胃肠胰神经内分泌肿瘤(gep-nen)的预测的制作方法
【专利摘要】本申请描述涉及胃肠胰神经内分泌瘤(GEP-NEN)的生物标志物及其检测所用试剂、系统和试剂盒，以及相关GEP-NEN诊断、预后和预测方法及其应用，例如检测、预测、分期、谱分析、分类和监测治疗功效和其它转归的实施方式。
【专利说明】胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NEN)的预测
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年3月I日提交的美国临时申请61/448，137号的权益，其公开内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。
[0003]对通过EFS-Web提夺的序列表的引用
[0004]以下通过如在MPEP § 1730I1.B.2 (a) (C)中批准说明的USPTO (美国专利商标局)EFS-WEB服务器电子提交的序列表全部内容，通过弓丨用全文纳入本文用于所有目的。电子提交文本文件中的序列表鉴定如下:
[0005]
【权利要求】
1.一种用于胃肠胰神经内分泌瘤(GEP-NEN)诊断或预后的系统，所述系统包括:与GEP-NEN生物标志物组特异性杂交或结合的分离的多核苷酸或分离的多肽的群，其中，所述组包含多种GEP-NEN生物标志物，包括选自下组的基因产物:AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、C0MMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEOl、M0RF4L2、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF4 URSFU RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC、ZZZ3、APLP2、CD59、ARAF1、BRAFU KRAS和RAFl基因产物。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包括选自下组的基因产物:AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、C0MMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO 1、M0RF4L2、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSFl、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SSTl、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMTl 12、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC和ZZZ3基因产物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包括以下生物标志物中的至少三种:APLP2、ARAFU BRAF, CD59、CTGF, FZD7、Ki67、KRAS、NAPlLU PNMA2, RAFU TPHU VMATl 和 VMAT2 基因产物。
4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包含至少3种、至少11种、至少13种、至少20种、至少21种、至少29种、至少37种、至少51种或至少75种生物标志物。
5.如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包含至少51种生物标志物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包括:AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、C0MMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LE01、M0RF4L2、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST`l、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMTl 12、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC和ZZZ3基因产物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包括:APLP2、ARAF1、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、NAPIL1、PNMA2、RAF1、TPHl、VMATI 和VMAT2基因产物。
8.如权利要求1-7中任一项所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包括:AKAP8L、APLP2、ARAFl、ATP6V1H、BNIP3L、BRAF, C21orf7、CD59、C0MMD9、CTGF, ENPP4、FAM13A、FU10357、FZD7、GLT8D1、HDAC9、HSF2、Ki67、KRAS、LE01、M0RF4L2、NAPlLl、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKDl、PLD3、PNMA2、PQBPl、RAFl、RNF4URSFU RTN2、SMARCD3、SPATA7、SSTl、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TPHl、TRMTl 12、VMATl、VMAT2、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC和ZZZ3基因产物。
