编码胞嘧啶脱氨酶的双向选择标记物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种编码胞嘧啶脱氨酶的双向选择标记物，以及使用该标记物的方法。
【专利说明】编码胞嘧啶脱氨酶的双向选择标记物
[0001]对序列表的引用
[0002]本申请含有计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用的方式并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及编码胞嘧啶脱氨酶的双向选择标记物以及使用该标记物的方法。
【背景技术】
[0004]在分子生物学中对于新的工具有着持续的需求，即便是简单的工具例如新的选择标记物即处于需要中，特别是适合用于丝状真菌宿主细胞的双向标记物。
[0005]胞嘧啶脱氨酶(EC 3.5.4.1)催化胞嘧啶和5_氟胞嘧啶(5FC)的脱氨，以分别形成尿嘧啶和有毒的5-氟尿嘧啶(5FU)。当遗传修饰的包含胞嘧啶脱氨酶的细胞与5FC混合时，5FC转化为毒性5FU，因此编码胞嘧啶脱氨酶的基因是潜在的且有效的阴性选择标记物。
[0006]已经显示出，嘧啶的从头合成通路中的抑制剂可以用来创建一种条件，其中细胞依赖于嘧啶补充物经由胞嘧啶脱氨酶到尿嘧啶的转化。因此，在阳性选择培养基中，仅有表达胞嘧啶脱氨酶基因的细胞 可以获救(Wei and Huber, 1996, J Biol Chem271 (7):3812)。
【发明内容】
[0007]在第一个方面，本发明提供一种分离的编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的多核苷酸，该多肽选自:
[0008](a)与SEQ ID NO: 60的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一1丨生的多肽；
[0009](b)由在中等严格条件、中高度严格条件、高度严格条件或极高度严格条件下与(i)SEQ ID N0:59的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全长互补物进行杂交的多核苷酸所编码的多肽；
[0010](C)由与SEQ ID NO:59的多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多核苷酸所编码的多肽；
[0011](d)SEQ ID NO:60的多肽在一个或多个位置处包含替换、缺失和/或插入的变体；以及
[0012](e)具有胞嘧啶脱氨酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)多肽的片段。
[0013]在第二个方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，包含与一个或多个控制序列可操作地连接的第一个方面的多核苷酸，其中该控制序列在表达宿主细胞中介导胞嘧啶脱氨酶多肽的产生。
[0014]本发明的第三个方面是使用第一个方面的多核苷酸作为阴性选择标记物的方法，包括以下步骤:
[0015](a)提供包含一个或多个第一个方面的编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的宿主细胞；
[0016](b)用整合性核酸构建体转化宿主细胞，其中该构建体在位点特异性地整合到宿主基因组中时，使至少一个编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸失活，从而与步骤(a)的宿主细胞相比，所得的宿主细胞产生较少的胞嘧啶脱氨酶或不产生胞嘧啶脱氨酶；
[0017](C)在包含足量5-氟胞嘧啶的选择性介质中培养所转化的宿主细胞，其中5-氟胞嘧啶经由胞嘧啶脱氨酶转化成抑制性浓度的毒性5-氟尿嘧啶；以及
[0018](d)选择能够在选择性介质中生长并具有降低的或不可测出的胞嘧啶脱氨酶活性的所得宿主细胞。
[0019]在第四个方面，本发明涉及一种使用第一个方面的多核苷酸或第二个方面的核酸构建体或表达载体作为阳性选择标记物的方法，包括以下步骤:
[0020](a)提供不具有可测出的胞嘧啶脱氨酶活性的宿主细胞；
[0021](b)用包含至少一个可表达的第一个方面的编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的核酸构建体来转化宿主细胞；
[0022](C)在有益于胞嘧啶脱氨酶的表达的条件下，在包含嘧啶从头合成抑制剂以及肌苷和胞嘧啶的介质中，培养所转化的宿主细胞；以及
[0023](d)选择生长中的包含至少一个编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的宿主细胞。
[0024]本发明的一个方面涉`及一种制备亲本宿主细胞的突变体的方法，包括使第一个方面的多核苷酸失活，得到生产出比亲本细胞少的所编码胞嘧啶脱氨酶多肽的突变体。
[0025]本发明的另一方面涉及一种重组宿主细胞，其包含至少一个染色体整合的第一个方面的多核苷酸，该多核苷酸与一个或多个介导所编码的胞B密唳脱氨酶的产生的控制序列可操作地连接。
[0026]本发明的最后一个方面涉及在第一方面中定义的多核苷酸或者在第二方面中定义的核酸构建体或载体作为微生物转化过程中的选择标记物的用途，其中将目标多核苷酸转化到合适的微生物宿主细胞中，然后微生物宿主细胞在阳性或阴性选择压力的条件下培养，来选择该选择标记物的存在或不存在。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1示出以pyrG作为双向选择标记物而示例的实验中的FRT/FLP系统的基本方案。
[0028]图2 示出 pHUda981 的质粒图谱(Pgpd、HSVltk, TtrpC 如 W007045248 中所述)。
[0029]图3示出pHUdal019的质粒图谱。
[0030]图4示出pHUdalOOO的质粒图谱。
[0031]图5示出将pHUdalOOO正确引入NN059183中之后的示意性NAl (上)和酸稳定性淀粉酶基因座(下)。
[0032]图6示出pHUda801的质粒图谱。
[0033]图7示出pHUdal043的质粒图谱。
[0034]图8示出pHUdal078的质粒图谱。[0035]图9示出pHUdal067的质粒图谱。
[0036]图10示出NN059208中的示意性NAl基因座(上)、NA2基因座(中)和酸稳定性淀粉酶基因座(下)。
[0037]图11示出pRikal47的质粒图谱。
[0038]图12示出将pRikal47正确整合到NN059208之后的示意性NAl (上)、NA2 (中)和酸稳定性淀粉酶基因座(下)。
【具体实施方式】
[0039]定义
[0040]胞嘧啶脱氨酶:胞嘧啶脱氨酶(EC3.5.4.1)催化胞嘧啶和5_氟胞嘧啶(5FC)的脱氨，以分别形成尿嘧啶和有毒的5-氟尿嘧啶(5FU)。当遗传上修饰的包含胞嘧啶脱氨酶的细胞与5FC混合时，5FC转化为有毒5FU，从而编码胞嘧啶脱氨酶的基因潜在地为有效的阴性选择标记物。
