专利名称：一种提高产酸丙酸杆菌耐酸能力的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高产酸丙酸杆菌耐酸能力的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
随着化石原料(如石油、煤炭)等不可再生资源、能源的日渐枯竭以及环境污染的日益加剧，我国经济的可持续发展受到严重制约。以可再生生物质资源为原料大规模生产人类所需的能源、化工、医药、食品及农用原材料的工业生物技术无疑是解决资源、能源及环境危机的有效手段。由于微生物发酵法生产成本较高，丙酸目前主要是由化学合成法生产。大幅提高发酵的产量、生产强度和底物转化率，是实现发酵法替代化学合成法生产丙酸 的必要途径。在发酵过程中，随着丙酸的不断积累，丙酸对细胞生长和产物合成的反馈抑制作用逐渐增强，细胞的代谢活力不断降低，最终导致丙酸产量和生产强度较低，生产成本较高。虽然通过流加一定量的强碱溶液如NaOH或Ca(OH)2可以维持pH值的稳定，但会增加发酵液的渗透压，也会增加环境负荷和下游提取成本。因此，如何有效地消除或减轻丙酸对微生物的反馈抑制作用是提高丙酸生产效率的重要科学问题之一，其中提高微生物对丙酸的耐受性能是一项重要的策略。本发明针对丙酸发酵的问题,公开了一种提高P. acidipropionici耐酸性能的方法。应用该方法可提高产酸丙酸杆菌P. acidipropionici耐酸性能,并显著提高了丙酸的产量。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高产酸丙酸杆菌耐酸能力的方法及其应用。本发明技术方案为在产酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)发酵过程中添加精氨酸和/或天冬氨酸。所述P. acidipropionici 购自 CGMCC，编号为 CGMCC1. 2230。所述P.acidipropionici 种子培养基(g/L H2O):酵母粉，10 ;tryptic soy broth,
5；KH2PO4,1. 5 ；K2HP04, 2. 5 ；pH 7. 0 ；所述基本培养基组成为(g/LH20):酵母粉，10 ;蛋白胨，5 ；KH2PO4,1. 5 ；K2HPO4, 2. 5 ；甘油，25 ；CoCl2,0. 01 ；CaCO3, 30 ；pH 7. O ；为了测定耐酸性，在耐酸培养基中丙酸添加量为2. 5_5g/L。 所述精氨酸添加量为0_30mM。所述天冬氨酸添加量为0_30mM。对本发明进一步描述,在产酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)发酵过程中单独添加精氨酸0_30mM或天冬氨酸0-30mM ;在产酸丙酸杆菌(P. acidipropionici)发酵过程中添加0-30mM精氨酸和0_30mM天冬氨酸。
优选将精氨酸和/或天冬氨酸添加于产酸丙酸杆菌发酵培养基中。本领域技术人员通常会根据本发明技术方案选择添加精氨酸和/或天冬氨酸的时间，通过测定丙酸产量即可知道精氨酸和/或天冬氨酸的效果。本发明有益效果如下采用本发明的方法提高了 P. acidipropionici的丙酸耐受性及丙酸产量，具有方法简单、成本低的优点。
图1.外源添加氨基酸对P. acidipropionici丙酸耐受性的影响。(A)外源添加30mM精氨酸时P. acidipropionici对4g/L丙酸 的耐受性；(B)外源添加30mM天冬氨酸时P. acidipropionici对3g/L丙酸的耐受性；(C)外源添加30mM天冬氨酸和30mM精氨酸时P. acidipropionici对4g/L丙酸的耐受性。(■，未添加氨基酸; ，添加氨基酸)图2.外源添加不同浓度的氨基酸对P. acidipropionici发酵生产丙酸的影响。(A)精氨酸(IOmM, 20mM, 30mM) ； (B)天冬氨酸(lOmM, 20mM, 30mM) ； (C)精氨酸和天冬氨酸(IOmM, 20mM, 30mM)。C，未添加氨基酸;+，添加氨基酸)。
具体实施例方式实施例1 :初始培养基中外源添加精氨酸提高P. acidipropionici的丙酸耐受性将冷冻甘油管保藏的P. acidipropionici接种到种子培养基,接种量1%，装液量lOO/lOOmL厌氧瓶，30°C静置培养60h后，转接到新鲜的种子培养基中，接种量1%，同样条件培养40h，完成活化培养。将经活化培养好的P. acidipropionici以接种量5%转接到耐酸培养基,装液量lOO/lOOmL厌氧瓶，30°C静置培养。每12h取培养液，适当稀释后使用紫外分光光度计测定吸光值0D_，设未添加精氨酸的发酵培养基作为对照，结果如表I和图1所示。通过添加不同精氨酸P. acidipropionici在酸性条件下的生长状况可以看出，在添加20mM精氨酸的条件下，P. acidipropionici分别可在最高含4g/L丙酸的培养基中生长良好,其耐受丙酸的浓度提高了 60%,同时添加20mM精氨酸和天冬氨酸时，P. acidipropionici可在最高含4g/L丙酸的培养基中生长良好。表I添加氨基酸提高产酸丙酸杆菌耐酸性及丙酸产量
权利要求
1.一种提高产酸丙酸杆菌耐酸能力的方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中添加精氨酸和/或天冬氨酸。
2.根据权利要求书I所述方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中添加0_30mM 精氨酸或天冬氨酸。
3.根据权利要求书2所述方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中添加30mM精氨酸。
4.根据权利要求书I所述方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中添加0_30mM天冬氨酸。
5.根据权利要求书4所述方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中添加20mM天冬氨酸。
6.根据权利要求书I所述方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中分别添加0-30mM精氨酸和天冬氨酸。
7.根据权利要求书8所述方法，其特征在于，在产酸丙酸杆菌发酵过程中分别添加 20mM精氨酸和20mM天冬氨酸。
8.根据权利要求书I所述方法，其特征在于，是在初始发酵培养基中添加精氨酸和/或大冬氨酸。
全文摘要
本发明公开了一种通过外源添加氨基酸提高产酸丙酸杆菌(P.acidipropionici)对丙酸的耐受性及丙酸产量的方法。通过在培养基中添加精氨酸或天冬氨酸，实现P.acidipropionici耐受丙酸的浓度分别提高了60%和20%，丙酸产量分别提高36%和26%，并通过同时添加20mM的两种氨基酸实现了丙酸产量的最大提高，本发明为提高丙酸杆菌耐酸的研究和丙酸发酵生产提供了有效的方法。
文档编号C12N1/20GK103013882SQ201210566749
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者陈坚, 堵国成, 刘龙, 李江华, 管宁子 申请人:江南大学