使用腺相关病毒（aav）载体递送蛋白的制作方法
【专利摘要】本文公开了用于使用腺相关病毒（AAV）载体递送感兴趣的蛋白的组合物、系统和方法。公开了包括5’和3’反向重复序列（ITR）、启动子、用于多核苷酸的插入的限制性酶切位点和转录后调节元件的AAV载体。还公开了AAV载体用于表达中和抗体的用途。
【专利说明】使用腺相关病毒(AAV)载体递送蛋白
[0001]相关申请
[0002]根据35U.S.C.§ 119(e)，本申请要求以下的美国临时申请号的优先权:2011年2月22日提交的61/445，449 ；2011年10月21日提交的61/550，123 ;和2012年2月14日提交的61/598，728。这些优先权申请通过引用整体明确并入本文。
[0003]关于联邦政府赞助R&D的声明
[0004]本发明根据美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的HHSN266200500035C，在政府的支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
[0005]序列表的引用
[0006]本申请与电子格式的序列表一起提交。提供序列表作为2012年2月21日创建的、大小为148Kb、命名为SEQLISTING.TXT的文件。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。
[0007]背景
发明领域
[0008]本申请一般涉及免疫学和基因递送领域。更具体地，本申请涉及用于生产感兴趣的蛋白诸如抗体的组合物、系统和方法。
_9] 相关技术的描述
[0010]尽管巨大的努力，至今还没有开发用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的有效的疫苗。已鉴定出许多抗体为能够中和大部分循环的HIV毒株。尽管大量的努力集中在设计能够从头(de novo)诱发将针对相似表位的抗体的免疫原上，但传统的疫苗是否将能够诱发现有的广泛中和抗体的类似物仍然不清楚。作为免疫的替代，本文描述的载体介导的基因转移能够被用于设计现有的广泛中和抗体的分泌进入循环。
[0011]现有的目标为生产遗传编码的治疗蛋白的方法仅导致有限水平的基因表达。例如，先前使用基于腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)的载体设计体液免疫的努力导致中度的抗体生产(Lewis等人，J.Virol.76:8769 - 8775 (2002))，其随后通过使用替代的衣壳(Fang等人Nature Biotechnol., 23:584 - 590 (2005))和以运载能力为代价的增加表达的自身互补 AAV (scAAV)载体(McCarty., Mol.Ther., 16:1648 - 1656 (2008))被改进。近来，将scAAV载体用于由小的、人工融合的抗体片段组成的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-中和免疫粘附素的直接表达(Johnson等人，Nature Med.，15 (8): 901 - 906 (2009))。然而，该预防的功效被针对免疫粘附素蛋白的内源免疫应答所限制。另外，现有的基于AAV方法的效カ的缺乏可追溯到AAV载体无能力传递长度大于约4800碱基对的序列Jong等人，HumanGene Therapy, 7:2101-2112 (1996)。AAV载体的该限制已使得难以设计包含编码治疗蛋白的基因和表达促进元件以允许用于特别是体内(in vivo)高水平生产的载体。因此，对能够有效表达基因的紧凑型载体和系统的开发具有迫切的需求。
[0012]概述
[0013] 本文公开的ー些实施方案提供了病毒载体，其中该病毒载体包括:腺相关病毒(AAV)的 5，末端反向重复序列(inverted terminal repeat, ITR)和 3，AAV ITR ;启动子；启动子下游的限制性酶切位点以允许编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入，和限制性酶切位点下游的转录后调节元件，其中启动子、限制性酶切位点和转录后调节元件位于5’ AAV ITR的下游和3’ AAV ITR的上游。
[0014]在一些实施方案中，该病毒载体还包括插入在限制性酶切位点并与启动子可操作地连接的多核苷酸，其中多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区。
[0015]在一些实施方案中，多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区的直接上游的信号肽序列。在一些实施方案中，信号肽选自以下组成的组:干扰素的信号肽、人生长激素的信号肽、红细胞生成素(EPO)的信号肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的信号肽、胰岛素的信号肽、和其任何组合。
[0016]在一些实施方案中，病毒载体包括与Kozak共有序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
[0017]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白选自以下组成的组:全长抗体、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(16?)、6<5?、红细胞生成素ぴ?0)、胰岛素、抗体？&13片段、抗体8(^片段、血友病相关的凝血蛋白、抗肌萎縮蛋白、溶酶体酸性脂肪酶、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、糖原贮积病相关的酶、和其任何变体。
[0018]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是病毒的中和抗体。在一些实施方案中，病毒的中和抗体是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流感病毒的中和抗体。在一些实施方案中，HIV的中和抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、和其任何变体。在一些实施方案中，HCV的中和抗体选自以下组成的组:AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。在一些实施方案中，流感病毒的中和抗体选自以下组成的组:F10杭-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、FI6抗-流感抗体、TCN32抗-流感抗体、和其任何变体。
[0019]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是疟疾的中和抗体。
[0020]在一些实施方案中，启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、鸡(6-肌动蛋白(CAG)启动子、泛素C (UBC)启动子、或其任何变体。在一些实施方案中，启动子包括剪接供体、剪接受体、或其任何变体。在一些实施方案中，剪接供体包括与SEQ ID N0:5具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，剪接受体包括与SEQ ID NO:6具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子包括与SEQ ID N0:1具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子包括与SEQ ID N0:2-4中任ー个具有至少90%序列同一‘丨生的核苷酸序列。
[0021]在一些实施方案中，转录后调节元件是病毒转录后调节元件。在一些实施方案中，病毒转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、こ型肝炎病毒转录后调节兀件(HBVPRE)、RNA 转运兀件(RNA transport element, RTE)、或其任何变体。
[0022]在一些实施方案中，病毒载体还包括转录后调节元件下游的转录终止区。在ー些实施方案中，转录终止区包括SV40晩期poly (A)序列、兔(6-珠蛋白poly(A)序列、牛生长激素poly (A)序列、或其任何变体。
[0023]在一些实施方案中，启动子包括内含子。在一些实施方案中，内含子是包括与SEQID NO: 8具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的合成的内含子。[0024]在一些实施方案中，多核苷酸包括免疫球蛋白的重链可变区的第一编码区和免疫球蛋白的轻链可变区的第二编码区。在一些实施方案中，第一编码区和第二编码区被2A序列分开。在一些实施方案中，2A序列是F2A序列。
[0025]在一些实施方案中,将第一编码区的5’与第一信号肽序列融合并将第二编码区的5’与第二信号肽序列融合。在一些实施方案中，第一信号肽序列和第二信号肽序列是不同的。
[0026]在一些实施方案中，起始于5’ ITR并终止于3’ ITR的区是至少约2.5kb。
[0027]本文的一些实施方案提供了用于体内生产感兴趣的蛋白的方法，其中该方法包括:提供包括编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV);并将重组AAV施用至受试对象，据此重组AAV在受试对象中表达抗体，其中核苷酸是至少约1.4kb。
[0028]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是抗体。在一些实施方案中，抗体是全长抗体。在一些实施方案中，抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、FlO抗-流感抗体、FI6抗-流感抗体、TCN32流感抗体、CR6261抗-流感抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、抗-疟疾抗体、和其任何变体。
