使用胚胎干细胞衍生的微囊泡制备诱导多能性干细胞的方法

使用胚胎干细胞衍生的微囊泡制备诱导多能性干细胞的方法
【专利摘要】本发明提供一种使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞去分化的方法。具体而言，本发明提供一种制备诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。根据本发明的制备诱导多能性干细胞的方法，使用胚胎干细胞衍生的微囊泡可使体细胞的去分化有效进行而无副作用，并且，预见到本发明的方法在研发具有个体免疫相容性的细胞疗法产品方面非常有用。
【专利说明】使用胚胎干细胞衍生的微囊泡制备诱导多能性干细胞的方
法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞去分化来制备诱导多能性干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]去分化是成熟体细胞恢复为较年轻的干细胞的过程并且去分化涉及体内再生，这种体内再生在昆虫体内、两栖动物体内、植物体内发生。所述去分化不会自然地发生在诸如人之类的哺乳动物体内，只是通过人工方法在诸如人之类的哺乳动物体内发生。细胞去分化的方法以使用细胞融合的方法为开端。本领域中发现的使体细胞去分化的第一种方法是使用如下特征的方法:当胚胎干细胞(ESC)与体细胞融合时胚胎干细胞成为占主导地位的细胞。此后，通过将体细胞与除了 ESC之外的具有类似于ESC的能力的干细胞融合使在诱导体细胞去分化方面的研究取得了长足发展，所述具有类似于ESC的能力的干细胞例如，胚胎生殖细胞(EGC)或胚胎癌细胞(ECC)。
[0003]然而，进行细胞融合的细胞会随机分裂或维持在融合状态而不进行分裂。发生分裂的细胞(杂合体)具有一个细胞核，而没有发生分裂的细胞(异核体)具有两个不同细胞的细胞核。由于这个原因，大多数细胞成为癌细胞，只有一些细胞具有正常功能。
[0004]此外，检查细胞融合(细胞、细胞质)的方法具有以下不足之处:许多细胞由于使用聚乙二醇(PEG)诱导融合而死亡，聚乙二醇可损伤细胞以帮助大尺寸的细胞进行融合。为了解决这个问题，仅使细胞的一部分而非全部胚胎干细胞去分化的常规研究取得了进展。一项研究工作通过从细胞中仅分离细胞质而在融合过程中排除细胞核。用化学物质(链球菌溶血素)处理体细胞以使细胞膜具有渗透性并嵌入从胚胎干细胞衍生的细胞质的方法得到使用。然而，截止2010年，在使用细胞质去分化的情况下，还没有成功的去分化实例产生与胚胎干细胞类似的性质。
[0005]此外，本领域还存在特异性因子的递送系统。2006年，日本东京大学的Yamanaka研究组发现了可仅通过胚胎干细胞中的四个基因进行去分化。将这四个基因(0ct-4、klf4、Sox2和c-Myc)引入小鼠皮肤细胞，从而制备诱导多能性干细胞(iPS)。这项研究开创了合成细胞的一部分用于嵌入而不是融合整个细胞这一概念。iPS技术采用了一种通过在起始阶段利用病毒的能力将基因嵌入基因组并强制表达RNA生产蛋白质的方法。然而，由于病毒的特性，基因被整合在若干位点，从而形成不理想的修饰。目前，为了解决这个问题，使用mRNA递送方法或者递送蛋白质本身的方法。然而，本领域技术人员发现mRNA易于降解并且合成过程有难度，会诱导RNA的免疫反应，而且仅递送蛋白质无法实现完全去分化。
[0006]因此，本领域亟需研发一种可克服上述问题的制备去分化的多能性干细胞的方法。

【发明内容】
[0007]【技术问题】
[0008]为了解决现有技术中的问题，本发明的发明人进行研究发现，体细胞的去分化可通过使用胚胎干细胞衍生的微囊泡而有效且稳定地进行。
[0009]因此，本发明意在提供一种使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞有效地进行去分化而不产生副作用来制备诱导多能性干细胞的方法，并且本发明还提供通过上述方法制备的诱导多能性干细胞。
[0010]然而，技术问题不限于上面描述的那些，本领域普通技术人员根据下面的描述会清楚地理解本文没有描述的其他技术问题。
[0011]【技术方案】
[0012]本发明一方面提供一种制备诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括使用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。