[0041]已经显示出，嘧啶的从头合成通路中的抑制剂可以用来创建一种条件，其中细胞依赖于经由胞嘧啶脱氨酶的嘧啶补充物到尿嘧啶的转化。因此，在阳性选择培养基中，仅有表达胞嘧啶脱氨酶基因的细胞能够在包含嘧啶从头合成抑制剂以及肌苷和胞嘧啶的阳性选择介质中获救(参见Wei and Huber, 1996, J Biol Chem271 (7):3812中的图1)。抑制剂优选为N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)，其抑制天冬氨酸氨甲酰转移酶。
[0042]如果必要，胞嘧啶脱氨酶活性可以通过遗传检定进行定量(Frederico L.A.等人，1990,Biochemistry29:2532-2537)。
[0043]等位基因变体:术语 “等位基因变体”是指占据相同染色体基因座的基因的任意两种或更多种可替代形式。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以引起种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有变化)，或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体所编码的多肽。
[0044]催化结构域:术语“催化结构域”是指包含酶的催化体系的酶区域。
[0045]cDNA:术语“cDNA”是指可以从得自真核细胞或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子通过逆转录而制备出的DNA分子。cDNA缺少存在于相应基因组DNA中的内含子序列。在呈现为成熟的已剪接的mRNA之前，最初的初级RNA转录本是通过一系列步骤包括剪接进行加工的mRNA的前体。
[0046]编码序列:术语“编码序列”是指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，通常起始于例如ATG、GTG或TTG的起始密码子，并结束于例如TAA、TAG或TGA的终止密码子。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组
八
口 ο
[0047]控制序列:术语“控制序列”是指编码本发明成熟多肽的多核苷酸进行表达所必需的核酸序列。各个控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是内源的(即来自相同基因)或外源的(即来自不同基因)，或彼此是内源的或外源的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列、多腺苷酸序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低的程度，控制序列包含启动子以及转录和翻译终止信号。为引入能促进控制序列与编码多肽的多核苷酸编码区进行连接的特异性酶切位点，控制序列可以设有接头。[0048]表达:术语“表达”包括任何参与多肽产生中的步骤，包括，但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0049]表达载体:术语“表达载体”是指包含编码多肽的多核苷酸并与为其表达而提供的控制序列可操作地连接的线性或环状DNA分子。
[0050]片段:术语“片段”是指成熟多肽或结构域的氨基端和/或羧基端缺失一个或多个(例如数个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中片段具有胞嘧啶脱氨酶活性。
[0051]宿主细胞:术语“宿主细胞”是指任何对转化、转染和转导等敏感并具有包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何子代。 [0052]分离的或纯化的:术语“分离的”或“纯化的”是指从与其天然相关的至少一种成分中移除的多肽或多核苷酸。例如，多肽可以为至少1%纯，例如，至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯或至少95%纯，如SDS-PAGE所测定的，并且多核苷酸可以为至少1%纯，例如，至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90%纯或至少95%纯，如琼脂糖电泳所测定的。
[0053]核酸构建体:术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因中分离出，或者以自然界不存在的方式修饰成含有核酸片段，或者是合成的，包含一个或多个控制序列。
[0054]可操作地连接:术语“可操作地连接”是指一种结构，其中，相对于多核苷酸的编码序列，控制序列位于适当的位置处，使得控制序列可以介导编码序列的表达。
[0055]序列同一性:两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite (欧洲分子生物学开放软件包)，Rice 等人，2000，Trends Genet.16:276-277)(优选5.0.0或更新版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453),来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)替换矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项得到的)被用作百分比同一性并计算如下:
[0056](相同残基X100) / (比对长度-比对中的空位总数)。
[0057]出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (欧洲分子生物学开放软件包)，Rice等人，2000,同上)(优选5.0.0或更新版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch, 1970，同上)，来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EDNAFULUNCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项得到的)被用作百分比同一性并计算如下:
[0058](相同的脱氧核糖核苷酸X100) / (比对长度-比对中的空位总数)。
[0059]子序列:术语“子序列”是指有一个或多个(例如数个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺失的多核苷酸；其中子序列编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的片段。