[0029]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约9 ii g/ml的量表达。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约IOOii g/ml的量表达。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约500 ii g/ml的量表达。
[0030]在一些实施方案中，通过以下步骤产生重组AAV:提供具有病毒载体、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAV cap基因的包装细胞系，其中病毒载体包括5’AAV末端反向重复序列(ITR)、3’ AAV ITR和编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列；和从包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。`
[0031]在一些实施方案中,病毒载体是本文公开的任一病毒载体的病毒载体。
[0032]本文公开的ー些实施方案提供了用于减少或抑制受试对象中病毒感染风险的方法，其中该方法包括:提供包括编码病毒的中和抗体的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV);并将重组AAV施用至受试对象，据此重组AAV在受试对象中表达抗体。
[0033]在一些实施方案中，该方法还包括提供包括编码病毒的第二中和抗体的核苷酸序列的第二重组AAV。
[0034]在一些实施方案中，受试对象是哺乳动物。在一些实施方案中，受试对象是人。
[0035]在一些实施方案中，中和抗体是全长抗体。
[0036]在一些实施方案中，与没有用病毒载体处理的受试对象相比，该方法减少受试对象中感染风险至少约5倍。在一些实施方案中，与没有用病毒载体处理的受试对象相比，该方法减少受试对象中感染风险至少约20倍。在一些实施方案中，该方法抑制受试对象中病毒感染。
[0037]在一些实施方案中，抗体在受试对象的血清中以至少约9 ii g/ml的量表达。在一些实施方案中，抗体在受试对象的血清中以至少约IOOii g/ml的量表达。在一些实施方案中,抗体在受试对象的血清中以至少约500 ii g/ml的量表达。
[0038]在一些实施方案中，病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流
感病毒。[0039]在一些实施方案中，中和抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、FlO抗-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、TCN32流感抗体、FI6抗-流感抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。
[0040]在一些实施方案中，通过肌内注射、阴道内注射、静脉注射、腹腔内注射、皮下注射、表皮给药、皮内给药、或鼻腔给药将重组AAV施用至受试对象。
[0041]在一些实施方案中，至多每年一次将重组AAV施用至受试对象。在一些实施方案中，至多每5年一次将重组AAV施用至受试对象。在一些实施方案中，至多每10年一次将重组AAV施用至受试对象。
[0042]本文公开的ー些实施方案提供了生产重组腺相关病毒(AAV)的方法，其中该方法包括:提供具有包括5’AAV末端反向重复序列(ITR)和3’AAV ITR、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAV cap基因的病毒构建体的包装细胞系；和从包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
[0043]在一些实施方案中，AAV cap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9的衣壳、或其变体。
[0044]在一些实施方案中,病毒构建体是本文公开的任何病毒载体。
[0045]在一些实施方案中，重组AAV不是自身互补的AAV (scAAV)。
[0046]本文公开的ー些实施方案提供了一种分离的、合成的或重组的多核苷酸，其中该多核苷酸包括:与SEQ ID NO:1具有至少约90%或更多的序列同一性的核酸序列。在ー些实施方案中，多核苷酸包括选自`SEQ ID N0:2-4的核苷酸序列。
[0047]附图简述
[0048]图1A是显示在肌内注射2X IO9GC的从ー组启动子表达荧光素酶的AAV2/8载体后15周的荧光素酶活性的图(n=2)。图1B是组合CMV增强子和鸡(6-肌动蛋白启动子、之后是位于泛素增强子区两侧的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)的CASI启动子的实施方案的示意图展示。图1C是显示肌内注射IXlO9GC的编码由指示的启动子驱动的荧光素酶的AAV2/8后8周，与传统的CMV和CAG启动子相比，来自由CASI驱动的AAV载体的荧光素酶活性的图(n=2)。图1D是显示CMV驱动的具有或不具有WPRE、由指示的聚腺苷酸化信号终止的AAV载体的施用后6周的荧光素酶活性的图(n=2)。图1E是用于抗体表达的表达盒的示意图展示，包括反向重复序列(ITR)、CASI启动子、与被自加工(self-processing) 2A序列分开的k轻链连接的IgGl重链、用于改善表达的WPREJP SV40晩期-聚腺苷酸化信号。将抗体重链和轻链的V-区克隆入载体的以实心的方框指示的位置处。
[0049]图2是本申请的范围内的AAV载体的实施方案的示意图展示。
[0050]图3A是显示用携帯具有包括弗林蛋白酶裂解位点的标准的或优化的F2A序列的以上显示的抗体转基因的载体转染后，通过ELISA比较抗体体外(in vitro)表达的柱形图。图3B是显示用携帯具有天然的或人生长激素(HGH)衍生的融合至重链基因、轻链基因或两种基因的信号肽的4E10的载体转染之后，通过ELISA比较4E10抗体的体外表达的柱形图。图3C是显示用携帯在标准表达盒中的或其中剪接供体和受体被突变以減少外来的剪接的可能的盒中的4E10的载体转染之后，通过ELISA比较4E10抗体的体外表达的柱形图。图3D是优化用于体外表达的示例性的IgGl转基因的示意图展示。突出的是重链和轻链信号序列(“SS”)、F2A自加工肽(“F2A”)和预测的剪接供体和受体位点(“重链恒定区”和“k恒定”中的实线)。
[0051]图4A-D显示HIV被从优化表达的转基因:bl2 (图4A)、2G12 (图4B)、4E10 (图4C)和2F5 (图4D)表达的抗体中和(n=3，RLU=相对荧光素酶单位)。
[0052]图5A显示肌内注射I X 101°基因组拷贝的表达荧光素酶的AAV2/8后15周的代表性的Rag2/ y c小鼠的Xenogen图像。图5B是显示通过接受I X 101°或I X IO11GC的编码荧光素酶的AAV2/8的肌内注射的Rag27.y z「小鼠的Xenogen成像的荧光素酶活性的定量说明长期剂量依赖性的表达的图(n=2)。图5C是显示循环中人IgG的浓度的图，如通过对取自肌内注射I X 101°或I X IO11GC的表达4E10-1gGl的AAV2/8进入Rag2_A y z「小鼠后的血清样品的总的人IgG ELISA测量的(n=2)。
[0053]图6是显示在免疫缺陷的NOD/SCID/ y c (NSG) Rag2/ y c (Rag2)或免疫活性的C57BL/6 (B6)和Balb/C小鼠中肌内注射产生bl2_IgG的优化的表达载体的IXlO11基因组拷贝后，通过ELISA定量人IgG的绘图(绘图显示平均值和标准误差，n=4)。
[0054]图7是显示HIV攻击后HuPBMC-NSG人源化的小鼠中⑶4细胞的消耗的图。
[0055]图8A是显示循环中人IgG的浓度的图，如通过对取自肌内注射表达荧光素酶或bl2-1gG的载体后6周的血清样品的ELISA测量的(ND，未检出)。图8B显示用IOngP24NL4-3腹腔内攻击进入6周前接受表达荧光素酶(左图)或bl2-1gGl (右图)的AAV2/8载体的动物后的人源化的小鼠中CD4T细胞的消耗(n=6)。
[0056]图9显示由不同的广泛中和HIV抗体介导的保护的比较。图9A显示循环中的抗体的浓度，如通过对取自肌内注射表达4种广泛中和HIV抗体的载体后的血清样品的总的人IgG ￡し15ム测量的(11=8)。图98显示用5叩p24NL4_3的静脉HIV攻击后的4种广泛中和HIV抗体在保护huPBMC-NSG人源化的小鼠免受CD4细胞消耗方面的相对效カ的比较(n=8)。图9C显示取自攻击后8周的脾的切片的免疫组化染色检测的HIV p24。箭头指示被列为p24表达阳性的细胞。比例尺，40mm。图9D显示指示被感染的动物的脾中的表达p24细胞的相对频率的脾的免疫组化染色的定量。ND，未检出。星号指示通过双侧t检验的来自荧光素酶对照小鼠对表达抗体的小鼠的显著差异的结果(n=4-6)#P，0.01，#*P，0.0001。图9A-B显示平均值和标准误差均值(s.e.m.);图9D显示平均值和标准差(s.d.)。
[0057]图10显示在HIV攻击之前总的人IgG和结合gpl20的IgG的血清浓度。图1OA是显示由移植细胞和VIP产生的总的人抗体浓度的图，如通过对取自肌内注射表达荧光素酶或bl2抗体的载体后5周的和人PBMC的过继转移后3周的和IV HIV攻击之前的当天的血清样品的人IgG ELISA测量的(n=8)。图1OB是显示使用gpl20特异性的ELISA测量HIV特异性的抗体的浓度定量的相同时间点的抗体的浓度的图(n=8 )。
[0058]图11是显示bl2抗体介导⑶4细胞的保护随时间推移的图。作为NL4-3的剂量的静脉攻击的结果的在huPBMC-NSG人源化的小鼠中的CD4细胞消耗显示在最右边。表达荧光素酶的小鼠(左图)易于CD4细胞丧失，而表达bl2的小鼠(右图)显示在所有剂量下被保护免受HIV (n=8)。