[0013]本发明另一方面提供通过如下方法制备的诱导多能性干细胞，所述方法包括使用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。
[0014]本发明的再一方面提供一种包含诱导多能性干细胞的细胞疗法产品。
[0015]【有益效果】
[0016]根据本发明可知，使用融合微囊泡递送细胞质的方法不需要使用在细胞融合过程中所需的聚乙二醇(PEG)或不需要使用注入细胞质时所用的诸如链球菌溶血素之类的细胞毒性物质，因此，对细胞的损伤较小。此外，在递送细胞质的过程中，微囊泡具有较高的递送效率，并且更有效地保护递送的内容物，因此能够特异性地递送细胞质。根据细胞质递送方面的常规研究可知，细胞质的递送效率随着细胞核内待表达的蛋白质的量的减少而减少，因此，无法进行完全去分化。 然而，基于本发明的制备方法，本发明的微囊泡可自由地控制细胞质的浓度并且防止融合过程中细胞内物质的损失，这样，使用细胞质使体细胞去分化的效率可增加。
[0017]此外，根据使用本发明的微囊泡的方法可知，靶向诱导体内去分化的目标是可能的。具体而言，因为在患者的受损器官中产生的信号是主要靶向因子，所以，可预见到的是，体外去分化会成为能够在体内进行的新的去分化方式。
【专利附图】

【附图说明】
[0018]图1表示通过挤压制备的胚胎干细胞衍生的微囊泡的透射电子显微镜(TEM)图像。
[0019]图2为表示通过挤压制备的胚胎干细胞衍生的微囊泡的尺寸的图。
[0020]图3为表示胚胎干细胞特异性蛋白质(即，0ct3/4)存在于胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的微囊泡中的图。
[0021]图4为表示胚胎干细胞特异性基因(即，0ct3/4和Nanog)存在于胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的微囊泡中的图。
[0022]图5表示在使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)去分化之后产生的细胞集落。
[0023]图6表示在使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)去分化并随时间进行增殖之后产生的细胞集落。[0024]图7表示在使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使GFP转染的小鼠成纤维细胞(NIH3T3-GFP细胞)去分化之后产生的细胞集落。
[0025]图8为表示胚胎干细胞特异性基因(即，0ct3/4和Nanog)在去分化的小鼠成纤维细胞(NIH3T3去分化的细胞)中表达的图。[0026]图9表示去分化的小鼠成纤维细胞(NIH3T3去分化的细胞)具有分化能力。
[0027]图10为表示分化特异性基因(即，AFP、Foxfl和β -1II微管蛋白)在去分化的小鼠成纤维细胞(ΝΙΗ3Τ3去分化的细胞)分化时表达的图。
[0028]图11表示在通过胚胎干细胞衍生的微囊泡与布雷菲德菌素A (BFA)联合处理使小鼠成纤维细胞(ΝΙΗ3Τ3细胞)去分化之后产生的细胞集落。
【具体实施方式】
[0029]本发明提供一种制备诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括使用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞，从而使体细胞去分化。
[0030]本发明使用的胚胎干细胞可来源于人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛，但是本发明不限于此。
[0031]本文使用的“微囊泡”被脂质双层分为内侧和外侧，所述脂质双层由衍生的细胞的细胞膜成分构成，所述微囊泡包括所述细胞的细胞膜脂质、细胞膜蛋白质、核酸和细胞成分，并且所述微囊泡的尺寸比原始细胞的尺寸小，但是本发明不限于此。
[0032]本发明的微囊泡可通过如下方法由包含胚胎干细胞的悬浮液制备，所述方法选自:挤压、超声处理、细胞溶解、同质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械降解以及用化学物质处理，但是本发明不限于此。
[0033]在本发明的一种实施方式中，微囊泡的膜还可包含不同于胚胎干细胞的细胞膜的成分。
