双齿围沙蚕β-1,4-内切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶（EG）基因序列及其克隆方法。双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶基因序列为SEQ?ID?NO.1中核苷酸序列所示。本发明从双齿围沙蚕中克隆到一种β-1，4-内切葡聚糖酶基因，该序列cDNA全长1481bp，其中开放阅读框位于31-1365位核苷酸，编码444个氨基酸残基。双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶基因的成功克隆和测序，为进一步分析纤维素酶影响下生物抗逆能力，为纤维素酶其它功能的筛选及应用奠定了基础；也为利用β-1，4-内切葡聚糖酶基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
【专利说明】双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学中基因克隆领域，具体的说是一种双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶(EG)基因序列及其克隆方法。
【背景技术】
[0002]纤维素酶(cellulase)是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称。高等动物体内是不产生纤维素酶的，而在蜗牛、蚂蚁、蚯蚓等少数低等无脊椎动物体内可以产生纤维素酶；草食动物瘤胃及盲肠中微生物产生的纤维素酶通过降解纤维素为草食动物提供能量。纤维素复合酶的水解作用是纤维素被彻底分解的有效途径。纤维素酶系是一种多组分的复合酶，一般包括内切型葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也称Cx酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91，也称C1酶、微晶纤维素酶)和β-葡萄糖苷酶(EC3.2.21，简称β G或纤维二糖酶)等3种主要成分。有关纤维素酶的水解机理至今仍未完全清楚，但普遍认为:首先外切纤维素酶使结晶结构的纤维素长分子链开裂，聚集结构解聚，长链分子末端部分发生游离，为纤维素水解酶的作用提高可及性和反应性，从而使纤维素易于水化；然后内切酶作用于经外切酶活化的纤维素，分解分子中β -1, 4-糖苷键，产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖；最后葡萄糖苷酶将纤维二糖等低聚糖水解成葡萄糖分子。天然纤维素水解成葡萄糖的过程须依靠这三种酶的协调作用才能完成，而内切葡聚糖酶(endoglucanase,简称EG)是纤维素复合酶中的重要组成部分，作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β -1, 4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子短链低聚糖，这些产物容易被葡萄糖苷酶降解为葡萄糖分子，而葡萄糖分子是很重要的生物能源。因此，对β_1，4-内切葡聚糖酶进行研究是十分必要的。
[0003]双齿围沙蚕(Perinereisaibuhitensis)属环节动物门多毛纲沙蚕科,作为潮间带地区的常见物种，是各种鱼类、甲壳类和海鸟的重要食饵。由于沙蚕位于水陆生态食物链的底部，能摄食底泥中的沉积物、有机碎屑和微生物等，此外，对重金属和某些工业有机污染物具有一定积累和消化作用，因此被认为 是多毛类中耐污染能力较强的底栖生物。多毛类沙蚕可以很好地利用底质中的有机污染物和一些重金属转化为自身的生产力，它们作为海洋食物链中的一个分室既是生产单元，又能够净化底质，使系统内部的废弃物再利用和循环，增加环境生态效益，其体内必然存在某种解毒和防御机制，而从我们过往研究中发现双齿围沙蚕的β_1，4-内切葡聚糖酶能够对某些污染胁迫产生反应。因此，研究沙蚕纤维素蛋白基因对揭示和利用其解毒防御系统功能具有重要意义，同时也为纤维素酶其它功能的筛选及应用奠定了基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种双齿围沙蚕β-1，4_内切葡聚糖酶基因序列及其克隆方法。
[0005]为实现上述目的本发明采用的技术方案为:[0006]一种双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列，双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列为SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
[0007]双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列编码蛋白为SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