[0059]图12A是显示bl2的表达随时间推移作为剂量的函数的绘图，如由对取自AAV施用后的血清样品的总的人IgG ELISA确定的(n=8)。接受表达荧光素酶载体的小鼠没有呈现出可检测的人抗体(n=12)。图12B是显示在攻击之前1天、人PBMC的过继转移后3周和肌内注射指示剂量的AAV后15周的血清中bl2的浓度的图，如通过gpl20特异性的ELISA测量能够结合HIV的抗体的部分确定的(n=8-12)。图12C是显示在HuPBMC-NSG人源化的小鼠中的⑶4细胞消耗作为用IOng的NL4-3静脉攻击进入表达一系列bl2的动物的结果的绘图，显示保护免受感染必需的抗体的最小剂量。图12A和12C显示平均值和标准误差，且图12B显示个体动物和平均值(n=8-12)。
[0060]图13A是显示VRCOl的表达随时间推移作为剂量的函数的图，如由对取自AAV施用后的血清样品的总的人IgG ELISA确定的(n=8)。接受表达荧光素酶的载体的小鼠没有呈现出可检测的人抗体(n=12)。图13B是在攻击之前I天、人PBMC的过继转移后3周和肌内注射AAV的指示剂量后15周的血清中VRCOl的浓度的图，如由gpl20特异性的ELISA测量能够结合HIV的抗体的部分确定的(n=8-12)。图13C是显示作为用IOng的NL4-3静脉内攻击进入表达一系列VRCOl的动物的结果的在huPBMC-NSG人源化的小鼠中的⑶4细胞消耗的图，显示保护免受感染必需的抗体的最小剂量。图13A和13C显示平均值和标准误差，及图13B显示个体动物和平均值(n=8-12)。
[0061]图14是显示在Balb/C小鼠中肌内注射IX IO11基因组拷贝(GC)的表达未被修饰的bl2、F10、或CR6261抗体的重组AAV病毒后，由ELISA定量血清中人IgG的图(绘图显示平均值和标准误差，n=8)。
[0062]图15显示被修饰的FlO和CR6261抗体增加的表达。图15A是比较bl2抗体和FlO和CR6261WT序列，并与由FlO或CR6261重链与bl2轻链构成的嵌合构建体相比的柱形图。图15B是列出在AAV载体中使用的不同的被修饰的bl2和/或4E10抗体轻链的表。图15C是比较由融合至bl2和/或4E10抗体轻链序列的FlOVL序列组成的FlO抗体轻链变体的表达水平的柱形图。图KD是比较由融合至bl2和/或4E10抗体轻链序列的CR6261VL序列组成的CR6261抗体轻链变体的表达水平的柱形图。
[0063]图16A是显示在Balb/C小鼠中肌内注射IXIOiiGC的产生bl2、F10、或CR6261抗体的优化表达载体后，由ELISA定量血清中人IgG的图(绘图显示平均值和标准误差，n=6)。图16B是显示取自被给予表达bl2、FlO或CR6261抗体的VIP的小鼠的血清的中和活性的绘图，如使用GFP报告测定针对5种流感毒株(PR/8、CA/09、SI/06、VN/04、JP/57)测量的。值根据导致50%的流感感染的中和的血清稀释倍数计算。虚线代表检验的最低稀释(20倍)并将低于这个线的值从曲线拟合外推或沿着轴绘制以代表无可检测的中和活性。
[0064]图17A是显示循环中人IgG的浓度的图，如通过取自肌内注射表达bl2、F10、或CR6261的载体后5周和在病毒攻击之前2天的血清样品中由总的人IgG ELISA测量的。图17B是显示在接受表达VIP对照(bl2)或FlO-1gG的动物中用IxIO4PFU的CA/09流感鼻内攻击后，在Balb/C小鼠中观察到的体重下降的图(n=8)。图17C是显示用CA/09攻击后4天的体重下降和CR6261-1gG浓度的相关性d，用5x104PFU的S106在接受表达VIP对照(bl2)或FlO-1gG的动物中鼻内攻击后，在Balb/C小鼠中观察到的体重下降的图(n=8)(Figurei/し is a grapn showing correlation 01 weight loss4days post challengewith CA/09and CR6261_IgG concentration, d, Weight loss observed in Balb/C micefollowing intranasal challenge with5xl04PFU of S106in animals that received VIPexpressing control (bl2) or FlO-1gG(n=8) )?图 17D 是显不 PR/8 的鼻内攻击后，表达bl2和FlO的Balb/C小鼠中的存活率的图。图17E是显示在接受表达VIP对照(bl2)或FlO的动物中用1000PFU的PR/8鼻内攻击后，在Balb/C小鼠中观察到的体重下降的图(n=8)。图17F-G是显示5种流感毒株(PR/8、CA/09、SI/06、VN/04、JP/57)的体外中和的绘图，如通过使用取自CA/09 (图17F)或S106 (图17G)攻击后接受表达bl2、FlO或CR6261的重组AAV的动物的血清的GFP报告分析检测的。值根据导致50%的流感感染的中和的稀释倍数计算。虚线代表检验的最低稀释(20倍稀释)并将低于这个线的值从曲线拟合外推或沿着轴绘制以代表无可检测的中和活性。
[0065]图18A是显示在肌内注射IXIOiiGC的表达荧光素酶的载体之后，由年幼(3个月)的或年老(12个月)的NOD/SCID/ y c+(NSG)小鼠的Xenogen成像定量荧光素酶的表达的图(n=8)。图18B是显示在肌内注射IXIOiiGC的表达FlO-1gG的载体之后，通过年幼的(3个月)或年老的(12个月)NSG小鼠的血清中的ELISA定量人IgG的图(n=8)。图18C是显示用1000PFU的PR/8流感鼻内攻击后接受表达荧光素酶或FlO-1gG的重组AAV的3个月大的NSG小鼠的存活(左)和体重下降(右)的图(n=6-8)。图18D是显示用1000PFU的PR/8流感鼻内攻击后接受表达荧光素酶或FlO-1gG的重组AAV的12个月大的NSG小鼠的存活(左)和体重下降(右)的图(n=4-6)。图18E显示取自用1000PFU的PR/8流感攻击后5天接受表达荧光素酶或FlO-1gG的VIP的3个月大的NSG小鼠的代表性的肺切片的苏木精-伊红染色(比例尺=100微米)。图18F是显示由训练有素的病理学家量化的指示炎症的顺序分数(ordinal score)的绘图(0=无炎症,5=最大炎症)。图18G是显示肺组织中流感RNA的定量随着处死动物用于分析的时间而变化的绘图。
[0066]图19A是实施例12中采用的低剂量粘膜HIV攻击方案的示意图展示。每周，从小鼠取血井随后通过接种物的非腐蚀性阴道内施用用50ng JR-CSF的p24攻击，如由实线箭头指示的。图19B是显示作为HIV感染的结果的循环中CD4细胞随时间推移的消耗的图，如通过流式细胞术测量的。图19C是显示13次阴道内攻击后在处死时的HIV血浆病毒载量的绘图，如通过Abbott RealTime HIV-1Viral Load qPCR测定测量的。这种测定的检测极限是200拷贝/mL。在检测极限处绘制了不可检测的样品。
[0067]图20是显示在施用表达B12、AR3A和AR3B抗体的重组AAV病毒之后，通过ELISA定量血清中人IgG的图。
[0068]详述
[0069]在下面的详述中，參考形成本文一部分的附图。在详述、附图、和权利要求书中描述的阐述性实施方案不是g在限制。可利用其他实施方案并可作出其他改变，而不偏离此处呈现的主题的精神或范围。将容易理解的是本公开的各方面，如本文通常描述的，及附图中阐述的，在多种多样的不同的布局中可被排列、替换、组合、和设计，其所有的都明确地涉及并构成本公开内容的部分。
[0070]本申请提供了可用于生产重组腺相关病毒(AAV)的病毒载体，和能够在合适的环境中表达ー种或多种感兴趣的蛋白的重组AAV，所述环境例如，在用重组AAV转染的细胞、组织、器官、或受试对象中。本文还公开了用于制造和使用重组AAV的方法。例如，可将重组AAV用于体内、离体(ex vivo)、或体外生产感兴趣的蛋白。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白的表达能够被用于诊断、预防、或治疗ー种或多种疾病或障碍，诸如減少或抑制病毒感染的风险。
[0071]在一些实施方案中，病毒载体包括:AAV的5’末端反向重复序列(ITR)和3’ AAVITR、启动子、启动子下游的限制性酶切位点以允许编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入、和限制性酶切位点下游的转录后调节元件，其中启动子、限制性酶切位点和转录后调节元件位于5’ AAV ITR的下游和3’ AAV ITR的上游。可将病毒载体用于，例如，表达一种或多种感兴趣的蛋白(例如，抗体)。例如，病毒载体可包括编码ー种或多种抗-HIV抗体、杭-HCV抗体、杭-流感抗体、或其组合的多核苷酸。可将病毒载体用于，例如，为了诊断或治疗目的在受试对象中生产高水平的感兴趣的蛋白(例如，抗体)。
[0072]定义
[0073]除非另有定义，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。见，例如Singleton等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 第 2 版，J.ffiley&Sons (New York, N.Y.1994) ；Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold SpringsHarbor, N.Y.1989)。为了本发明的目的，下面定义了以下的术语。
[0074]如本文所用的，术语“载体”指的是多核苷酸构建体，典型是被用于传递遗传物质至宿主细胞的质粒或病毒。载体可以是，例如，病毒、质粒、粘粒、或噬菌体。如本文所用的载体可由DNA或RNA构成。在一些实施方案中，载体由DNA构成。“表达载体”是当它存在于合适的环境时，能够指导由该载体携帯的ー个或多个基因编码的蛋白的表达的载体。载体优选能够自主复制。典型地，表达载体包括转录启动子、基因、和转录终止子。通常将基因表达放置在启动子的控制下，且基因被称为是“可操作地连接至”启动子。