[0060]变体:术语“变体”是指在一个或多个位置处包含一个或多个(例如数个)氨基酸残基的变更，即替换、插入和/或缺失并具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽。替换是指将占据一个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失是指去除占据一个位置的氨基酸；以及插入是指紧邻占据一个位置的氨基酸来增加氨基酸。
[0061]本发明的第一个方面涉及一种分离的编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的多核苷酸，该多肽选自:
[0062](a)与SEQ ID NO: 60的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一1丨生的多肽；
[0063](b)由在中等严格条件、中高度严格条件、高度严格条件或极高度严格条件下与(i)SEQ ID N0:59的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全长互补物进行杂交的多核苷酸所编码的多肽；
[0064](c)由与SEQ ID NO: 59的多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多核苷酸所编码的多肽；
[0065](d) SEQ ID NO:60表示的多肽在一个或多个位置处包含替换、缺失和/或插入的变体；以及
[0066](e)具有胞嘧啶脱氨酶活性的(a)、(b)、(C)或(d)多肽的片段。
[0067]在一个实施方式中，本发明涉及一种分离的编码胞嘧啶脱氨酶多肽的多核苷酸，该多肽与SEQ ID NO: 60具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一方面，多肽与SEQ ID NO: 60的区别不多于十个氨基酸，例如，九个氨基酸、八个氨基酸、七个氨基酸、六个氨基酸、五个氨基酸、四个氨基酸、三个氨基酸、两个氨基酸或一个氨基酸。
[0068]本发明的所编码的胞嘧啶脱氨酶多肽优选地包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其等位基因变体，或由SEQ ID NO:60的氨基酸序列或其等位基因变体组成；或者是其具有胞嘧啶脱氨酶活性的片段。在另一方面，多肽包含SEQ ID NO:60的多肽，或由SEQ ID NO:60的多肽组成。
[0069]在另一实施方式中，本发明涉及一种分离的编码胞嘧啶脱氨酶多肽的多核苷酸，该胞嘧啶脱氨酶多肽由在非常低等严格条件、低等严格条件、中等严格条件、中高度严格条件、高度严格条件或极高度严格条件下与(i) SEQ ID N0:59的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全长互补物进行杂交的多核苷酸所编码(Sambrook等人，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, NewYork)。
[0070]SEQ ID NO:59表示的多核苷酸或其子序列，以及SEQ ID N0:60表示的多肽或其片段可以用于设计核酸探针，以根据本领域公知的方法从不同属或种的菌株中识别并克隆出对具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽进行编码的DNA。具体而言，遵循标准DNA印迹法，这些探针可以用于与目标细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以识别并分离其中的相应基因。这些探针可以显著短于整个序列，但是长度应当至少为15个核苷酸，例如，至少25个、至少35个或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如，长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针均可以使用。通常对探针进行标记，用以检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白进行标记)。这些探针均包含在本发明中。
[0071]可以对由这些其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库筛选与上述探针杂交并对具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽进行编码的DNA。来自这些其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可以转移至并固定在硝化纤维素或其他合适的载体材料上。为识别与SEQ ID NO: 59或其子序列同源的克隆或DNA，载体材料优选用在DNA印迹中。
[0072]出于本发明的目的，杂交表示，在非常低至非常高的严格条件下，多核苷酸与对应于⑴SEQ ID N0:59 ；(ii)SEQ ID NO: 59的多肽编码序列；(iii )其cDNA序列；(iv)其全长互补物；或(0其子序列的所标记核酸探针进行杂交。在这些条件下与核酸探针杂交的分子可以使用例如X光胶片进行检测。
[0073]对于长度为至少100个核苷酸的探针，非常低等严格条件定义为:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中于42°C预杂交和杂交，遵循标准DNA印迹法步骤进行12~24小时为最佳。最后，在45°C下使用2XSSC、0.2%SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟。
[0074]对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，低等严格条件定义为:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中于42°C预杂交和杂交，遵循标准DNA印迹法步骤进行12~24小时为最佳。最后，在50°C下使用2XSSC、0.2%SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟。
[0075]对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，中等严格条件定义为:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中于42°C预杂交和杂交，遵循标准DNA印迹法步骤进行12~24小时为最佳。最后，在55°C下使用2XSSC、0.2%SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟`。
[0076]对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，中高度严格条件定义为:在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中于42°C预杂交和杂交，遵循标准DNA印迹法步骤进行12~24小时为最佳。最后，在60°C下使用2XSSC、0.2%SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟。