9.如权利要求1-8中任一项所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包括:APLP2基因产物、CD59基因产物、ARAFl基因产物、BRAFl基因产物、KRAS基因产物或RAFl基因产物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的系统，其特征在于: 所述 GEP-NEN 生物标志物组包括:APLP2、ARAFU BRAF, CD59、CTGF, FZD7、Ki67、KRAS、NAPlLl、PNMA2、RAFl、TPHl 和 VMAT2 基因产物；或所述 GEP-NEN 生物标志物组包括:APLP2、ARAFU BRAFU CD59、KRAS、RAFU CXCL14、 GRIA2、H0XC6、NKX2-3、0R51E1、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCKl、X2BTB48、CgA、CTGF, FZD7、 K1-67、Kissl、MAGE-D2、MTAl、NAPlLl、NRP2、Tphl、VMATl、VMAT2 和生存素基因产物。
11.如权利要求ι-?ο中任一项所述的系统，其特征在于:所述GEP-NEN生物标志物组还包括选自下组的基因产物:MAGE-D2、MTA1、生存素、 KissUH0XC6、NRP2、X2BTB48、CXCL14、GRIA2、NKX2-3、0R5IE1、CTGF、PTPRN2、SPOCKI和 SCG5基因产物。
12.—种用于GEP-NEN诊断或预后的系统，所述系统包括:与GEP-NEN生物标志物组特异性杂交或结合的分离的多核苷酸或分离的多肽的群，所述组包含至少21种GEP-NEN生物标志物,其中,所述系统能够分类或检测人血样品中的GEP-NEN。
13.如权利要求12所述的系统，其特征在于，所述组包含至少51种GEP-NEN生物标志物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统能够以至少80%的特异度和敏感度鉴定人血样品中的GEP-NEN。
15.如权利要求1-14中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统能区分患有GEP-NEN 的对象和患有另一种胃肠(GI)癌的对象，或者能够区分患有小肠NEN的对象和患有胰腺 NEN的对象。
16.如权利要求1-15中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统能以至少90%的准确度预测对手术介入或抑生长素类似物治疗的治疗反应，或测定患者在手术介入或抑生长素类似物治疗后是否变得临床稳定，或对手术介入或抑生长素类似物治疗有反应或无反应。
17.如权利要求1-16中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统能以至少85%的敏感度和特异度区分经治疗的GEP-NEN和未经治疗的GEP-NEN。
18.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统能测定先前诊断患有GEP-NEN的对象是否完全缓解。
19.如权利要求13-18中任一项所述的系统,其特征在于,所述系统相较于循环CgA水平检测能够以更高敏感度、特异度或准确度鉴定、区分或预测。
20.如权利要求1-19中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统还包含与管家基因产物特异性结合的分离的多核苷酸或多肽。
21.如权利要求20所述的系统，其特征在于，所述管家基因产物选自下组:ACTB、T0X4、 TPTl和TXNIP基因产物。
22.如权利要求20或21所述的系统`，其特征在于，所述管家基因产物选自下组:18S、 GAPDH、ALG9、SLC25A3、VAPA、TXNIP、ADD3、DAZAP2、ACTGl、ACTB, ACTG4B、ARFl、HUffEU M0RF4L1RH0A、SERP1、SKP1、TPT1、T0X4、TFCP2 和 ZNF410 基因产物。
23.如权利要求22所述的系统，其特征在于，所述管家基因产物选自下组:18S、GAPDH、 ALG9、SLC25A3、VAPA、TXNIP、ADD3、DAZAP2、ACTG1、ACTB、ACTG4B、ARF1、HUffE1、M0RF4LIRHOA、 SERPU SKPU TPTl 和 T0X4 基因产物。
24.如权利要求1-23中任一项所述的系统，其特征在于，所述GEP-NEN生物标志物组包含具有与选自下组的序列有至少90%相同性的核苷酸序列的基因产物:SEQ ID NO: 1-29、.105、201、204-213、215、217-225、227-229、232-240 和 243-246。