[0075]如本文所用的，将术语“可操作地连接”用于描述调节元件和基因或其编码区之间的连接。典型地，将基因表达放置在一个或多个调节元件的控制下，所述调节元件例如而不限于，组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件、和增强子。基因或编码区被称为是“可操作地连接至”或“操作地连接至”或“可操作地联合”调节元件，意味着该基因或编码区由该调节元件控制或影响。例如，如果启动子实现编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。
[0076]如本文所用的术语“构建体”，指的是为了特定核苷酸序列的表达的目的被产生、或将在其他重组核苷酸序列的构建中被使用的重组核酸。
[0077]如本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的且指的是任何核酸，不论是由磷酸二酯键或被修饰的键诸如磷酸三酷、氨基磷酸酷、硅氧烷、碳酸酷、羧酸甲酯、氨基こ酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥接的氨基磷酸酷、桥接的亚甲基膦酸酯、桥接的氨基磷酸酯、桥接的氨基磷酸酷、桥接的亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酷、桥接的硫代磷酸酯或磺内酯键、和此类键的组合构成的。术语“核酸”和“多核苷酸”还具体地包括由除了 5个生物存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基构成的核酸。
[0078]术语“调节元件”和“表达控制元件”可互換地被使用井指的是能够在特定宿主生物体中影响可操作地连接的编码序列的表达的核酸分子。这些术语被广泛使用并覆盖促进或调节转录的所有元件，包括启动子、RNA聚合酶和转录因子的基本互作所需的核心元件、上游元件、增强子、和应答元件(见，例如，Lewin, “Genes V”(Oxford UniversityPress, Oxford) 847-873页)。原核生物中示例性的调节元件包括启动子、操纵基因序列和核糖体结合位点。在真核细胞中使用的调节元件可包括而不限于，转录和翻译控制序列，诸如启动子、增强子、剪接信号、聚腺苷酸化信号、終止子、蛋白降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列、和类似的，其在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码的多肽的生产。
[0079]如本文所用的，2A序列或元件指的是在两个蛋白之间引入的作为接头的小肽，允许聚蛋白的自主核糖体内自加工(见，例如，de Felipe.Genetic Vaccines andTher.2:13(2004) ;deFelipe 等人 Traffic5:616-626 (2004))。这些短肽允许多个蛋白从单个载体上共表达。许多2A元件是本领域已知的。可在本文公开的方法和体系中使用的2A序列的示例，不限制，包括来自ロ蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、一点褐翅蛾(Thoseaasigna)病毒(T2A)、和猪捷申病毒-1 (P2A)的2A序列，如美国专利公布号20070116690中描述的。
[0080]如本文所用的，术语“启动子”是允许结合RNA聚合酶并指导基因转录的核苷酸序列。典型地，启动子位于基因的5’非编码区中，临近基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子内的序列元件通常特征为共有核苷酸序列。启动子的示例包括，但不限于，来自细菌、酵母、植物、病毒、和哺乳动物(包括人)的启动子。启动子可以是诱导型的、阻抑型的、和/或组成型的。诱导型启动子响应培养条件中的ー些变化，诸如温度的变化，启动从在它们的控制下的DNA的增加的转录水平。
[0081]如本文所用的，术语“增强子”指的是能够増加转录效率的调节元件的类型，无论增强子相对于转录起始位点的距离或方向。
[0082]如本文所用的，术语“抗体”以最广义被使用并具体地覆盖人、非人(例如，鼠科动物)和人源化的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们呈现所需的生物活性。可使用本文公开的系统和方法表达多种抗体。“抗体”和“免疫球蛋白”通常是异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每一条轻链通过二硫键连接至重链。二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每一条重链包括可变域(VH)、之后的一些恒定域。每一条轻链包括在一端的可变域(I)和在它的另一端的恒定域。将轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并将轻链可变域与重链可变域对齐。尽管抗体呈现与特定抗原的结合特异性，免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的其他抗体样分子。后ー种的多肽，例如，由淋巴系统以低水平并由骨髓瘤以增加的水平生产。
[0083]如本文所用的，术语“变体”指的是具有与參考多核苷酸(或多肽)基本上相似的序列的多核苷酸(或多肽)。在多核苷酸的情况下，与參考多核苷酸相比，变体可具有在5’末端、3’末端、和/或ー个或多个内部位点的一个或多个核苷酸的缺失、替换、添加。变体和參考多核苷酸之间的序列相似性和/或差异可使用本领域已知的常规技术检测，例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括经合成衍生的多核苷酸,诸如例如通过使用定点诱变产生的多核苷酸。通常，多核苷酸的变体，包括，但不限于DNA，可与參考多核苷酸具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更多的序列同一性，如通过由技术人员已知的序列比对程序确定的。在多肽的情况下，变体可具有与參考多肽相比的一个或多个氨基酸的缺失、替换、添加。变体和參考多肽之间的序列相似性和/或差异可使用本领域已知的常规技术检测，例如蛋白质印迹。通常，多肽的变体与參考多肽可具有至少约60%、约 65%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更多的序列同一性，如通过由技术人员已知的序列比对程序确定的。
[0084]如本文所用的，术语“转染”指的是将核酸引入宿主细胞内，诸如根据以下描述的通过将细胞与重组AAV病毒接触。
[0085]如本文所用的，术语“转基因”指的是通过人为干涉整合进入靶细胞的ー个或多个染色体的任何核苷酸或DNA序列。在一些实施方案中，转基因包括编码感兴趣的蛋白的多核苷酸。编码蛋白的多核苷酸通常操作地连接至可用于获得感兴趣的基因的所需表达的其他序列，诸如转录调节序列。在一些实施方案中，转基因可另外包括被用于标记其已整合入的染色体的核酸或其他分子。
[0086]如本文所用的，“治疗”指的是响应由患者体现的或患者可能易感的疾病、障碍或生理状况作出的临床干预。治疗的目的包括，但不限于，缓和或预防症状、减缓或停止疾病、障碍、或状况的进展或恶化和/或缓解疾病、障碍或状況。“治疗(treatment)”指的是治疗性处理和预防或防治性措施的之ー或两者。需要治疗的受试对象包括已被疾病或障碍或不想要的生理状况影响的受试对象和其中疾病或障碍或不想要的生理状况待被预防的受试对象。
[0087]如本文所用的，术语“有效量”指的是足够实现有益的或令人满意的生物和/或临
床结果的量。
[0088]如本文所用的，“受试对象”指的是为处理、观察或实验的客体的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物诸如鱼、贝类、爬行动物、和特别是哺乳动物。如本文所用的“哺乳动物”指的是属于哺乳纲(Mammalia)的个体并包括，但不限于，人、家养和农场动物、动物园动物、体育和宠物动物。哺乳动物的非限制性的示例包括小鼠、大鼠；兔；豚鼠；狗；猫；绵羊；山羊；牛；马；灵长类，诸如猴、黒猩猩和猿、和特别是人。在一些实施方案中，哺乳动物是人。然而，在一些`实施方案中，哺乳动物不是人。
[0089]腺相关病毒(AAV)载体
[0090]腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度约4.7kb，包括145个核苷酸的末端反向重复序列(ITR)。ITR在AAV的DNA整合进入宿主细胞基因组中发挥作用。当AAV感染宿主细胞时，病毒基因组整合进入宿主的染色体，导致细胞的潜伏感染。在自然系统中，辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)提供允许AAV病毒在被感染的细胞中生产的基因。在腺病毒的情况下，基因￡认、￡18、￡24』4和￥4提供辅助功能。当用辅助病毒感染吋，AAV前病毒被拯救并扩增，且AAV和腺病毒都被生产。在不具有Rep和/或Cap基因的重组AAV载体的情况中，AAV可以是非整合的。
[0091]提供了包括一个或多个感兴趣的蛋白的编码区的AAV载体，所述蛋白例如长度超过500个氨基酸的蛋白。AAV载体可包括AAV的5’末端反向重复序列(ITR)、3’AAV ITR、启动子、和启动子下游的限制性酶切位点以允许编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入，其中启动子和限制性酶切位点位于5’AAV ITR的下游和3’AAV ITR的上游。在一些实施方案中，重组AAV载体包括限制性酶切位点下游和3’ AAV ITR上游的转录后调节元件。在一些实施方案中，本文公开的AAV载体可被使用作为携带编码感兴趣的蛋白的转基因的AAV转移载体，用于产生能够在宿主细胞中表达感兴趣的蛋白的重组AAV病毒。[0092]可使用本领域众所周知的任何合适的遗传工程技术实现病毒载体的产生，所述技术包括而不限于，限制性内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、和DNA测序的标准技术，例如在 SambrooK 等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarborLaboratory Press, N.Y.(I989))中描述的。