[0034]不同于细胞膜的成分可包括靶向分子、细胞膜与靶细胞融合所必需的物质(融合剂)、环糊精、PEG，等等。此外，不同于细胞膜的成分可通过各种不同的方法添加，所述方法包括细胞膜的化学修饰。
[0035]例如，微囊泡的膜成分可通过使用巯基(-SH)或氨基(-NH2)的化学方法或通过将PEG化学连接至微囊泡被化学修饰。
[0036]本发明可进一步包括在制备本发明的微囊泡的过程中对微囊泡的膜成分进行化学修饰。
[0037]此外，本发明的胚胎干细胞包括转化的细胞。具体而言，所述转化的细胞包括被转化为表达细胞膜与特定蛋白质、靶分子或靶细胞融合所必需的物质的细胞，并且所述转化的细胞还包括由至少两种转化的细胞组合构成的转化的细胞，但本发明并不限于此。
[0038]胚胎干细胞可通过物质的处理或转导被转化，并且所述胚胎干细胞可被转化至少两次。
[0039]在本发明的另一实施方式中，胚胎干细胞可被转化为抑制至少一种特定蛋白质的表达。
[0040]在本发明的又一实施方式中，胚胎干细胞可被转化为表达选自细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白以及它们的融合蛋白中的至少一种。[0041]在本发明的又一实施方式中，胚胎干细胞可被转化为过表达胚胎干细胞特异性蛋白质，即，0ct3/4、Nanog或者Sox_2蛋白质。
[0042]在本发明的又一实施方式中，本发明的组合物还可包括不同于胚胎干细胞衍生的微囊泡的成分。
[0043]例如，包含胚胎干细胞衍生的微囊泡和刺激体细胞去分化的物质的组合物可用于处理体细胞。额外的物质包括布雷菲德菌素A (BFA)、BiP诱导物X (BIX)和丙戊酸(VPA)。
[0044]下文中提供示例性的实例以帮助理解本发明。然而，本发明提供的下列实例可能更加易于理解本发明，但是本发明的范围不限于实施例。
[0045]实施例1.胚胎干细胞衍生的微囊泡的制备
[0046]以5X IO6个细胞/ml的浓度将小鼠胚胎干细胞重悬于3ml磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中。使重悬液流过孔径为IOym的膜过滤器10次，流过孔径为5μπι的膜过滤器10次。将lml50%0ptiPr印?、lml5%0ptiPr印"和3ml流过膜过滤器的细胞悬浮液放置于5ml超速离心管中。随后，在100，OOOXg的条件下进行超速离心处理持续2小时。在50%0ptiPi^p?和5%0ptiPrep?之间的层中获得微囊泡。
[0047]实施例2.胚胎干细胞衍生的微囊泡的性质分析
[0048]将根据实施例1所述的方法由胚胎干细胞制备的微囊泡吸附在辉光放电碳包被的铜网上持续3分钟。用蒸馏水洗涤所述网并且用2%乙酸铀酰染色I分钟，使用透射电子显微镜JEMlOl (Jeol，Japan)观察到的结果如图1所示。
[0049]如图1的TEM图像所示 ，可以看到通过挤压由胚胎干细胞制备的微囊泡由脂质双层构成，并且通常形成尺寸为IOOnm至200nm的球形。
[0050]将实施例1所述的由胚胎干细胞制备的微囊泡稀释于Iml PBS中，使其浓度达到5ug/mL.将含有微囊泡的Iml PBS放置于比色皿中并使用动态光散射粒度分析仪进行分析，结果如图2所示。
[0051]图2所示的结果证实了微囊泡的尺寸为50nm至IOOnm,平均尺寸为70nm。
[0052]根据实施例1所述的方法由胚胎干细胞制备50 μ g微囊泡，并制备10 μ g胚胎干细胞的全细胞裂解物，加入5X上样染料(250mM Tris-HCl, 10%SDS, 0.5%溴酚蓝，50%甘油)，使上样染料的终浓度为IX上样染料，在100°C下处理得到的溶液5分钟。制备8%聚丙烯酰胺凝胶，随后上样。在80V的条件下对样品进行电泳分离持续2小时，并在400mA的条件下将蛋白质转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜持续2小时。将脱脂牛奶溶于PBS中，使浓度达到3%，并在该溶液中封闭所述膜2小时。在4°C条件下用0ct3/4和β-肌动蛋白的抗体处理所述膜12小时。用PBS洗涤得到的膜两次，在室温下再用连接有过氧化物酶的二抗处理所述膜I小时。得到的膜用PBS洗涤30分钟并使用增强化学发光(ECL; Amersham C0.N0.RPN2106)底物进行鉴定，结果如图3所示。
[0053]图3所示的结果证实了由胚胎干细胞制备的微囊泡中存在胚胎干细胞特异性蛋白质，即0ct3/4。
