免疫多样性评估方法及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种用于将正常、健康个体的免疫组库区别于具有症状性和/或非症状性疾病的个体的免疫组库的方法。
【专利说明】免疫多样性评估方法及其用途
[0001]本申请要求于2011年I月14日提交的美国临时申请号61/432,638的优先权的利益，在适用的法律和/或法规允许的情况下通过引用将其结合于此。
发明领域
[0002]本发明涉及用于进行诊断测试的方法。更具体地，本发明涉及用于评估免疫细胞群中的多样性水平的诊断测试。
[0003]发明背景
[0004]很少存在用于个体疾病的确定诊断的单个诊断测试。然而，诊断测试可以用来检测是否存在正常状态并且这些测试的结果可以用来筛选患者并集合地有助于诊断。例如，正常白细胞计数为4，500至10，000细胞/毫升。增高的白细胞计数对于特定疾病不是决定性的，但它可以指示需要医学评价的潜在问题。女人和男人的红细胞计数的正常范围通常是不同的，5百万至6百万/毫升的计数对于男性是正常的而360至560万对女性是正常的。如果血小板计数在150，000至400，000的范围内，则它们是正常的。在炎症存在下，例如,红细胞计数会下降，白细胞计数会升高,并且血小板计数也会升高。
[0005]血糖水平可以用作与疾病相关的早期指示，其随着库欣综合征(Cushingsyndrome),甲状腺功能允进症,胰腺癌,胰腺炎,前驱糖尿病和糖尿病而变化。心脏病、患心脏病的倾向、某些癌症的征兆、以及多种遗传病可以以多种诊断测试的一种或多种异常结果作为它们的早期征兆。个别地和/或集合地指示正常健康或缺乏正常健康(即疾病)的诊断测试包括例如测量白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、血清钙、血清氯化物、二氧化碳、肌酸酐、直接胆红素、Y-谷氨酰-转肽酶(Y-GT)，葡萄糖，乳酸脱氢酶(LDH)，血清磷，钾，血清钠，总胆红素，总胆固醇，总蛋白质和尿酸。
[0006]疾病预防也需要对正常状态的更精确描述，因为仅当我们可以更好描述什么是正常时，我们才可以从正常或亚正常鉴别偏差，并且评价预防措施的有效性。
[0007]尽管多种诊断测试是目前可获得的并且被经常实施，但是许多疾病如癌症和心脏病可能一直未被检测到直到它们已经进展到出现明显物理症状的点。极其常见的是，在所述点提供有效治疗为时太晚。因此，一直需要可以用来评估患者的健康以及用来鉴别可以对严重疾病的存在或易患这样的疾病的倾向发出信号的异常状态的额外测试。
[0008]发明概沭
[0009]本发明涉及一种用于鉴别个体中的正常免疫状态或异常免疫状态的方法，正常免疫状态被存在可检测的免疫系统细胞的多样性靶群所指示，而异常免疫状态被缺少这样的多样性所指示。所述方法包括定量免疫系统细胞的克隆型和鉴别构成在该群内计数的细胞总数的显著百分比的克隆型的数量。正常状态被表征为存在较大多样性(variety)(或多样性(diversity))的由细胞总数的显著百分比代表的克隆型，而异常状态被表征为存在显著较低数量的由细胞总数的显著百分比代表的克隆型。例如，TCR的最重要区域是第三互补决定区(CDR3)，其核苷酸序列对于每个T细胞克隆是唯一的。所述显著百分比可以是约25%至约75%的数。在本发明的不同方面，本发明的发明人已发现百分之五十(50%)的显著百分比提供有用的诊断结果。在总数细胞的〃显著百分比〃为百分之五十(50%)的情况下，多样性指数(D50)是由S种不同CDR3构成的J个个体细胞(CDR3的总数)的免疫组库的多样性的分级优势度形式的量度，其中^是第i丰富的CDR3的丰度，T1是最丰富的CDR3的丰度，r2是第二丰富的⑶R3的丰度等等。C是总计>总测序读数的50%的不同⑶R3的最小数量。因此D50通过C/S xlOO给出。
[0010]假设
【权利要求】
1.一种用于鉴别个体中的正常免疫状态或异常免疫状态的方法，所述方法包括 a)定量在患者样品中免疫系统细胞的群或亚群中的免疫系统细胞的克隆型； b)鉴别构成在所述群或亚群内计数的细胞总数的显著百分比的克隆型的数量，其中正常免疫状态被表征为存在较大多样性的由所述细胞总数的所述显著百分比代表的克隆型，并且异常免疫状态被表征为存在显著较低数量的由所述细胞总数的所述显著百分比代表的克隆型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述显著百分比是选自约25至约75的百分数。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述显著百分比是50%。
4.根据权利要求4所述的方法，其中50%通过C/SXlOO确定，其中C是总计大于或等于在对从所述细胞的群分离的多核苷酸进行扩增和测序后获得的总测序读数的50%的不同克隆型的最小数量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞的群选自由以下各项组成的组:所有T细胞[panT]，CD8+T细胞[细胞毒性T(T。)]，CD4+T细胞及它们的亚型[ΤΗ1, ΤΗ2，ΤΗ17，调节T (Treg)，滤泡 T (Tfh)]，幼稚 T (Tn)，活化 T (Ta)，记忆 T (Tm)，所有 B 细胞(panB)，幼稚 B (Bn)，活化B (Ba)，记忆B (Bm)，血浆和成浆细胞B细胞。
6.一种用于评估免疫组库的多样性水平的方法，所述方法包括以下步骤: (a)在包含靶特异性嵌套引物的反应混合物中从来自人或动物受试者的白细胞群扩增多核苷酸以产生一组第一扩增子，所述靶特异性嵌套引物的至少一部分包含额外的核苷酸，所述额外的核苷酸在扩增期间充当用于将至少一种通用引物的结合位点结合到所述第一扩增子中的模板； (b)将含有所述第一扩增子的所述第一反应混合物的一部分转移到包含至少一种通用引物的第二反应混合物中； (c)利用所述至少一种通用引物，扩增所述第一扩增子以产生一组第二扩增子； (d)对所述第二扩增子进行测序以鉴别在白细胞的所述亚群中的V(D)J重排序列； (e)利用所鉴别的V(D)J重排序列来定量在免疫系统细胞群中的细胞总数和在所述群内鉴别的每个克隆型内的细胞总数；和 (f)鉴别构成在所述群内计数的细胞总数的显著百分比的克隆型的数量，其中正常状态被表征为存在较大多样性的在所述细胞总数的所述显著百分比内代表的克隆型，并且异常状态被表征为存在较少数量的在所述细胞总数的显著百分比内代表的克隆型。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述显著百分比是约25至约75的百分数。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述显著百分比是约50%。
【文档编号】C12Q1/68GK103797366SQ201280013207
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年1月17日 优先权日:2011年1月14日
【发明者】韩健 申请人:Cb生物技术公司