[0093]病毒载体可合并来自任何己知生物体的基因组的序列。序列可以以它们的自然形式被合并或可以以任何方式被修饰以获得所需的活性。例如，序列可包括插入、缺失或替换。 [0094]启动子
[0095]在本文公开的病毒载体中，多种启动子可与包括感兴趣的蛋白的编码区的核酸可操作地连接。在一些实施方案中，启动子可驱动感兴趣的蛋白在用源自病毒载体的病毒感染的细胞中表达，所述细胞诸如靶细胞。启动子可以是天然存在的或非天然存在的。
[0096]启动子的示例，包括，但不限于，病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。病毒启动子的示例包括，但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、CAG启动子(其是CMV早期增强子元件和鸡(6-肌动蛋白启动子的组合，在Alexopoulou等人BMC Cell Biology9:2, (2008)中描述)、猿猴病毒 40 (SV40)启动子、在 Brisson 等人，Naturel984, 310:511-514中描述的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S RNA和19S RNA启动子、烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白启动子、和其任何变体。植物启动子的示例包括，但不限于，热休克启动子，诸如在Gurley等人，Mol.Cell.Biol.1986,6:559-565中描述的大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B，和其任何变体。哺乳动物启动子的示例包括，但不限于，人延伸因子Ia-亚基(EFl-1a )启动子、人泛素C (UCB)启动子、小鼠磷酸甘油酸激酶-1 (PGK)启动子、和其任何变体。
[0097]在一些实施方案中，启动子是包括至少CAG启动子的部分的合成启动子。CAG启动子的部分可包括与SEQ ID NO: 3具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。
[0098]在一些实施方案中，启动子包括CMV增强子。在一些实施方案中，启动子包括UBC增强子。在一些实施方案中，启动子包括至少CMV增强子的部分。例如，CMV增强子可包括与SEQ ID NO:2具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包括至少UCB增强子的部分。UCB增强子可包括与SEQ ID N0:4具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。
[0099]在一些实施方案中，启动子是具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列的合成的CASI启动子。合成的CASI启动子包含CMV增强子的部分、鸡(6-肌动蛋白启动子的部分、和UBC增强子的部分。在一些实施方案中，启动子可包括与SEQ ID NO:1具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。在ー些实施方案中，启动子包括与SEQ ID NO:1至少90%相同的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包括与SEQ ID NO:1至少95%相同的核酸序列。在一些实施方案中，启动子包括SEQID NO:1的核酸序列。
[0100]在一些实施方案中，载体可包括ー个或多个内含子以促进RNA转录本在哺乳动物宿主细胞中的加工。此内含子的非限制性示例是兔(6-珠蛋白内含子。在一些实施方案中，内含子是合成的内含子。例如，合成的内含子可包括与SEQ ID N0:8具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。内含子在载体中的位置可以不同。在一些实施方案中，内含子位于启动子和限制性酶切位点之间。在一些实施方案中，内含子位于启动子内。在一些实施方案中，内含子包括UCB增强子。UCB增强子可包括与SEQ ID N0:4具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
[0101] 在一些实施方案中，将启动子与编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸可操作地连接。在一些实施方案中，将启动子与编码感兴趣的抗体的重链和/或轻链(诸如抗体的重和轻可变区)的多核苷酸可操作地连接。在一些实施方案中，将启动子与编码感兴趣的抗体的重链和轻链的多核苷酸可操作地连接以允许重链和轻链基因的多顺反子表达。在ー些实施方案中，2A序列或IRES元件位于载体中重链可变区的编码区和轻链可变区的编码区之间以促进每ー个亚基的等效表达。可选地，可将编码重链和轻链的多核苷酸每一个在合适的病毒载体中分别引入靶细胞。
[0102]启动子的大小可不同。由于AAV的有限的包装能力，优选使用大小是小的、但是同时允许感兴趣的蛋白在宿主细胞中高水平生产的启动子。例如，在一些实施方案中启动子是至多约1.5kb、至多约1.4kb、至多约1.35kb、至多约1.3kb、至多约1.25kb、至多约
1.2kb、至多约1.15kb、至多约1.lkb、至多约1.05kb、至多约lkb、至多约800碱基对、至多约600碱基对、至多约400碱基对、至多约200碱基对或至多约100碱基对。
[0103]启动子的核苷酸序列还可被修饰用于改善表达效率。例如，启动子可包括ー个或多个剪接供体、ー个或多个剪接受体、和/或其组合。在一些实施方案中，启动子包括剪接供体和剪接受体。在一些实施方案中，启动子包括一个或多个剪接供体且不包含剪接受体。在一些实施方案中，启动子不包括剪接供体，且包括一个或多个剪接受体。例如，在ー些实施方案中，剪接供体可包括与SEQ ID NO: 5具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，剪接受体可包括与SEQ ID NO: 6具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。
[0104]调节元件
[0105]可将多种转录后调节元件用于病毒载体中，例如以增加感兴趣的蛋白在宿主细胞中的表达水平。在一些实施方案中，转录后调节元件可以是病毒转录后调节元件。病毒转录后调节元件的非限制性示例包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、こ型肝炎病毒转录后调节元件(HBVPRE)、RNA转运元件(RTE)、和其任何变体。WPRE可包括与SEQ ID NO: 7具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。RTE可以是rev应答元件(RRE)，例如，慢病毒RRE。非限制性的示例是牛免疫缺陷病毒rev应答元件(RRE )。在一些实施方案中，RTE是组成型转运元件(CTE )。CTE的示例包括，但不限于梅森-普菲策尔猴病毒(Mason-Pfizer Monkey Virus)CTE和鸟类白血病病毒(Avian Leukemia Virus) CTE0
[0106]本文描述的病毒载体可包括原核复制子(即，具有在原核宿主细胞中的指导重组DNA分子染色体外的自主复制和維持的能力的DNA序列)，诸如用其转化的细菌宿主细胞。此类复制子是本领域众所周知的。另外，包括原核复制子的载体还可包括其表达给予可检测的标记诸如药物抗性的基因。典型的细菌药物抗性基因是给予对氨苄青霉素或四环素抗性的基因。
[0107]在一些实施方案中，AAV载体可包括用于真核细胞中有效的选择标记的基因，诸如药物抗性选择标记。这种选择标记基因可编码对于生长在选择培养基中的被转化的宿主细胞的存活或生长必要的因子。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞将不会在培养基中存活。典型的选择基因编码给予对抗生素或其他毒素的抗性、补充营养缺陷型的缺陷、或供给从培养基中扣留的关键营养元素的蛋白，所述抗生素或其他毒素例如，氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤、卡那霉素、庆大霉素、Zeocin、或四环素。
[0108]本文公开的病毒载体可包括多种调节元件，诸如转录起始区和/或转录终止区。转录终止区的示例包括，但不限干，聚腺苷酸化信号序列。聚腺苷酸化信号序列的示例包括，但不限于，牛生长激素(BGH)poly (A)、SV40晚期poly (A)、兔P -珠蛋白(RBG)poly (A)、胸苷激酶(TK)poly(A)序列、和其任何变体。在一些实施方案中，转录后终止区位于转录后调节元件的下游。在一些实施方案中，转录后終止区是聚腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，转录后终止区是SV40晩期poly(A)序列。
[0109]本文公开的病毒载体还可包括直接在启动子下游的限制性酶切位点之后的ー个或多个A核苷酸，其中限制性酶切位点允许编码感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入。例如，一个或多个A核苷酸在编码感兴趣的蛋白的多核苷酸插入载体后，直接位于感兴趣的蛋白的TAA终止密码子之后。在一些实施方案中，ー个A核苷酸、两个A核苷酸、三个A核苷酸、或多个直接位于限制性酶切位点之后。在一些实施方案中，ー个A核苷酸、两个A核苷酸、三个A核苷酸、或多个直接位于感兴趣的蛋白的TAA终止密码子之后。
[0110]在一些实施方案中，病毒载体可包括使得载体适于在真核生物中复制和整合的另外的序列。在其他实施方案中，本文公开的病毒载体可包括使得载体适于在原核生物和真核生物中复制和整合的穿梭元件。在一些实施方案中，病毒载体可包括另外的转录和翻译起始序列，诸如启动子和增强子 ；和另外的转录和翻译终止子，诸如聚腺苷酸化信号。