[0077]对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，高度严格条件定义为:在5XSSPE、
0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中于42°C预杂交和杂交，遵循标准DNA印迹法步骤进行12~24小时为最佳。最后，在65°C下使用2XSSC、0.2%SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟。
[0078]对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，极高度严格条件定义为:在5XSSPE、
0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中于42°C预杂交和杂交，遵循标准DNA印迹法步骤进行12~24小时为最佳。最后，在70°C下使用2XSSC、0.2%SDS将载体材料洗涤3次，每次15分钟。
[0079]在另一实施方式中，本发明涉及一种分离的编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸，该多核苷酸与SEQ ID NO: 59的多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60%，例如，至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
[0080] 在另一实施方式中，本发明涉及一种分离的对在一个或多个(例如数个)位置处包含替换、缺失和/或插入的SEQ ID N0:60的胞嘧啶脱氨酶多肽的变体进行编码的多核苷酸。优选地，氨基酸改变极少涉及性质，即，不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替换或插入；小的缺失，通常为I~约30个氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基；至多约20~25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能而促进纯化的小的延伸，例如多组氨酸序列(polyhistidine tract)、抗原表位或结合结构域。
[0081]保守替换的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。通常不改变特定活性的氨基酸替换为本领域已知，并例如在
H.Neurath and R.L.Hill, 1979年，In, The Proteins, Academic Press, New York 中有过描述。常见的替换是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0082]或者，氨基酸变化的性质是，改变多肽的物化特性。例如，氨基酸变化可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳PH等。
[0083]多肽中的必需氨基酸可以根据本领域已知的方法进行识别，例如点诱变或丙氨酸扫描变异(Cunningham and Wells, 1989，Science244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子的各个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得的突变分子进行胞嘧啶脱氨酶活性的测试，以识别出对于分子活性重要的氨基酸残基。也请参见Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物相互作用的活性位点也可以通过结构的物理分析来确定，如通过例如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术，并结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见，例如，de Vos等人，1992，Science255:306-312 ;Smith等人，1992, J.Mol.Biol.224:899-904 ;Wlodaver 等人，1992, FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的识别也可以从与相关多肽的比对来进行推断。
[0084]使用已知的突变、重组和/或改组方法，然后通过相关的筛选步骤，例如由Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science241:53-57 ；Bowie and Sauer,1989, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W0 95/17413 ;或冊 95/22625 公开的那些，可以进行单个或多个氨基酸的替换、缺失和/或插入，并对其进行测试。其他可以使用的方法包括易错PCR、卩遼菌体展不(例如，Lowman等人，1991，Biochemistry30:10832-10837 ;美国专利第5，223，409 号；W0 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire 等人，1986，Gene46:145 ;Ner 等人，1988，DNA7:127)
[0085]诱变/改组方法可以与高通量自动筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人，1999, Nature Biotechnologyl7:893-896)。编码活性多肽的诱变DNA分子可以使用本领域标准方法从宿主细胞中回收，并快速测序。这些方法使得可以迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。[0086]在一个实施方式中，引入到SEQ ID NO:60多肽中的氨基酸替换、缺失和/或插入的数目不多于10个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个。多肽可以是一种多肽的区域融合在另一多肽区域的N-端或C-端的杂交多肽。
[0087]在最后的方面，本发明涉及一种重组宿主细胞，包含至少一个染色体整合的根据第一个方面的多核苷酸，该多核苷酸与一个或多个介导所编码的胞嘧啶脱氨酶的产生的控制序列可操作地连接。
[0088]具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的来源
[0089]本发明的对具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽进行编码的多核苷酸可以得自任何属的微生物。出于本发明的目的，本文中与指定来源结合使用的术语“得自”是指，由多核苷酸所编码的多肽由已经插入有该来源的多核苷酸的来源或菌株所产生。
