用于检测多种肿瘤相关基因mRNA的核酸检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测肿瘤相关基因mRNA表达的核酸检测试剂盒，本发明属于生命科学和生物【技术领域】，特别是一种基因检测试剂盒。本发明检测试剂盒包括以下各组分：组织裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；本发明采用探针实时荧光定量PCR技术，能够在同一个反应管中对肿瘤组织中ERCC1、TUBB3、RRM1等基因表达水平进行检测，不仅操作简便、可重复性强，还可有效节约时间，提高检测精度。
【专利说明】用于检测多种肿瘤相关基因mRNA的核酸检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生命科学和生物【技术领域】，特别是一种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够在同一个反应管中对肿瘤组织中ERCCl、TUBB3、RRMl等基因表达水平进行检测，可有效节约时间，提高检测精度。
【背景技术】
[0002]肿瘤是全球疾病致死的重要元凶之一。据统计，全球新肿瘤患者每10万人中就有173人，在中国每10万人中有110人。相对于其他疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入和发展，人们对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。但是，如何识别具有相同肿瘤发生部位、相同病理类型及病期的不同患者之间存在的差异成为实施个体化治疗的主要障碍。大量的临床研究和试验结果表明:特异肿瘤分子标志物是识别患者个体差异的重要依据，实现对这些靶标的检测是实施肿瘤个体化治疗的前提和基础。越来越多的证据显示，肿瘤药物作用路径的相关靶标如ERCCl基因mRNA表达水平是识别患者个体差异的最主要靶标。通过针对不同癌种的系统靶标检测，筛选适合患者个体的药物，提高治疗的针对性和有效率。[0003]ERCCl参与钼类药物造成的DNA损伤修复，DNA修复能力与钼类药物的多药耐药有密切关系。Lord等曾报道NSCLC患者应用吉西他滨/顺钼方案，ERCCl mRNA低表达的中位生存期明显高于ERCCl mRNA高表达的。结果提示了 ERCCl表达水平与顺钼疗效呈负相关。因此，ERCCl高表达可能意味着对顺钼耐药，ERCCl表达阴性的患者能够从含顺钼的辅助化疗中明显受益。在人体细胞中存在7种β微管蛋白同型，目前紫杉醇类药物耐药涉及各个微管蛋白同型。其中β微管蛋白III表达与作用微管类化疗药物的敏感性显著相关。所以，国内外的研究结果显示β微管蛋白III高表达可能提示对紫杉醇类药物有耐药，而低表达则对紫杉醇类药物敏感，β微管蛋白III可以作为是否选择紫杉醇类药物辅助化疗的分子标志物。RRMl是核苷酸还原酶的亚结构，核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸是DNA合成的重要步骤，吉西他滨则是通过竞争，影响DNA的合成而起到杀伤肿瘤的目的。RRMl过表达时则会影响吉西他滨的疗效。因而RRMl是判断是否选用吉西他滨化疗的分子标志物，临床上对于RRMl低表达患者可选择吉西他滨进行化疗，高表达者不适宜用吉西他滨。
[0004]肿瘤治疗能否真正实现“个体化”，最终还要依赖于靶标相关基因mRNA表达水平和蛋白表达水平的检测的结果是否准确可靠。如何确保靶标检测结果的准确可靠是目前实施肿瘤个体化治疗面临的最大挑战。在实际应用中，用于检测ERCC1、TUBB3、RRMl等基因表达的方法主要是免疫组化，尽管该法原理简单，但是实验过程过于繁琐，需要实际种类繁多，且实验结果需要经验丰富的专家来判读，纯在较大的主观性。这促使我们寻找新的方法来检测肿瘤相关基因mRNA表达水平。
[0005]实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时在线检测，反应化疗相关基因在组织中的初始含量，实验节约了大量的检测时间，还避免了遗留污染的发生。常见的方法有SYBR Green染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreen由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针杂交法成本有比较昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于肿瘤相关基因检测。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术中检测ERCC1、TUBB3、RRMl基因表达量的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测相关基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发一种在同一个反应管中检测ERCCl、TUBB3、RRMl三个基因mRNA表达的核酸检测试剂盒。
[0007]用于检测ERCCl、TUBB3、RRMl三个基因mRNA的核酸检测试剂盒，包含组织裂解液、RNA提取液、PCR反应液、检测反应液、内参反应液、阳性对照品和阴性对照品；其特征在于:
[0008]PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTP、Mg2+ ;检测反应液包含检测用上下游引物和相对应探针、内参反应液包含参照用上下游引物Actin-F/Actin-R探针Actin-Probe ;其中进一步的，检测用上下游引物和探针的比例优化为SEQ-F =SEQ-R =SEQ-Probe的摩尔比为2:2:
1。参照用上下游引物和探针的比例优选为:HPRT1-F =HPRTl-R =HPRTl-Probe的摩尔比为2:
2:1。所述阳性对照品是已构建包含ERCC1、TUBB3、RRM1基因的质粒；所述阴性对照品为无质粒的溶液。RNA提取液可以用商业产品OMEGA FFPE RNA Kit石蜡抽提试剂盒代替。