25.如权利要求1-24中任一项所述的系统，其特征在于，所述系统区分GEP-NEN亚型，并且所述生物标志物组包含生物标志物群,其中， (i)所述生物标志物群在原发性TONEC和原发性WDNET中的表达谱有显著差异，并且所述群包含CXCL14和MAGE-D2基因产物； (ii)所述生物标志物群在原发性I3DNEC和原发性WDNEC中的表达谱有显著差异，并且所述群包含三种生物标志物，包括PTPRN2基因产物； (iii)所述生物标志物群在原发性I3DNEC和原发性TONET中的表达谱有显著差异，并且所述群包含MTAl和PNMA2基因产物； (iv)所述生物标志物群在原发性I3DNET和原发性WDNET中或者在原发性I3DNET和原发性WDNEC中的表达谱有显著差异，并且所述群包含至少4种生物标志物； (v)所述生物标志物群在原发性WDNEC和原发性WDNET中的表达谱有显著差异，并且所述群包含21种生物标志物； (vi)所述生物标志物群在转移性WDNEC和转移性WDNET中的表达谱有显著差异，并且所述群包含至少3种生物标志物，包括CXCL14基因产物； (vii)所述生物标志物群在转移性I3DNEC和转移性WDNEC中的表达谱有显著差异，并且所述群包含至少4种生物标志物，包括NAPlLl基因产物；或者 (viii)所述生物标志物群在转移性I3DNEC和转移性WDNET中的表达谱有显著差异，并且所述群包含至少6种生物标志物，包括NRP2基因产物。
26.一种用于检测、诊断、分类或预测胃肠胰神经内分泌瘤(GEP-NEN)、GEP-NEN细胞或相关病症的转归的方法，所述方法包括: (a)获得生物测试样品；和 (b)检测含至少两种GEP-NEN生物标志物的组的存在、缺失、表达水平或表达谱，其中，所述组包括选自下组的基因产物:AKAP8L、ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、C0MMD9、ENPP4、FAM13A、FLJIO 3 5 7、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEO1、M0RF4L2、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SSTl、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMTl 12、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC、ZZZ3、APLP2、CD59、ARAF1、BRAF1、KRAS 和 RAFl 基因产物。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述组包括选自下组的基因产物:AKAP8L、ATP6VlH、BNIP3L、C21orf7、C0MMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8Dl、HDAC9、HSF2、LE01、M0RF4L2、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF41、RSF1、RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMT112、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC和ZZZ3基因产物。
28.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述组包括:APLP2、ARAFl、BRAF,CD59、CTGF, FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAFl、TPH1、VMATl 和 VMAT2 基因产物。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述组包含至少3种、至少.11种、至少13种、至少20种、至少21种、至少29种、至少37种、至少51种或至少75种生物标志物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述组包含至少51种生物标志物。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述组包括:AKAP8L、 ATP6V1H、BNIP3L、C21orf7、COMMD9、ENPP4、FAM13A、FLJ10357、GLT8D1、HDAC9、HSF2、LEOl、 M0RF4L2、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、PHF21A、PKD1、PLD3、PQBP1、RNF4 URSFU RTN2、SMARCD3、 SPATA7、SSTl、SST3、SST4、SST5、TECPR2、TRMTl 12、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC 和 ZZZ3 基因产物。
32.如权利要求26-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述组包括:APLP2、ARAFl、 BRAF, CD59、CTGF, FZD7、Ki67、KRAS、NAP1L1、PNMA2、RAFl、TPH1、VMATl 和 VMAT2 基因产物。
33.如权利要求26-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述组包括:AKAP8L、APLP2、 ARAFl、ATP6V1H、BNIP3L、BRAF, C21orf7、CD59、C0MMD9、CTGF, ENPP4、FAM13A、FLJ10357、 FZD7、GLT8D1、HDAC9、HSF2、K i 6 7、KRAS、LEO 1、M0RF4L2、NAP IL1、N0L3、NUDT3、0AZ2、PANK2、 PHF21A、PKD1、PLD3、PNMA2、PQBP URAFU RNF4 URSFU RTN2、SMARCD3、SPATA7、SST1、SST3、 SST4、SST5、TECPR2、TPHl、TRMTl 12、VMAT1、VMAT2、VPS13C、WDFY3、ZFHX3、ZXDC 和 ZZZ3 基因产物。