[0090]胞嘧啶脱氨酶多肽可以是真菌多肽。例如，多肽可以是酵母多肽，例如假丝酵母属(Candida)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces )、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶罗威亚酵母属(Yarrowia)多肽；或者丝状真菌多肽，例如枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌(Botryospaeria)、拟錯菌属(Ceriporiopsis)、毛 _ 壳属(Chaetomidium)、金孢属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、拟鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)λ 隐球菌属(Cryptococcus)、色二抱属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、把齿菌属(Irpex)、香燕属(Lentinula)、小球腔菌属(Leptospaeria)、巨座壳属(Magnaporthe)、Melanocarpus、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛菌霉(Mucor)、毁丝菌属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)Λ 梨囊鞭菌属(Piromyces)、Poitrasia、假暗盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂糟菌属(SchizophylIum)、节格孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭抱壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚燕属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。
[0091]在另一方面，多妝是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomycesdouglasi1、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)或 Saccharomyces oviformis 多月太。
[0092]在另一方面，多肽为解纤维枝顶孢霉(Acremonium celIulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori )、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、Chrysosporium inops、 嗜毛金色抱(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、类状金抱(Chrysosporium merdarium)、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporium queenslandicum、热带金抱菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、杆抱状德抱(Fusarium bactridioides)、谷类德抱(Fusariumcereal is)、克鲁克威尔德抱菌(Fusarium crookwellense)、黄色德抱菌(Fusariumculmorum)、禾谷德刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、异抱德抱(Fusarium heterosporum)、合欢木德抱(Fusarium negundi)、尖德抱菌(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉红德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、肤色德抱(Fusarium sarcochroum)、拟枝抱德抱菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色德抱(Fusarium sulphureum)、圆德抱(Fusarium torulosum)、拟丝抱德抱(Fusarium trichothecioides)、德抱霉(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、白囊奉巴齿菌(Irpex lacteus)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糖脉胞菌(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭抱壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭抱壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimet1、小抱梭抱壳(Thielavia microspora)、卵抱梭抱壳(Thielaviaovispora) λ Thielavia peruviana、毛梭抱壳(Thielavia setosa)、瘤抱梭抱壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭抱壳(Thielavia subthermophila)、太瑞斯梭抱壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii )、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多妝。[0093]应当理解，对于前述物种，本发明包括完好和不完好的状态，以及其他的分类学等同物，例如无性型，无论它们被知晓的物种名是什么。
[0094]本领域技术人员将容易地识别出适当的等同物的身份。这些物种的菌株很容易从若干培养物保藏中公开取得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国国家菌种保藏中心(DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CBS)和农业研究服务专利保藏中心北区研究中心(NRRL)。
