用于载物递送进入细胞的系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及命名为NickFect的用于细胞内载物递送的系统，该系统包括至少一种组分A，其共价地连接至细胞穿透肽B和/或肽或非肽构建体C。所述递送系统NickFect涉及与载物非共价或共价复合的化学修饰的新的细胞穿透肽（CPP），用于有效的细胞递送。
【专利说明】用于载物递送进入细胞的系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及命名为NickFect的用于细胞内载物(cargo)递送的系统，该系统包含至少一种组分A，其共价连接至细胞穿透肽B和/或肽或非肽构建体C。所述递送系统NickFect涉及与载物非共价或共价复合(络合)的化学修饰的新的细胞穿透肽(CPP)用于有效的细胞递送。更精确地，本发明涉及包含无毒性的肽递送载体的建构物(构建体)，其具有增加的稳定性且更有效地从胞内溶酶体逃脱并且其能够与载物形成稳定的复合物(络合物)，其在血清的存在下保持完整。
[0002]本发明涉及一种递送系统，其具有所形成的纳米颗粒的整体负电荷，用于寡核苷酸递送。
[0003]本发明还涉及一种递送系统，其包含分支的CPP，其中脂肪酸修饰的TPlO或它的部分通过赖氨酸或它们的类似物的a、0、Y、e-氨基连接至两亲性肽和/或a-螺旋肽或肽片段。
[0004]此外，本发明涉及用于体外或体内将载物(RNA、DNA、药物、质粒、小环(minicircles)等)递送进入祀细胞的细胞质或细胞核的方法。本发明还涉及该系统在疾病的诊断中作为研究工具和作为靶向系统的用途、包含上述系统的组合物特别是药物组合物、以该系统覆盖的材料以及具有进入材料的递送系统的材料。最后还涉及新的细胞穿透肽。
【背景技术】
[0005]疏水性细胞膜是封闭细胞内容物的脂双层。它的功能是作为屏障:通常，仅小的和/或疏水性分子可以穿过，并且防止其它大分子如裸露DNA、RNA或蛋白质进入细胞内部。虽然在过去的十年中设计了几种策略来解决此问题，但不能穿过质膜仍然是成就目前的药物研究和开发(R&D)要克服的主要障碍之一。
[0006]在过去的40年中，已开发了若干种目的在于调苄基因表达的基于寡核苷酸(ON)的方法。除了其它因素以外，这类方法的效率还取决于ON有效摄取进入细胞以及随后的内体逃逸。用于基因调节的其它最基本的方法涉及使用细菌载体来表达感兴趣的基因。除了评价不同基因的功能方面以外，极具吸引力的策略是在临床环境中利用，即基因治疗。最初考虑基因治疗用于遗传性基因疾病的矫正治疗，例如，通过剪接-校正寡核苷酸。然而，在过去的15年中，用于癌症疾病的实验性基因治疗已成为最常见的应用，虽然也已经研究了其它获得性疾病[I]。
[0007]已经出现利用较短ON序列来干扰基因表达的其它通用策略。最近已严格地开发了基于双链RNA分子的、长度为20-25个核苷酸的干扰RNA (siRNA)的反义方法，将其用于进行基因沉默或剪接校正ON (SC0)，并用于操作剪接模式[2，3]。虽然是用于调苄基因表达的有效生物分子，但它们的亲水性本性和大小(在大小超过IMDa的质粒的情况下)会阻止细胞内化。
[0008]因此，为了促进目前的基因治疗，需要各种细胞递送系统来将不同分子转运进入细胞，但它们的大多数具有一些缺点，如高细胞毒性、固有的免疫原性、低转染效率等(表I)。
[0009]表1:递送载体
[0010]
【权利要求】
1.一种包括细胞穿透肽B的用于载物递送进入细胞的系统，所述系统可以包括共价连接的组分A和共价或非共价连接的肽或非肽构建体C，作为用于将载物递送进入细胞的靶向部分。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，肽B包括化学修饰的细胞穿透肽TP10，所述细胞穿透肽TPlO具有共价连接至主链的任何脂肪酸(例如硬脂酸)。
3.根据权利要求1-2所述的系统,其中，由Lys、Orn>Thr> Ser> Asp或Glu取代在位置3处的Tyr。
4.根据权利要求1-3所述的系统,其中，由Lys、Orn、Thr、Ser、Tyr、Asp、Glu或任何其它亲水性氨基酸取代在位置8处的He。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中，由亮氨酸的异构体和/或类似物(例如正亮氨酸)取代至少一个Leu。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，由赖氨酸的异构体和/或类似物(例如鸟氨酸)取代至少一个赖氨酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中，肽B是包含通过赖氨酸或它们的类似物的a、0、Y、S、e -氨基连接至两亲性肽和/或a -螺旋肽和/或肽片段(例如NPY、P物质、缓激肽、模型序列如(Ala-Leu)n、TP10、甘丙肽、肥大脱粒肽)的脂肪酸修饰的TPlO肽和/或它的片段(例如甘丙肽、肥大脱粒肽)的分支肽。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的递送系统，其中，将一个或多个组分A直接地或通过间隔子连接至肽B。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的递送系统，其中，连接的组分A可以是不同的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，组分A包含磷酸基(PO3)或任何带负电荷的部分(选自由Asp、Glu、碳水化合物但不限于此组成的组中)或者甚至可以是具有整体负电荷的肽序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统，包含至少一种组分C，所述组分C是靶向部分。
12.根据权利要求11所述的系统，其中，所述靶向部分是细胞或肿瘤归巢肽、适体、受体配体、包含连接至失活肽的可切割位点的间隔子、肽配体、细胞毒性肽、用于已知或未知受体的生物活性肽配体、选择性地结合至某种组织或细胞类型的肽序列、或核定位序列(NLS)。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的系统，进一步包括载物，其中一种或多种载物共价地和/或非共价地连接至组分B。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的系统，其中，将一种或多种组分A、一种或多种组分C以及一种或多种载物连接至肽B。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统，包含一种以上的肽B。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的系统，其中，使用间隔臂来连接至少一种组分C和载物。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的系统，其中，所述载物选自由以下各项组成的组中但不限于此:寡核苷酸和其修饰变体，包括单链寡核苷酸(DNA、RNA、PNA、LNA和它们的类似物)、双链寡核苷酸(siRNA、shRNA、诱饵DNA);质粒和其其它变体；合成核苷酸类似物。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的系统，其中，所述载物选自由以下各项组成的组中:细胞或肿瘤归巢肽、适体、受体配体、包含连接至失活肽的可切割位点的间隔子、肽配体、细胞毒性肽、生物活性肽、抗体、诊断剂、蛋白质、药物例如抗癌药物或抗生素。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的系统，进一步包括至少一种显像剂和/或标记分子。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的系统，包含在连接循环中的清除调节剂，如PEG。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的系统，其中，所形成的肽B和载物纳米颗粒的总表面电荷是负的。
22.—种组合物，包含一种以上的根据权利要求1-21中任一项所述的递送系统。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的系统在疾病的诊断中作为研究工具、作为靶向系统和作为药物组合物的用途 。
【文档编号】C12N15/87GK103813808SQ201280018078
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年2月22日 优先权日:2011年2月22日
【发明者】厄洛·朗格尔, 皮雷特·阿鲁库斯科, 尼基塔·奥斯科尔科夫, 达娜·玛丽亚·科波洛维奇 申请人:派普菲克斯公司