34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述组包含APLP2基因产物、 CD59基因产物、ARAFl基因产物、BRAFl基因产物、KRAS基因产物或RAFl基因产物。
35.如权利要求26-34中任一项所述的方法，其特征在于:所述多种 GEP-NEN 生物标志物包括:APLP2、ARAFl、BRAF、CD59、CTGF、FZD7、Ki67、KRAS、 NAPlLl、PNMA2、RAFl、TPHl 和 VMAT2 基因产物；或所述 GEP-NEN 生物标志物组包括:APLP2、ARAFU BRAFU CD59、KRAS、RAFU CXCL14、 GRIA2、H0XC6、NKX2-3、0R51E1、PNMA2、PTPRN2、SCG5、SPOCKU X2BTB48、CgA、CTGF, FZD7、 K1-67、Kissl、MAGE-D2、MTAl、NAPlLl、NRP2、Tphl、VMATl、VMAT2 和生存素基因产物。
36.如权利要求26-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述生物测试样品是血液、 血浆、血清、组织、唾液、血清、尿液或精液样品。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述生物测试样品来自血液。
38.如权利要求26-37中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(b)中的检测使用权利要求1-25中任一项所述的系统进行。
39.如权利要求26-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试样品取自GEP-NEN 患者。
40.如权利要求26-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述测试生物样品中检测的所述生物标志物的表达水平或表达谱与正常或参照表达水平或者正常或参照表达谱比较。
41.如权利要求40所述的方法，其特`征在于，所述方法还包括在所述比较之前，获得正常或参照样品；和检测所述正常样品中所述GEP-NEN生物标志物组的存在、缺失、表达水平或表达谱，由此确定在所述比较中使用的所述正常或参照表达水平或表达谱。
42.如权利要求26-41中任一项所述的方法，其特征在于:步骤(b)中的所述检测包括使所述测试样品接触特异性结合所述GEP-NEN生物标志物组的多核苷酸群。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸群包含DNA、RNA、cDNA、PNA、 基因组DNA或合成的寡核苷酸。
44.如权利要求42或43所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸包含正义和反义引物，并且步骤(b)中的所述检测通过以下方式进行:(i)通过逆转录从所述测试样品生成cDNA ；(ii)使用正义和反义引物对扩增所生成的cDNA，所述引物对与所述GEP-NEN生物标志物组特异性杂交；和(iii)检测所述扩增产物。
45.如权利要求26-44中任一项所述的方法,其特征在于,所述存在、缺失、表达水平或表达谱指示所述GEP-NEN的存在、缺失、分类、预后、风险、治疗反应性、侵袭性、严重性或转移，或者GEP-NEN对象是否经治疗或未经治疗,是否完全缓解,或临床稳定,或者指示GEP-NEN治疗的功效。
46.如权利要求26-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法以至少80%的特异度或敏感度分类或检测人血液样品中的GEP-NEN。
47.如权利要求26-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法区分患有GEP-NEN的对象和患有其它类型胃肠(GI)癌的对象，或区分患有小肠NEN的对象和患有胰腺NEN的对象。
48.如权利要求26-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法以至少90%的准确度预测对手术介入或抑生长素类似物治疗的治疗反应，或确定患者是否在手术介入或抑生长素类似物治疗后临床稳定，或对手术介入或抑生长素类似物治疗有反应或无反应。
49.如权利要求26-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法以至少85%的敏感度和特异度区分经治疗的GEP-NEN和未经治疗的GEP-NEN。
50.如权利要求26-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法测定诊断患有GEP-NEN的对象是否完全缓解。
51.如权利要求26-50中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试样品是血液样品，并且所述方法检测至少或至少约3个GEP-NEN细胞/毫升(mL)全血。
52.如权利要求26-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括计算所述测试生物样品中所述GEP-NEN生物标志物组的平均表达水平。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述计算通过向量加和所测多种GEP-NEN生物标志物各自的表达水平来进行。