[0095]多肽可以使用前述探针从包括分离于自然界(例如，土壤、堆肥、水等)的微生物的其他来源处进行识别并获得。用于从天然栖息地分离微生物的技术为本领域公知。然后可以通过类似地筛选另一微生物或DNA混合样本的基因组DNA或cDNA文库，得到编码多肽的多核苷酸。一旦使用探针检测到编码多肽的多核苷酸，多核苷酸可以釆用本领域普通技术人员公知的技术来分离或克隆(参见，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
[0096]核酸构建体
[0097]在第二个方面，本发明还涉及核酸构建体或表达载体，包含与一个或多个介导胞嘧啶脱氨酶在合适表达宿主中表达的控制序列可操作地连接的第一个方面的多核苷酸。
[0098]多核苷酸可以以多种方式操作，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在插入到载体之前对多核苷酸的操作可能是所希望的或必需的。釆用重组DNA方法来修饰多核苷酸的技术为本领域公知。
[0099]控制序列可以是启动子序列，即被宿主细胞识别以用于表达本发明所编码多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂交的启动子，并且可以得自编码对宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
[0100]合适的用于介导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的启动子例子是得自构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶(W0 96/00787)、镰孢霉淀粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、镰孢霉 Daria (W0 00/56900)、镰孢霉 Quinn (W0 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉内切葡聚糖酶1、里氏木霉内切葡聚糖酶
I1、里氏木霉内切葡聚糖酶II1、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉基因的修饰启动子，其中非翻译的前导序列已经被编码磷酸丙糖异构酶的曲霉基因的非翻译前导序列所取代；非限定性例子包括编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰启动子，其中非翻译的前导序列已经被编码磷酸丙糖异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的非翻译前导序列所取代)；以及其突变的、截短的和杂交的启动子。
[0101]在酵母宿主中，可用的启动子得自酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(ΤΡΙ)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其他可用的酵母宿主细胞的启动子由Romanos等人，1992，Yeast8:423-488记载。
[0102]控制序列也可以是合适的转录终止子序列，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码多肽的多核苷酸的3’端可操作地连接。任何在所选择的宿主细胞中起作用的终止子可以用在本发明中。
[0103]优选的用于丝状真菌宿主细胞的终止子得自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
[0104]优选的用于酵母宿主细胞的终止子得自酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶的基因。其他可用于酵母宿主细胞的终止子由Romanos等人,1992,同上记载。
[0105]控制序列也可以是合适的前导序列，是对于转录时宿主细胞的翻译较为重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码多肽的多核苷酸的5’端可操作地连接。可以使用任何在所选择的宿主细胞中起作用的前导序列。
[0106]优选的用于丝状真菌宿主细胞的前导序列得自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。
[0107]合适的用于酵母宿主细胞的前导序列得自酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α -因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
[0108]控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即与多核苷酸的3’端可操作地连接并且在转录时被宿主细胞识别为在所转录的mRNA上添加多腺苷残基的信号的序列。可以使用任何在所选择的宿主细胞中起作用的多腺苷酸化序列。
[0109]优选的用于丝状真菌宿主细胞的多腺苷酸化序列得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。
[0110]可用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列由Guo and Serman, 1995, Mol.CellularBiol.15:5983-5990 记载。
[0111]控制序列也可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端连接的信号肽并介导多肽进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含与具有编码多肽的编码序列片段的翻译读框天然连接的信号肽编码序列。或者，编码序列的5’端可以含有对编码序列外源的信号肽编码序列。当编码序列并未天然地包含信号肽编码序列时，可能需要外源的信号肽编码序列。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列，以提高多肽的分泌。但是，可以使用任何介导所表达多肽进入所选择宿主细胞的分泌途径的信号肽编码序列。
[0112]用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是得自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的信号肽编码序列。
[0113]可用于酵母宿主细胞的信号肽得自酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他可用的信号肽编码序列由Romanos等人，1992，同上记载。
[0114]控制序列还可以是编码位于多肽N端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽称为酶原或多肽原(或在某些情况下为酵素原)。多肽原通常没有活性，可以从多肽原通过前肽的催化或自催化切割而转化为活性多肽。