[0111]在一些实施方案中，病毒载体可包括允许，例如，从单个mRNA翻译多个蛋白的调节序列。此类调节序列的非限制性示例包括内部核糖体进入位点(IRES)和2A自加工序列。在一些实施方案中，2A序列是来自ロ蹄疫病毒的2A肽位点(F2A序列)。在一些实施方案中，F2A序列具有标准的弗林蛋白酶裂解位点。例如，具有标准的弗林蛋白酶裂解位点的F2A序列可包括与SEQ ID NO:9具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，F2A序列具有被修饰的弗林蛋白酶裂解位点。例如，具有被修饰的弗林蛋白酶裂解位点的F2A序列可包括与SEQ ID NO: 10具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
[0112]在一些实施方案中，病毒载体还可具有位于靠近启动子序列的一个或多个限制性酶切位点以提供编码ー个或多个感兴趣的蛋白和其他蛋白的核酸序列的插入。
[0113]感兴趣的蛋白
[0114]如本文所用的，“感兴趣的蛋白”可以是任何蛋白，包括天然存在的和非天然存在的蛋白。在一些实施方案中，可将编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸插入本文公开的病毒载体中，其中多核苷酸与启动子可操作地连接。在某些情况下，启动子可驱动感兴趣的蛋白在宿主细胞(例如，人肌细胞)中表达。
[0115]感兴趣的蛋白的示例包括，但不限于，荧光素酶；荧光蛋白(例如，GFP);生长激素(GH)和其变体；胰岛素样生长因子(IGF)和其变体；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其变体；红细胞生成素(EPO)和其变体；胰岛素，诸如胰岛素原、前胰岛素原、胰岛素、胰岛素类似物、和类似的；抗体和其变体，诸如杂交抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单克隆抗体；抗体的抗原结合片段(Fab片段)、抗体的单链可变片段(scFV片段)；抗肌萎縮蛋白和其变体；凝血因子和其变体；囊性纤维化跨膜传导调节子(cystic fibrosis transmembraneconductance regulator, CFTR)和其变体；和干扰素及其变体。
[0116]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是治疗蛋白或其变体。治疗蛋白的非限制性示例包括血液因子，诸如3 -珠蛋白、血红蛋白、组织型纤溶酶原激活因子、和凝血因子(coagulation factor);集落刺激因子(CSF);白介素，诸如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等；生长因子，诸如角质形成细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、纤维母细胞生长因子(FGF，诸如碱性FGF和酸性FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、生长分化因子-9(⑶F-9)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、肌肉生长抑制素(⑶F-8)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、血小板源生长因子(PDGF)、血小板生成素(TP0)、转化生长因子a (TGF_a)、转化生长因子P (TGF-0 )、和类似的；可溶性受体，诸如可溶性TNF-a受体、可溶性VEGF受体、可溶性白介素受体(例如，可溶性IL-1受体和可溶性II型IL-1受体)、可溶性Y / S T细胞受体、可溶性受体的配体结合片段，和类似的；酶，诸如a-葡萄糖苷酶、伊米苷酶、卩-葡糖脑苷脂酶、和阿糖脑苷酶；酶激活因子，诸如组织型纤溶酶原激活因子；趋化因子，诸如IP-10、y 干扰素诱导的单核因子(Mig)、Groa/IL-8、RANTES、MIP-1 a、MIP-1 P , MCP-UPF-4、和类似的；血管生成剂，诸如血管内皮生长因子(VEGF，例如，VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2)、转化生长因子-P、碱性成纤维细胞生长因子、胶质瘤源性生长因子、血管生成素、血管生成素-2 ;和类似的；抗血管生成剂，诸如可溶性VEGF受体；蛋白疫苗；ネ申经活性肽，诸如神经生长因子`(NGF)、缓激肽、缩胆囊素、胃泌素、促胰液素、催产素、促性腺激素释放激素、(6-内啡肽、脑啡肽、P物质、生长抑素、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、华法林、神经降压肽、胃动素、促甲状腺素、神经肽Y、黄体生成素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、血管升压素、血管紧张素I1、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽、和类似的；血栓溶解剂；心房钠尿肽；松弛素；胶质原纤维酸性蛋白；卵泡刺激素(FSH);人a-1抗胰蛋白酶；白血病抑制因子(LIF);转化生长因子(TGF);组织因子、黄体生成素；巨噬细胞活化因子；肿瘤坏死因子(TNF);嗜中性白细胞趋化因子(NCF);神经生长因子；组织金属蛋白酶抑制剂；血管活性肠肽；血管生成素；血管趋向肽(angiotoopin);血纤蛋白；蛭素；IL-1受体拮抗剂；和类似的。感兴趣的蛋白的一些其他非限制性示例包括睫状神经营养因子(CNTF);脑源性神经营养因子(BDNF);神经营养因子3和4/5(NT_3和4/5);胶质细胞源性神经营养因子(GDNF);芳香氨基酸脱羧酶(AADC);血友病相关的凝血蛋白，诸如因子珊、因子IX、因子X ;抗肌萎縮蛋白或nin1-抗肌萎縮蛋白；溶酶体酸性脂肪酶；苯丙氨酸羟化酶(PAH);糖原贮积病相关酶，诸如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶(例如PHKA2)、葡萄糖转运蛋白(例如，GLUT2)、醛缩酶A、(6-烯醇酶、和糖原合成酶；溶酶体酶类(例如，P-N-こ酰氨基己糖苷酶A);和其任何变体。
[0117]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是蛋白的活性片段，所述蛋白诸如任何上述的蛋白。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是包括两种或多种蛋白的ー些或全部的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白可包括任何上述蛋白的全部或部分。
[0118]在一些实施方案中，病毒载体包括多核苷酸，所述多核苷酸包括两种或多种感兴趣的蛋白的编码区。两种或多种感兴趣的蛋白可以是彼此相同的或不同的。在一些实施方案中，两种或多种感兴趣的蛋白是相关肽，例如用于相同病毒的中和抗体。
[0119]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白是多亚基蛋白。例如，感兴趣的蛋白可包括两个或多个亚基、或两个或多个独立的多肽链。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白可以是抗体。抗体的示例包括，但不限于，多种同种型的抗体(例如，IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgEjP IgM);通过由本领域技术人员已知的任何方式产生的单克隆抗体，包括单克隆抗体的抗原结合片段；人源化抗体；嵌合抗体；单链抗体；抗体片段诸如Fv、F(ab’)2、Fab’、Fab、Facb、scFv和类似的；只要抗体能够结合抗原。在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白不是免疫粘附素。
[0120]在一些实施方案中，抗体是抗-疟疾抗体。抗-疟疾的非限制性示例包括2A10抗-疟疾抗体和2C11抗-疟疾抗体。
[0121]在一些实施方案中，抗体是病毒的中和抗体。例如,抗体可以是HIV、HCV或流感病毒的中和抗体。在一些实施方案中，抗体是中和抗-HIV抗体。在一些实施方案中，中和抗-HIV抗体可以是，例如，中和HIV-1的不同基因亚型的许多原代分离株的人单克隆中和抗体。
[0122]在一些实施方案中，抗体是中和杭-HCV抗体。
[0123]在一些实施方案中， 抗体是中和杭-流感抗体。中和病毒抗体的非限制性示例包括 bl2 抗-HIV 抗体、2G12 抗-HIV 抗体、4E10 抗-HIV 抗体、2F5 抗-HIV 抗体、VRCOl 抗-HIV抗体、3BNC60 抗-HIV 抗体、3BNC117 抗-HIV 抗体、NIH45-46 抗-HIV 抗体、NIH45-46W 抗-HIV抗体、VRC-PG04 抗-HIV 抗体、VRC-CH31 抗-HIV 抗体、PGT121 抗-HIV 抗体、PGT128 抗-HIV抗体、FlO抗-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、TCN32流感抗体、FI6抗-流感抗体、FI6v3抗-流感抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。
[0124]如本文描述的，编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列可被修饰以改善蛋白的表达效率。能够被用于改善本文的基因的转录和/或翻译的方法不具体限制。例如，核苷酸序列可被修饰以更好反映宿主密码子使用以提高宿主(例如，哺乳动物)中的基因表达(例如，蛋白生产)。作为修饰的另外的非限制示例，感兴趣的蛋白的核苷酸序列中的一个或多个剪接供体和/或剪接受体被修饰以減少外来剪接的可能性。