[0054]使用RNeasy'kMini试剂盒(QIAGEN, Cat.N0.74104),从根据实施例1所述的方
法由胚胎干细胞制备的微囊泡和胚胎干细胞中提取总基因(RNA)。使用特异性基因引物和PCR试剂盒(BIOLAB，Cat.N0.E5000)从提取的RNA中获得多种cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并且使用溴化乙锭(ETBR)染色进行鉴定。为了保证使用相同量的RNA作为阳性对照(胚胎干细胞)，还一同鉴定了管家基因(甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH))。使用5’ -AGACCATGTTTCTGAAGTGC-3’作为胚胎干细胞特异性基因(即，Oct-3/4)的正义引物，使用5’ -GAACCATACTCGAACCACA-3’作为胚胎干细胞特异性基因(即，Oct-3/4)的反义引物。使用5’ -CTAGTTCTGAGGAAGCATCG-3’作为另一胚胎干细胞特异性基因(即，Nanog)的正义引物，使用5’ -TCTCAGTAGCAGACCCTTG-3’作为该胚胎干细胞特异性基因(即，Nanog)的反义引物。图4所示的基因表达图像用于胚胎干细胞衍生的微囊泡的性质分析。
[0055]图4所示的结果证实了胚胎干细胞特异性基因(B卩，0ct3/4和Nanog)在胚胎干细胞制备的微囊泡中表达。
[0056]实施例3.使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使体细胞去分化
[0057]用0.1%的明胶包被6孔平板并在该平板上接种8 X IO4个NIH3T3细胞，孵育细胞24小时。随后，用PBS洗涤每个孔，将2ml根据实施例1所述的方法由胚胎干细胞制备的微囊泡稀释于成纤维细胞培养基(DMEM，10%FBS, 100U/ml青霉素-链霉素)中，使其浓度达到100 μ g/ml,随后用其处理孵育的NIH3T3细胞。48小时后，识别出每孔大约2个细胞集落至3个细胞集落，并且每个细胞集落的尺寸为约10 μ m至100 μ m。使用电子显微镜观察细胞集落，结果如图5所示。
[0058]图5所示的结果证实了使用胚胎干细胞衍生的微囊泡使NIH3T3细胞去分化，从而诱导细胞集落。用PBS洗涤每个孔，并加入400 μ 10.1XTE (胰蛋白酶-EDTA)。I分钟后，使用移液器将10μ IlXTE加至细胞集落中，并将移液器的尖端置于细胞集落周围进行抽吸。将取出的细胞集落稀释于500 μ I胚胎干细胞培养基(knock-out DMEM，15%knock_outFBS, 10ng/ml LIF，0.lmM2-巯基乙醇，4mM L-谷氨酰胺，10 μ g/ml 庆大霉素，100U/ml 青霉素-链霉素)中，接种于0.1%明胶包`被的24孔平板中，并孵育5天或更长时间。
[0059]在细胞生长至80%汇合或更高程度汇合时，使用I X TE将全部体细胞稀释于2ml胚胎干细胞培养基中，并且在0.1%明胶包被的6孔平板中传代培养。通过上述相同的方法，在细胞生长至80%汇合时，将细胞稀释于8ml培养基中，在0.1%明胶包被的IOOmm培养皿中传代培养，并且每两天至三天重复一次传代培养。
[0060]如图6所示，通过5天或更长时间的观察结果证实了细胞集落连续增殖。
[0061]实施例4.诱导多能性干细胞的来源的确定
[0062]使用逆转录病毒(pMSCV)，将GFP基因注入NIH3T3细胞的基因组。转化的细胞表现出绿色荧光，但是形成微囊泡的胚胎干细胞未显示出荧光。6孔平板包被有0.1%的明胶并且接种有8 X IO4个NIH3T3GFP细胞，孵育细胞24小时。随后，用PBS洗涤每个孔，将实施例1中制备的胚胎干细胞衍生的微囊泡稀释于2ml成纤维细胞培养基(DMEM，10%FBS,100U/ml青霉素-链霉素)中，使其浓度达到100μ g/ml，并将其用于处理NIH3T3GFP细胞。48小时后，识别出每孔约2个细胞集落至3个细胞集落，并且细胞集落的尺寸为约10 μ m至100 μ m，通过电子显微镜观察到的结果如图7所示。
[0063]根据常规研究可知，去分化需要经历一段很长的时间段，例如至少7天至30天，但是，如图6和图7所示，在使用本发明的胚胎干细胞衍生的微囊泡的情况下，仅仅在48小时内就形成细胞集落，因此去分化的时间可显著缩短。
[0064]实施例5.诱导多能性干细胞的性质确认