`[0115]当信号肽和前肽序列二者均存在于多肽的N端时，前肽序列的位置紧接着多肽的N端，且信号肽序列的位置紧接着前肽序列的N端。
[0116]添加相对于宿主细胞的生长来调节多肽表达的调控序列也可能是合意的。调控系统的例子是响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而引起基因表达的开始或结束的系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp丨呆纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α -淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他例子是使得基因扩增的调控序列。在真核系统中，这些调控序列包括在氨甲喋呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及利用重金属来扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
[0117]在第二个方面的优选实施方式中，核酸构建体还包含编码目标蛋白的多核苷酸，优选目标蛋白是酶，优选水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酹氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或木糖苷酶。[0118]表汰载体
[0119]本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多种核苷酸和控制序列可以结合在一起，以制备可以包含一个或多个方便的限制性内切酶位点以使得可以在这些位点处插入或替换编码多肽的多核苷酸的重组表达载体。或者，可以通过在适当的表达载体内插入包含序列的多核苷酸或核酸构建体来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，从而使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0120]重组表达载体可以是任何能够方便地进行重组DNA方法并能够引起多核苷酸的表达的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与载体将要引入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭环质粒。
[0121]载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有任何确保自身复制的工具。或者，载体可以是在引入到宿主细胞时整合到基因组中并与其已经整合入的染色体一起复制的载体。而且，可以使用单个载体或质粒，或两个或更多个共同含有将要引入到宿主细胞的基因组中的全DNA的载体或质粒。
[0122]载体优选包含一个或多个使得可以简单选择所转化的、转染的、转导的等细胞的可选择标记物。可选择标记物是其产物提供对生物灭杀剂或病毒的耐性、对重金属的耐性、原养型到营养缺陷型等的基因。
[0123]用于酵母宿主细胞的合适标记物为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标记物包括，但不限于，amdS (乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar (草胺膦乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸盐还原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5’ -磷酸脱羧酶)、sC (硫酸腺苷转移酶)和trpC (邻氨基苯甲酸合成酶)以及其等同物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus) bar 基因。
[0124]载体优选地含有使得载体可以整合到宿主细胞基因组中或使得载体可以在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。
[0125]对于向宿主细胞基因组中的整合，载体可以依赖于多核苷酸的编码多肽的序列或载体的用于通过同源重组或非同源重组整合到基因组中的任何其他元件。或者，载体可以含有用于介导经同源重组在染色体精确位置处整合至宿主细胞的基因组中的其他多核苷酸。为提高在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有充分量的核酸，例如100~10，000个碱基对、400~10，000个碱基对以及800~10，000个碱基对，其与相应的靶标序列具有高度的序列同一性，以提高同源重组的概率。整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中的靶标序列同源的序列。而且，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0126]对于自主复制，载体还可以包含使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何在细胞中发挥作用的介导自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使得质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0127]用在酵母宿主细胞中的复制起点的例子为2微米的复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。[0128]用在丝状真菌细胞中的复制起点的例子为AMAl和ANSI (Gems等人，1991，Gene98:61-67 ;Cullen 等人，1987，Nucleic Acids Res.15:9163-9175 ；W000/24883)。AMAl基因的分离以及包含该基因的质粒或载体的构建可以根据WO 00/24883中公开的方法来完成。
[0129]多于一个拷贝的本发明多核苷酸可以插入到宿主细胞中，以提高多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过将至少一个额外拷贝的序列整合到宿主细胞基因组中而获得，或者可以通过包含带有多核苷酸的可扩增选择标记物基因而获得，其中含有扩增拷贝的选择标记物基因以及额外拷贝的多核苷酸的细胞可以通过在适当选择试剂的存在下培养细胞而进行选择。
[0130]用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的步骤为本领域技术人员所公知(参见，例如，Sambrook等人，1989,同上)。
[0131]宿主细胞
[0132]在第六个方面，本发明还涉及重组宿主细胞，其包含至少一个如本发明第一个方面中定义的染色体整合的多核苷酸，该多核苷酸与一个或多个介导所编码胞嘧啶脱氨酶的产生的控制序列可操作地连接。