[0125]感兴趣的蛋白可以是不同的长度。例如，感兴趣的蛋白的长度可以是至少约200个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸、或更长。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白长度是至少约480个氨基酸。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白长度是至少约500个氨基酸。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白长度是约750个氨基酸。[0126]当要求在ー个病毒载体中包括两种或多种感兴趣的蛋白、两个或多个单独的多肽链、或感兴趣的蛋白的两个或多个亚基的编码区时，第一个以外的每ー个另外的编码区优选连接至促进蛋白在宿主细胞中共表达的元件，诸如内部核糖体进入序列(IRES)元件(美国专利号4，937，190)、或2A元件。例如，IRES或2A元件优选当单个载体包括编码多亚基蛋白的每ー个亚基的序列时被使用。在感兴趣的蛋白是具有所需的特异性的免疫球蛋白的情况下，例如，第一编码区(编码免疫球蛋白的重链或轻链)位于启动子的下游。第二编码区(编码免疫球蛋白的剩余链)可位于第一编码区的下游，并可将IRES或2A元件放置在两个编码区之间，优选直接在第二编码区之前。IRES或2A元件被包含在第一和第二基因的序列(分别编码重链和轻链)之间能够允许两个链在细胞中以约相同的水平从相同的启动子被表达。
[0127]在一些实施方案中，感兴趣的蛋白包括两个或多个亚基，例如免疫球蛋白(Ig)。病毒载体可包括每ー个亚基的编码区。例如，病毒载体可包括Ig重链(或Ig重链的可变区)的编码区和Ig轻链(或Ig轻链的可变区)的编码区两者。在一些实施方案中，载体包括抗体的重链可变区的第一编码区和抗体的轻链可变区的第二编码区。两个编码区可以例如被2A自加工序列分开以允许两个编码区的多顺反子转录。
[0128]病毒载体可包括两种或多种感兴趣的蛋白的编码区。例如，病毒载体可包括第一感兴趣的蛋白的编码区和第二感兴趣的蛋白的编码区。第一感兴趣的蛋白和第二感兴趣的蛋白可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，病毒载体可包括第三或第四感兴趣的蛋白的编码区。第三和第四感兴趣的蛋白可以是相同的或不同的。由ー个病毒载体编码的两种或多种感兴趣的蛋白的总长可以不同。例如，两种或多种蛋白的总长可以是至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸、或更长。
[0129]Kozak共有序列、Kozak共有区或Kozak序列，是已知作为在真核mRNA上存在的并具有共有区(gcc) gccRccAUGG的序列，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其之后是另外的“`G”。在一些实施方案中，载体包括与Kozak共有序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包括Kozak共有序列。在一些实施方案中，载体包括在插入载体的编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸之后的Kozak共有序列，例如，在启动子下游的限制性酶切位点处。例如，载体可包括GCCGCCAie(SEQ ID N0:41)的核苷酸序列，其中ATG是感兴趣的蛋白的起始密码子。在一些实施方案中，载体包括GCGGCCGCCMS(SEQ ID NO:42)的核苷酸序列，其中ATG是感兴趣的蛋白的起始密码子。
[0130]如果有需要，可根据本领域技术人员已知的常规方法分离并纯化感兴趣的蛋白。例如，可制备表达宿主细胞的裂解物并可使用HPLC、疏水相互作用色谱(HIC)、阴离子交換色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、超滤、凝胶电泳、亲和色谱、和/或其他纯化技术纯化裂解物。
[0131]信号肽序列
[0132]本文公开的病毒载体中可使用多种信号肽序列。信号肽序列可以是天然存在的或非天然存在的。[0133]在一些实施方案中，信号肽可提供从哺乳动物细胞中分泌。信号肽的示例包括，但不限干，HGH的内源信号肽和其变体；干扰素的内源信号肽和其变体，包括1、II和III型干扰素的信号肽和其变体；和已知的细胞因子的内源信号肽和其变体，诸如红细胞生成素(EP0)、胰岛素、TGF-^ 1、TNF、ILl-a、和ILU的信号肽和其变体。在一些实施方案中，信号肽是被修饰的HGH信号肽。在一些实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列包括与SEQID NO: 11具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一‘丨生的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列包括与SEQID NO: 12具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
[0134] 在一些实施方案中，可使用与感兴趣的蛋白不同的蛋白的信号肽。在一些实施方案中，使用感兴趣的蛋白的本身的信号肽。在某些情况下，可使用非天然存在的信号肽。
[0135]典型地，载体中信号肽的核苷酸序列直接位于感兴趣的蛋白的编码区上游(例如，融合在感兴趣的蛋白的编码区的5’)。在病毒载体包含两种或多种感兴趣的蛋白的编码区的情况下，可将信号肽直接插入ー个或多个编码区的上游。在一些实施方案中，姆ー个编码区具有融合在5’末端的信号肽序列。添加至每ー个编码区的信号肽序列可以是相同的或不同的。例如，当感兴趣的蛋白具有两个亚基时，病毒载体可包括一个亚基的编码区和另ー个亚基的编码区，并可将信号肽序列直接插入任一个编码区或两个编码区的上游。作为另ー个非限制性的示例，病毒载体可包括免疫球蛋白的重链可变区的编码区和免疫球蛋白的轻链可变区的编码区，并将每一个编码区在5’末端与信号肽序列融合。在一些实施方案中，两个信号肽序列是相同的。在一些实施方案中，两个信号肽序列是不同的。
[0136]在一些实施方案中，在蛋白表达和/或分泌之后，信号肽可从前体蛋白裂解，产生成熟蛋白。
[0137]在一些实施方案中，可将病毒载体中起始于5’AAV ITR并终止于3’AAV ITR的区递送至宿主细胞并整合进入宿主细胞基因组。该区的长度可以不同。例如，该区的长度可以是至少约2kb、至少约2.25kb、至少约2.5kb、至少约2.75kb、至少约3kb、至少约3.25kb、至少约3.5kb、至少约3.75kb、至少约4kb、至少约4.25kb、或至少约4.5kb。在一些实施方案中，该区是至少约2.5kb。在一些实施方案中，该区是约4.5kb。在一些实施方案中，病毒载体不是自身互补的AAV (scAAV)载体。
[0138]如以上公开的，病毒载体可包括多种元件，例如，但不限于，启动子、编码感兴趣的蛋白的转基因、信号肽序列、转录后调节元件、转录终止元件、和允许多个蛋白从单个mRNA翻译的调节序列。技术人员将领会，病毒载体可包括这些元件的ー个，或这些元件的两个或多个的任何组合。例如，病毒载体可包括至少ー个元件或表1中列出的元件的组合。表1中使用的约定如下:
[0139]A=启动子
[0140]B=转基因
[0141]C=信号肽序列
[0142]D=转录后调节元件
[0143]E=转录终止元件
[0144]F=允许多个蛋白从单个mRNA翻译的调节序列[0145]G=Kozak共有序列
[0146]表1.病毒载体的一些实施方案中包括的元件或元件的组合
[0147]
【权利要求】
1.ー种病毒载体,包括: 腺相关病毒(AAV)的5’末端反向重复序列(ITR)和3’ AAV ITR ； 启动子； 所述启动子下游的限制性酶切位点以允许编码ー个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入，和 所述限制性酶切位点下游的转录后调节元件， 其中所述启动子、所述限制性酶切位点和所述转录后调节元件位于所述5’ AAV ITR的下游和所述3’ AAV ITR的上游。
2.根据权利要求1所述的病毒载体，还包括插入在所述限制性酶切位点并与所述启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区。
3.根据权利要求2所述的病毒载体，其中所述多核苷酸包括所述感兴趣的蛋白的所述编码区的直接上游的信号肽序列。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其中所述信号肽选自以下组成的组:干扰素的信号肽、人生长激素的信号肽、红细胞生成素(EPO)的信号肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的信号肽、胰岛素的信号肽、和其任何组合。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的病毒载体，其中所述载体包括与Kozak共有序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5 中任一项所述的病毒载体，其中所述感兴趣的蛋白选自以下组成的组:全长抗体、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF)、G-CSF、红细胞生成素(EP0)、胰岛素、抗体Fab片段、抗体scFV片段、血友病相关的凝血蛋白、抗肌萎缩蛋白、溶酶体酸性脂肪酶、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、糖原贮积病相关的酶、和其任何变体。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体，其中所述感兴趣的蛋白是病毒的中和抗体。
8.根据权利要求7所述的病毒载体，其中所述病毒的中和抗体是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流感病毒的中和抗体。
9.根据权利要求8所述的病毒载体，其中所述HIV的中和抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、和其任何变体。