[0065]通过洗涤剂相容性蛋白分析(DC)对根据实施例3所述的方法增殖了 40天的细胞集落(NIH3T3衍生的去分化细胞)、胚胎干细胞和NIH3T3细胞的全细胞裂解物进行定量分析，分别制备50 μ g的根据实施例3所述的方法增殖了 40天的细胞集落(NIH3T3衍生的去分化细胞)、50μ g胚胎干细胞和50μ g [!1313细胞的全细胞裂解物，并加入5\上样染料，使上样染料的终浓度为I X上样染料，并在100°C下处理5分钟。制备8%的聚丙烯酰胺凝胶，并上样。在80V条件下使样品进行电泳分离持续2小时，在400mA条件下将蛋白质转移至PVDF膜持续2小时。根据待施加的抗体使用不同的封闭缓冲液封闭膜。在使用肌动蛋白抗体的情况下，将脱脂牛奶溶于PBS中，使脱脂牛奶的浓度为3%，在使用Oct3/4抗体的情况下，将脱脂奶粉溶于PBS中，使其浓度为5%，在使用Nanog抗体的情况下，将10%脱脂奶粉溶于PBS中，使其浓度为10%，并且在该溶液中封闭膜2小时。在4°C条件下使用0ct3/4、Nanog和β-肌动蛋白的抗体处理所述膜12小时，用PBS洗涤膜两次，在室温下用连接有过氧化物酶的二抗处理所述膜I小时。用PBS洗涤得到的膜30分钟，使用ECL底物进行鉴另IJ，结果如图8所示。
[0066]图8所示的结果证实了胚胎干细胞特异性蛋白质(即，0ct3/4和Nanog)在通过胚胎干细胞衍生的微囊泡去分化的NIH3T3去分化细胞(诱导多能性干细胞)中表达。
[0067]实施例6.诱导多能性干细胞的自发分化的确认
[0068]本发明对通过实施例3所述的方法增殖了 40天的诱导多能性细胞自发分化为所有细胞的能力进行了确认，从而鉴定通过实施例3所述的方法增殖了 40天的诱导多能性细胞的功能。当胚胎干细胞成为胚体时，胚体具有自发分化为所有细胞的能力。通过相同的原理，通过悬滴法诱导的细胞被诱导进行强制性聚集。使用胰蛋白酶将集落细胞悬浮并稀释于分化培养基(IMDM, 20%FBS, 4mM L-谷氨酰胺，10 μ g/ml庆大霉素，100U/ml青霉素-链霉素)中，使其浓度达到3.3 X 104/ml。将30μ1 (IX IO3)各稀释溶液施加于细菌培养皿的上表面，并且诱导聚集持续2天。用分化培养基洗涤聚集在细菌培养皿上表面的细胞以在细胞培养皿中重悬细胞，并孵育2天。图8为在细菌培养皿中悬浮的聚集的诱导多能性干细胞的图像。通过相同 的方法，通过悬滴法诱导聚集ΝΙΗ3Τ3细胞和胚胎干细胞。
[0069]将胚体稀释于分化培养基中，达到3/ml的汇合度，随后将2ml稀释的胚体注入
0.1%明胶包被的6孔平板的每个孔中进行孵育。转移新鲜培养溶液两次，即，每隔8天转移一次，孵育持续16天。图9显示诱导分化后的细胞。
[0070]使用RNeasy_?Mini试剂盒(QIAGEN，Cat.N0.74104)从分化的细胞中提取总基因(RNA)。使用特异性基因引物和PCR试剂盒(BIOLAB, Cat.N0.E5000)从提取的RNA中获取多种cDNA，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并通过ETBR染色进行识别。为了保证使用相同量的RNA作为阳性对照(胚胎干细胞)，还一同鉴定了管家基因(肌动蛋白)。诱导多能性干细胞的自发分化的结果证实了细胞被分化为NIH3T3去分化细胞的内胚层(AFP)、中胚层(Foxfl)和外胚层(b-1II 微管蛋白)。对于 AFP 而言，5’ -AACTCTGGCGATGGGTGTT-3’用作正义引物，5’ -AAACTGGAAGGGTGGGACA-3’用作反义引物。对于Foxfl而言，5’ -CGTGTGTGATGTGAGGTGAG-3’ 用作正义引物，5’ -CTCCGTGGCTGGTTTCA-3’ 用作反义引物。对于b-1II微管蛋白而言，5’ -TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG-3，用作正义引物，5’-GGCCCTGGGCACATACTTGTG-3’用作反义引物。图10显示用于检查基因是否表达的图像，从而证实NIH3T3去分化细胞(诱导多能性干细胞)的自发分化能力。
[0071]图10所示的图像证实了内胚层、中胚层和外胚层基因在NIH3T3去分化细胞中表达，这说明NIH3T3去分化细胞具有自发分化能力。
[0072]实施例7.同时使用胚胎干细胞衍生的微囊泡和BFA进行处理使体细胞去分化