[0008]双齿围沙蚕β_1，4-内切葡聚糖酶基因序列的克隆方法，首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA ;而后采用下游外侧特异性引物EG-Outer-R (5’ -TTCCTGTCTGCTCCATATCC-3’ )和下游内侧特异性引物 EG-1nner-R (5，-GTTAGGTCCTGG CCATTGTT-3’ )进行5’ -RACE反应，克隆得到β_1，4-内切葡聚糖酶基因5’端序列；再利用反向引物EG-F进行RT-PCR反应，克隆得到β-1，4-内切葡聚糖酶基因3’端序列，反向引物EG-F:5’-AACAGACCTGCTTGGAGCAT-3’ ；通过序列片段拼接矫正，最终获得β _1，4-内切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0009]本发明具有如下优点:
[0010]1.采用本发明对双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因的成功克隆和测序，首次确定其全部编码序列和部分非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序列，该序列可以用以设计引物再克隆该基因，也可以根据该序列或该序列所推导的氨基酸序列对该基因进行重组表达或基因转移。
[0011]2.双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶基因的成功克隆和测序，为进一步分析纤维素酶影响下生物抗逆能力，为纤维素酶其它功能的筛选及应用奠定了基础；
[0012]3.利用本发明所得β -1, 4-内切葡聚糖酶基因对不同浓度污染物的表达情况来作为污染早期预警工具提供了方法学的指导。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例提供 的双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶在不同浓度Cu胁迫下的表达效果图。
【具体实施方式】
[0014]双齿围沙蚕β_1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆方法包括以下步骤:(1)通过分析近源物种β_1，4-内切葡聚糖酶的EST序列及CDS序列的保守区设计简并引物EG-Outer-R, EG-1nner-R和反向引物EG-F ；(2)从鲜活健康的双齿围沙蚕成体组织中提取总RNA ；(3)利用TaKaRa5’ -Full Race试剂盒及下游外侧特异性引物EG-Outer-R和下游内侧特异性引物EG-1nner-R进行5’ -RACE反应，克隆得到β -1, 4-内切葡聚糖酶基因5’端序列；(4)利用反向引物EG-F进行RT-PCR反应，克隆得到β _1，4-内切葡聚糖酶基因3’端序列；另外，该反向引物还可以为序列表中SEQ ID N0.1核苷酸序列片段；(5)通过序列片段拼接矫正，最终获得β_1，4-内切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
[0015]实施例1
[0016]双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因如SEQ ID N0.1所示:
[0017]gaaaacagtt tcaccagaag gaattcagtc atggcttcct ttgcttacat ccttgctgcg
[0018]gtggcacttc tggcttcctg ccatgcacag tacaactacc gcaacgcgct tcagaaatcc
[0019]atcctattct acgctgccca aagatctggc cgactcccta gtaacaaccc aatagactgg
【权利要求】
1.一种双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶基因序列，其特征在于:双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列为SEQ ID N0.1中核苷酸序列所示。
2.—种权利要求1所述的双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列编码蛋白，其特征在于:双齿围沙蚕β -1, 4-内切葡聚糖酶基因序列编码蛋白为SEQ ID N0.2中氨基酸序列所示。
3.一种权利要求1所述的双齿围沙蚕β-1，4-内切葡聚糖酶基因序列的克隆方法，其特征在于:首先从双齿围沙蚕组织中提取总RNA;而后采用下游外侧特异性引物EG-Outer-R (5 ' -TTCCTGTCTGCTCCATATCC-3 ')和下游内侧特异性引物 EG-1nner-R(5; -GTTAGGTCCTGGCCATTGTT-3')进行5’-RACE反应，克隆得到β -1, 4-内切葡聚糖酶基因5’端序列；再利用反向引物EG-F进行RT-PCR反应，克隆得到β -1, 4-内切葡聚糖酶基因3’端序列，反向引物EG-F:5' -AACAGACCTGCTTGGAGCAT-3';通过序列片段拼接矫正，最终获得β_1 ，4-内切葡聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID N0.1。
【文档编号】C12N9/42GK103882040SQ201210562478
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】张倩茹, 牟文燕, 魏树和, 周启星 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所