTaq DNA 聚合酶 Q 0.25ul，20pmol/ul 上、下游引物 P1、P2 各 0.5ul，模板 DNA 2ul，加 ddH20 补足至 25ul ;反应条件为:95°C 3min, 94°C 30s, 56°C 40s ,72°C 30 s ,30个循环，72°C延伸lOmin，取PCR产物5ul，进行琼脂糖凝胶电泳； 五、取PCR产物5uL，进行琼脂糖核酸电泳后，按胶回收试剂盒说明进行回收，回收产物连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在氨苄平板上筛选出可疑性克隆，阳性质粒送去Takara测`序。
【文档编号】C12Q1/68GK103882098SQ201210561085
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】张述智, 夏伟, 朱绍辉, 张 浩, 王晓丽, 徐权汗, 李之详, 许团辉 申请人:青岛中仁药业有限公司