专利名称：Cpped1基因的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及CPPEDl基因的用途。
背景技术：
结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病，结核分枝杆菌不仅可引起肺结核(85%)，而且可引起肺外多种器官的结核病。尽管目前已有有效的抗结核药物，但结核病仍然是当前感染性疾病的头号杀手，全球每年约200万人死于结核病；全球约三分之一的人口感染结核分枝杆菌，在这些被称为结核菌潜伏感染(LTBI)的人群中，有约10%最终将进展为活动性结核病。由于目前缺乏有效的结核病疫苗，结核病的预防控制主要依赖于早期发现、治疗、隔离活动性结核病人。然而，现今诊断活动性结核病的检测技术存在严重不足，不能满足临床和结核病预防控制的要求1)痰结核分枝杆菌微生物检查特异性高，是当前诊断活动性肺结核的金标准，但存在敏感性低(不足40%)，耗时长(结核菌培养耗时I 一 2个月)，实验室生物安全要求高的缺点。2)结核分枝杆菌基因检测，虽然实现了快速诊断的目的(I天)，但直接从痰标本进行的基因检测在敏感性方面没有显著提高，且存在假阴性，假阳性的问题。3)免疫学检测中抗体检测被世界卫生组织认定不适合结核病的诊断；细胞免疫学检测包括结核菌素皮试(TST)和结核菌干扰素释放试验(IGRA)，不能有效判别活动性结核患者和结核菌潜伏感染者，虽然后者在活动性结核患者检测的敏感性显著高于其他检测。CPPEDl也叫CSTP1，钙调样磷酸酯酶结构域包含蛋白1，属于金属磷酸酯酶超家族，该基因的功能未知， 目前尚没有关于CPPEDl基因作为结核诊断标志物的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种CPPEDl基因的用途，CPPEDl基因可作为判别结核潜伏感染和活动性结核的分子标志物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现本发明提供了一种CPPEDl基因的用途，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选至少包括一对特异扩增CPPEDl基因的引物。所述特异扩增CPPEDl基因的引物，优选为CPPEDl-F :5，-AGAAACTCGCTCGCCATGT-3，，CPPEDl-R :5，-CGCCCAGGATGAAGTAGAAT-3，；所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括与CPPEDl基因的核酸序列杂交的探针。
利用本发明的试剂盒，可以检测病人CPPEDl基因的表达情况，从而诊断病人是否患有活动性结核病。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在合适条件下诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行扩增反应。优选的引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在15 25个核苷酸之间。在本发明中，所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。经实验证明，本发明CPPEDl基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群，因此CPPEDl基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。
下面结合附图和具体实施 方式对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明实施例1的CPPEDl基因在人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的定量RT-PCR结果图。图2是本发明实施例2的CPPEDl基因在PBMC中差异表达的芯片结果图。
具体实施例方式下面结合实施例和附图对本发明进行进一步描述实施例1本实施例将人群分为三组结核病患者、潜伏感染人群和健康人群(各20例)，通过检测每例外周血单个核细胞(PBMC)中CPPEDl基因mRNA变化，发现其在结核病患者中呈明显的上调表达趋势。本实施例用定量RT-PCR方法检测每例CPPEDl基因的表达变化。具体步骤如下步骤一外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备在离心管中加入淋巴细胞分离液(Fresenius Kabi NOrge As:LYS3773)5ml ;取上述确诊的结核病患者，潜伏感染病人以及健康人群的肝素抗凝静脉血各2ml与等量IM的磷酸缓冲液(PBS)充分混匀得到混合液，用移液器将混合液沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面上，保持清晰的界面，2000转/分离心20分钟；用吸管吸取中间云雾层置入另一离心管后接着加入5倍体积的IM PBS, 1500转/分离心10分钟洗涤细胞，弃上清，相同条件重复洗涤细胞一次，接着加入含小牛血清体积百分比为10%的的RPMI1640 (Thermo scientific SH30807. 01b) 1ml，重悬细胞，得到三组人群的各20例PBMC悬液；每例取20 μ I的PBMC悬液于血球计数板上，计数细胞浓度。步骤二 RNA抽提采用Qiagene公司的RNeasy Mini Kit (货号74106)对上述得到的三组人群的各20例PBMC悬液进行RNA抽提。具体操作是取上述含I X IO6个细胞的PBMC悬液于去DNA酶和RNA酶的离心管中，3000转/分离心10分钟，弃上清；在细胞沉淀中加入350 μ IBuffer RLT,充分混匀裂解；加入250 μ I无水乙醇，混匀，把液体转移到RNeasy柱子中，8，OOOg离心30秒，弃废液；加入350 μ I Buffer Rffl以8，OOOg离心30秒，弃废液；加入80 μ I DNase 溶液(10 μ I DNase+70 μ I Buffer RDD),柱上消化 15min，8，OOOg 离心 30 秒，弃废液；加入 350 μ I Buffer RWl, 8，OOOg 离心 30 秒，弃废液；加入 500 μ I Buffer RPE,8，OOOg离心30秒，弃废液；空甩，8，OOOg离心I分钟；把柱子转移到一个去DNA酶和RNA酶的1. 5ml离心管，加入40 μ I无RNase的ddH20,10，OOOg离心I分钟，收集三组人群的各20例的RNA于-80 ° C保存、待用。步骤三反转录采用TAKARA公司的反转录试剂盒(DRR047)，取步骤二得到的RNA0. 5μ g进行反转录，该试剂盒较传统反转录试剂盒增加了去除基因组DNA的步骤，可在最大程度上保证RNA的纯度和扩增的特异性。分步如下(I)基因组DNA的去除反应表I
权利要求
1.一种CPPEDl基因的用途，其特征在于，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品
2.根据权利要求1所述的CPPEDl基因的用途，其特征在于，所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。
3.根据权利要求2所述的CPPEDl基因的用途，其特征在于，所述用实时定量PCR判别结核潜伏感染和活动性结核的产品至少包括一对特异扩增CPPEDl基因的引物。
4.根据权利要求3所述的CPPEDl基因的用途，其特征在于， 所述特异扩增CPPEDl基因的引物，为CPPEDl-F :5’ -AGAAACTCGCTCGCCATGT-3’，CPPEDl-R :5’ -CGCCCAGGATGAAGTAGAAT-3’。
5.根据权利要求2所述的CPPEDl基因的用途，其特征在于，所述用基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品包括:与CPPEDl基因的核酸序列杂交的探针。
全文摘要
本发明提供了一种CPPED1基因的用途，用于制备判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。所述判别结核潜伏感染和活动性结核的产品优选包括用实时定量PCR或基因芯片检测判别结核潜伏感染和活动性结核的产品。经实验证明，本发明CPPED1基因在结核病人血液中的表达明显高于健康人群以及潜伏感染人群，因此CPPED1基因可作为诊断结核的特异标志基因，使结核诊断更加准确、快速。
文档编号C12Q1/68GK103045745SQ20121059182
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者陈心春, 周伯平, 杨倩婷, 张明霞, 蔡毅, 张国良 申请人:深圳市第三人民医院