[0009]使用本发明的试剂盒，将荧光实时PCR技术结合采用Taqman探针，可以对ERCCl、TUBB3.RRM1三种基因mRNA进行检测，检测精确度高，而且操作简单，可以降低检测成本，节约检测时间。利用阀值比较法，将检测结果与正常人的表达水平相比，能衡量受检者体内三种基因表达是否正常，该方法是一种新型的用于评价患者化疗基因表达的方法，有助于相应化疗药物的选择与治疗方案的确定。由于引入了正常人基因，不但能够对受检者体内相关基因表达量进行检测，还能与正常人相比，指导后期用药，提高患者生存率。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是阳性对照示意图
[0011]图2是阴性对照示意图
[0012]图3是基因检测结果不意图
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0014]试验例1 本发明试剂盒临床样本的检测试验
[0015]1、抽提石蜡组织RNA
[0016]1.1转移3-8石腊切片至1.5离心管,加入1 mL 二甲苯,振荡10秒混合均匀。室温下1000OXg离心2分钟，小心吸弃上层液体。[0017]1.2加入ImL无水乙醇冲洗沉淀，以消除残留的二甲苯。室温下1000OXg离心2
分钟,弃去液体。
[0018]1.3打开离心管，371:干燥15分钟，直到所有残留乙醇蒸发。
[0019]1.4 加入 200 uL Buffer FTL 和 20 uL OB Protease，震荡混匀。
[0020]1.555°C静置15 min，然后80°C静置15分钟。10000Xg离心5分钟，转移上清液
到一个新的离心管。
[0021]1.6加入220uLBuffer GTC,震荡混匀。加入660uL无水乙醇，震荡混匀。
[0022]1.7把RNA微洗脱柱放入提供的2 ml收集管中。从第10步转移700ul至洗脱柱中，包括任何可能形成的沉淀。10000 Xg离心I分钟，丢弃通过的液体，在第12步中重复使
用收集管。
[0023]1.8重复步骤11，直到所有液体通过RNA微洗脱柱，丢弃通过液体和收集管。
[0024]1.9把洗脱柱放入新的2ml收集管，加入500uL乙醇稀释的RWB WashBuffer洗涤。10000Xg离心I分钟，丢弃液体。重复上述步骤,10000Xg离心2分钟干燥洗脱柱。
[0025]1.10把洗脱柱放入无菌1.5ml离心管，加入15_50uLDEPC水，室温静置3分钟。1000OXg离心I分钟以洗脱柱里RNA。
[0026]2、冰冻组织RNA提取
[0027]1
[0028]2
[0029]2.1样品处理50_100mg组织中加入1ml TRIzol试剂。
[0030]2.2将上述样品于15_30°C静置5min，使核蛋白充分解离。
[0031]2.3加入0.2ml氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15_30°C静置2_3min。
[0032]2.4于2-8°C 12000g离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA。
[0033]2.5取上清，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，于15-30°C静置IOmin后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA。
[0034]2.6 于 2_8°C 12000g 离心 IOmin 后弃去上清。
[0035]2.7向沉淀中加入1ml 75%乙醇，轻轻混匀。
[0036]2.8 于 2_8°C 7500g 离心 5min 后弃上清
[0037]2.9将RNA样品凉干(不要彻底干燥)，加入适量DEPC水溶解(可于55_60°C促溶IOmin)。
[0038]3、参照TAKARA反转录试剂将RNA反转录为cDNA。
[0039]4、试剂准备
[0040]表1反应体系
【权利要求】
1.一种检测肿瘤相关基因HiRNA的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括以下各组分:组织裂解液、RNA提取液、检测体系PCR反应液、检测用上下游引和探针、阳性对照品和阴性对照品。
2.按照权利要求1所述的肿瘤相关基因mRNA的核酸检测试剂盒，其特征在于，检测体系PCR反应液包括PCR缓冲液、dNTP、Mg2+、检测用上下游引物和探针。
3.如权利要求1所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述引物与探针为DNA，其中 (1)检测ERCCl基因的SEQID NO:1~SEQ ID NO: 3所示序列； (2)检测TUBB3基因的SEQID NO:4~SEQ ID NO:6所示序列； (3)检测RRMl基因的SEQID NO:7~SEQ ID NO:9所示序列； (4)参照基因HPRTl基因的SEQID NO: 10~SEQ ID NO: 12所示序列。
4.按照权利要求1所述的肿瘤相关基因mRNA的核酸检测试剂盒，其特征在于:所述的荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX荧光报告基团；所述的荧光淬灭基团包括BHQl荧光淬灭基团。
5.如权利要求1所述的核酸试剂盒，其特征在于各引物及探针的配比如下=SEQ-F:SEQ-R =SEQ-Probe 摩尔比为 2:2:1。
6.如权利要求1所述的核酸试剂盒，其特征在于HPRTl-F=HPRTl-R =HPRTl-Probe的摩尔比为2:2:1。
7.如权利要求1所述的核酸试剂盒，其特征在于所述阳性对照品是已构建包含相关基因的质粒；所述阴性对照品为无质粒的溶液。
【文档编号】C12Q1/68GK103898196SQ201210570149
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月25日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】郜恒骏, 姚健, 张可浩, 盛海辉 申请人:泰州医药城博奥邦科生物科技有限公司