54.如权利要求41所述的方法，其特征在于: 所述测试生物样品来自治疗后的GEP-NEN患者，并且所述参照样品来自治疗前的相同GEP-NEN 患者； 所述参照样品来自不含GEP-NEN细胞的组织或液体； 所述参照样品来自健康个体； 所述参照样品来自GEP-NEN以外的癌； 所述参照样品来自EC细胞或SI组织； 所述测试生物样品来自转移性GEP-NEN，并且所述参照样品来自非转移性GEP-NEN ;或者 所述参照样品来自与提供所述测试生物样品的GEP-NEN患者相比分类不同的GEP-NEN。
55.如权利要求26-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法以80%-100%的预测值、敏感度或特异度鉴定GEP-NEN的存在或缺失、分类或分期。
56.如权利要求26-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括压缩来自所述测试生物样品的所测表达水平，从而确定表达谱。
57.如权利要求26-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述测试生物样品是来自 GEP-NEN患者的全血或唾液样品，并且，对所述测试生物样品检测或测定的GEP-NEN生物标志物表达水平或表达谱与对同一患者提供的GEP-NEN组织样品或经纯化GEP-NEN细胞样品检测或测定的相同GEP-NEN生物标志物表达水平或表达谱相关联，所述关联的R2为至少约 0.4。
58.如权利要求26-57中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使用预测算法分析数据。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述预测算法选自下组:支持向量机 (SVM)、线性判别分析(LDA)、K-最近邻(KNN)和朴素贝叶斯(NB)。
60.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述预测算法选自下组:决策树、SVM、RDA 和感知器。
61.一种用于检测血液中神经内分泌肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括: 获得血液样品；并且使所述血液样品接触特异性结合GEP-NEN生物标志物组的一种或多种试剂，所述GEP-NEN生物标志物组包含至少两种GEP-NEN生物标志物，其中，所述方法检测至少或至少约一个、两个或三个GEP-NEN细胞/mL血液。
62.如权利要求61所述的方法,其特征在于,所述试剂包含权利要求1-25中任一项所述的系统。
63.一种用于从细胞混合物中富集或分离神经内分泌肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括:使所述细胞混合物接触特异性结合CD164的试剂；并且纯化由该试剂结合的细胞。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述接触还包括使所述细胞接触另一试剂，所述另一试剂为GEP-NEN特异性试剂。
65.如权利要求63或64所述的方法，其特征在于，所述细胞混合物是细胞培养物或血液样品或其它生物液体。
66.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法富集或分离至少或至少约3个细胞/mL血液。
67.一种治疗方法，所述方法包括:(a)对GEP-NEN患者提供治疗；(b)从所述GEP-NEN患者获得样品，并检测该样品中GEP-NEN生物标志物组的表达水平。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括在提供治疗之前测定患者样品中GEP-NEN生物标志物组的治疗前表达水平。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(c):比较所述治疗前表达水平和步骤(b)中检测的表达水平。
70.如权利要求69所述的方法，其`特征在于，所述方法还包括测定治疗前表达水平和步骤(b)中的表达水平间的表达水平差异，该差异指示所述治疗的功效。
71.如权利要求67-70中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在后续时间测定所述GEP-NEN患者内所述生物标志物的表达水平，并将该表达水平与步骤(b)中的表达水平作比较，其中，所述表达水平之间的差异指示复发或缺乏治疗反应。
72.如权利要求67-71中任一项所述的方法，其特征在于，所述表达水平使用权利要求1-25中任一项所述的系统检测。
73.如权利要求67-72中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的患者样品中CgA的表达水平相较于治疗前CgA表达水平或稍后时间的CgA表达水平无显著差异。
74.如权利要求67-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括中断或改进向所述患者提供的所述治疗。
75.如权利要求67-74中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测指示所述患者中GEP-NEN微转移的存在。
76.如权利要求75所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的样品、所述治疗前的样品或所述在后续时间获取的 样品通过组织学或单独CgA检测确定为无GEP-NEN、GEP-NEN转移或GEP-NEN复发。
【文档编号】C12Q1/68GK103502473SQ201280021361
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年3月1日 优先权日:2011年3月1日
【发明者】I·M·莫德林 申请人:耶鲁大学