[0073]用0.1%明胶包被6孔平板，并将8 X IO4个NIH3T3细胞接种于每个孔并孵育24小时。在用PBS洗涤孔之后，将实施例1中制备的胚胎干细胞衍生的微囊泡稀释于2ml成纤维细胞培养基(DMEM，10%FBS, 100U/ml青霉素-链霉素)中，使其浓度达到100 μ g/ml，并将BFA稀释于2ml成纤维细胞培养基(DMEM，10%FBS, 100U/ml青霉素-链霉素)中，使其浓度达到2 μ Μ，随后用得到的各产物处理孵育的ΝΙΗ3Τ3细胞。48小时后，识别出每孔2个细胞集落至3个细胞集落，并且细胞集落的尺寸为约10 μ m至100 μ m。通过电子显微镜观察到的结果如图11所示。
[0074]图11所示的结果证实了可诱导细胞集落产生，甚至当同时使用胚胎干细胞衍生的微囊泡与BFA进行处理时，也会诱导细胞集落产生。
[0075]用PBS洗涤每个孔，并加入400 μ 10.1 X TE(胰蛋白酶-EDTA)。I分钟后，使用移液器将10μ IlXTE加至细胞集落中，并将移液器尖端置于细胞集落的周围进行抽吸。将取出的细胞集落稀释于500 μ I胚胎干细胞培养基(knock-out DMEM, 15%knock_out FBS, IOng/ml LIF，0.lmM2-巯基乙醇，4mM L-谷氨酰胺，10 μ g/ml庆大霉素，lOOU/ml青霉素-链霉素)中，接种于0.1%明胶包被的24孔平板，并孵育5天或更长的时间。
[0076]如图11所示，证实了细胞集落连续增殖。
[0077]虽然通过本发明的一些示例性的实施方式对本发明进行了说明和描述，但是，本领域技术人员会理解的是，在不背离所附的权利要求界定的本发明的实质和范围的条件下，可对本发明作出各种形式上 的改变并在细节上对本发明作出改变。
[0078]【工业实用性】
[0079]因为根据本发明的制备诱导多能性干细胞的方法使用了利用微囊泡融合递送细胞质的方法，所以，可以预见到的是，体细胞的去分化可有效进行而没有副作用，并且本发明的方法可有效地用于研发对个体具有不同免疫相容性的细胞疗法产品。
【权利要求】
1.一种制备诱导多能性干细胞的方法，所述方法包括: 用包含胚胎干细胞衍生的微囊泡的组合物处理体细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述胚胎干细胞来源于选自人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛中的一种。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述胚胎干细胞为转化的细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述胚胎干细胞为被转化为过表达作为胚胎干细胞特异性蛋白质的Oct3/4, Nanog或Sox_2蛋白质的细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述胚胎干细胞为被转化为表达选自细胞粘附分子、抗体、靶向蛋白、细胞膜融合蛋白以及它们的融合蛋白中的至少一种的细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述微囊泡的膜还包括不同于胚胎干细胞的细胞膜的成分。
7.如权利要求6所述的方法，其中，不同于细胞膜的成分为环糊精或聚乙二醇。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述微囊泡的膜成分被化学修饰。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述组合物还包括不同于胚胎干细胞衍生的微囊泡的成分。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述不同于胚胎干细胞衍生的微囊泡的成分为布雷菲尔德菌素A (BFA)，BiP诱导物X (BIX)或丙戊酸(VPA)。
11.一种根据权利要求1至10任一项所述的方法制备的诱导多能性干细胞。
12.—种细胞疗法产品，所述细胞疗法产品包含权利要求11所述的诱导多能性干细胞。
【文档编号】C12N5/0735GK103492554SQ201280020868
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2012年4月19日 优先权日:2011年4月28日
【发明者】郑多英, 金俊镐, 朴宰成, 李南雨, 高用柗, 金润根, 张寿哲, 崔银廷 申请人:浦项工科大学校产学协力团