10.根据权利要求8所述的病毒载体，其中所述HCV的中和抗体选自以下组成的组:AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体，其中所述感兴趣的蛋白是疟疾的中和抗体。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、鸡(6-肌动蛋白(CAG)启动子、泛素C (UBC)启动子、或其任何变体。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子包括剪接供体、剪接受体、或其任何变体。
14.根据权利要求13所述的病毒载体，其中所述剪接供体包括与SEQID N0:5具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。
15.根据权利要求13所述的病毒载体，其中所述剪接受体包括与SEQID N0:6具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子包括与SEQIDNO:1具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子包括与SEQIDNO:2-4中任一个具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的病毒载体，其中所述转录后调节元件是病毒转录后调节元件。
19.根据权利要求18所述的病毒载体，其中所述病毒转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、こ型肝炎病毒转录后调节元件(HBVPRE)、RNA转运元件(RTE)、或其任何变体。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的病毒载体，还包括所述转录后调节元件下游的转录终止区。
21.根据权利要求20所述的病毒载体，所述转录終止区包括SV40晩期poly(A)序列、兔(6-珠蛋白Poly(A)序列、牛生长激素poly(A)序列、或其任何变体。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的病毒载体，其中所述启动子包括内含子。
23.根据权利要求22所述的病毒载体，其中所述内含子是包括与SEQID N0:8具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的合成内含子。
24.根据权利要求2所述的病毒载体，其中所述多核苷酸包括免疫球蛋白的重链可变区的第一编码区和所述免疫球蛋白的轻链可变区的第二编码区。`
25.根据权利要求24所述的病毒载体，其中所述第一编码区和所述第二编码区被2A序列分开。
26.根据权利要求25所述的病毒载体，其中所述2A序列是F2A序列。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的病毒载体，其中将所述第一编码区的5’与第一信号肽序列融合并将所述第二编码区的5’与第二信号肽序列融合。
28.根据权利要求27所述的病毒载体，其中所述第一信号肽序列和所述第二信号肽序列是不同的。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的病毒载体，其中起始于所述5’ITR并终止于所述3’ ITR的区是至少约2.5kb。
30.一种用于体内生产感兴趣的蛋白的方法，包括: 提供包括编码所述感兴趣的蛋白的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV);和 将所述重组AAV施用至所述受试对象，据此所述重组AAV在所述受试对象中表达所述抗体，其中所述核苷酸是至少约1.4kb。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白是抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗体是全长抗体。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、抗-疟疾抗体、和其任何变体。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白在所述受试对象的血清中以至少约9 u g/ml的量表达。
35.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白在所述受试对象的血清中以至少约IOOii g/ml的量表达。
36. 根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白在所述受试对象的血清中以至少约500 ii g/ml的量表达。
37.根据权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述重组AAV通过以下步骤产生: 提供具有病毒载体、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAV cap基因的包装细胞系，其中所述病毒载体包括5’ AAV末端反向重复序列(ITR)、3’ AAV ITR和编码所述感兴趣的蛋白的核苷酸序列；和 从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述病毒载体是权利要求2-29中任一项所述的病毒载体。
39.一种用于减少或抑制受试对象中病毒感染风险的方法，包括: 提供包括编码所述病毒的中和抗体的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV);和将所述重组AAV施用至所述受试对象，据此所述重组AAV在所述受试对象中表达所述抗体。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述方法还包括提供包括编码所述病毒的第二中和抗体的核苷酸序列的第二重组AAV。
41.根据权利要求39-40中任一项所述的方法，其中所述受试对象是哺乳动物。
42.根据权利要求39-40中任一项所述的方法，其中所述受试对象是人。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述中和抗体是全长抗体。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的方法，其中与没有用所述病毒载体处理的所述受试对象相比，所述方法減少所述受试对象中的感染风险至少约5倍。
45.根据权利要求44所述的方法，其中与没有用所述病毒载体处理的所述受试对象相比，所述方法減少所述受试对象中的感染风险至少约20倍。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其中所述方法抑制所述受试对象中的病毒感染。
47.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述抗体在所述受试对象的血清中以至少约9 u g/ml的量表达。
48.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述抗体在所述受试对象的血清中以至少约IOOii g/ml的量表达。
49.根据权利要求39-46中任一项所述的方法，其中所述抗体在所述受试对象的血清中以至少约500 u g/ml的量表达。
50.根据权利要求39-49中任一项所述的方法，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
51.根据权利要求39-49中任一项所述的方法，其中所述中和抗体选自以下组成的组:bl2抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。
52.根据权利要求39-51中任一项所述的方法，其中通过肌内注射、阴道内注射、静脉注射、腹腔内注射、皮下注射、表皮给药、皮内给药、或鼻腔给药将所述重组AAV施用至所述受试对象。
53.根据权利要求39-52中任一项所述的方法，其中至多毎年一次将所述重组AAV施用至所述受试对象。
54.根据权利要求53所述的方法，其中至多每5年一次将所述重组AAV施用至所述受试对象。
55.根据权利要求53所述的方法，其中至多每10年一次将所述重组AAV施用至所述受试对象。
56.—种生产重组腺相关病毒(AAV)的方法,包括: 提供具有包括5’ AAV末端反向重复序列(ITR)和3’ AAV ITR、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAV cap基因的病毒构建体的包装细胞系；和 从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述AAVcap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9的衣壳、或其变体。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述病毒构建体是权利要求1-29中任一项所述的病毒载体。
59.根据权利要求56-57中任一项所述的方法，其中所述重组AAV不是自身互补AAV(scAAV)o
60.一种分离的、合成的或 重组的多核苷酸，包括: 与SEQ ID NO:1具有至少约90%或更多的序列同一性的核酸序列。
61.根据权利要求60所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括选自SEQID N0:2-4的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/11GK103492574SQ201280019807
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年2月21日 优先权日:2011年2月22日
【发明者】亚历杭德罗·本杰明·巴拉兹, 大卫·巴尔的摩 申请人:加州理工学院