[0133]这些重组宿主细胞适合用包含目标多核苷酸的整合性核酸构建体进行转化，该目标多核苷酸的两侧为分别与宿主细胞基因组中胞嘧啶脱氨酶基因或者该基因的上下游区域同源的区域，该区域通过位点特异性双同源重组来介导染色体整合，从而目标多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中并且胞嘧啶脱氨酶编码基因被部分或完全切除，从而失活。原有的胞嘧啶脱氨酶编码基因的成功失活可以在含有5-氟胞嘧啶的介质中进行选择，其中5-氟胞嘧啶被胞嘧啶脱氨酶转化成有毒的5-氟尿嘧啶。因此，在这种转化方法中，胞嘧啶脱氨酶编码基因起到阴性选择标记物的作用，如在本发明第三个方面的方法中所列出的。
[0134]本发明的第五个方面涉及一种制备亲本宿主细胞的突变体的方法，包括使第一个方面的多核苷酸失活，导致突变体产生比亲本细胞要少的所编码胞嘧啶脱氨酶多肽，或者甚至没有可测出的胞嘧啶脱氨酶活性。没有可测出的胞嘧啶脱氨酶活性的宿主细胞适合于转化方法，其中宿主细胞中转化有含有至少一个第一个方面的可表达胞嘧啶脱氨酶的编码多核苷酸的核酸构建体，该核酸构建体在之后用作在有利于胞嘧啶脱氨酶的表达的条件下在含有嘧啶从头合成抑制剂的生长介质中的阳性选择标记物，如本发明第四个方面所定义的。优选地，嘧啶从头合成抑制剂为N-(膦乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)，其抑制天冬氨酸氨甲酰转移酶。
[0135]术语“宿主细胞”包括亲本细胞的由于在复制过程中发生突变而与亲本细胞不同的任何子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。
[0136]宿主细胞可以是真菌细胞。本文所用的“真菌”包括子囊菌门、担子菌门、壶菌门和接合菌门(如Hawksworth等人，In, Ainsworth and Bisbyj s Dictionary of The Fungi,第八版，1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 中所定义)和卵菌门(如Hawksworth等人1995，同上，第171页所引用的)以及所有的有丝分裂孢子真菌(Hawksworth 等人，1995,同上)。
[0137]真菌宿主细胞可以是酵母细胞。本文所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲)。由于酵母的分类在未来可能会变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M.and Davenport, R.R., eds, Soc.App.Bacteriol.Symposium SeriesN0.9，1980)中记载般进行定义。
[0138]酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维氏酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或子囊菌酵母属，例如乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyceslactis)、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasi1、克鲁维酵母、诺地酵母、Saccharomyces oviformis 或解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)细胞。
[0139]真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门和卵菌门分支的所有丝状形式(如Hawksworth等人，1995,同上所定义)。丝状真菌通常的特征在于，由壳质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长，碳分解必须是需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，碳分解可以是发酵性的。
[0140]丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、黑管菌属(Bjerkandera)、拟腊霉属、金孢属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢菌属、腐质霉属、巨座壳属、毛霉属、毁丝菌属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、白腐菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
[0141]例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟腊菌(Ceriporiopsisaneirina)、 Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟腊菌(Ceriporiopsis gilvescens)、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟腊菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱、Chrysosporiumlucknowense、幾状金抱(Chrysosporium merdarium)、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、热带金抱菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、粗毛云芝(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、克鲁克威尔镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰`孢菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟枝孢镰孢菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镰孢霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、脉射菌(Phlebia radiata)、刺疗侧耳(Pleurotus eryngii)、太瑞斯梭孢壳、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康氏木霉、长梗木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
[0142]真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本质上已知的方式进行转化。合适的用于曲霉属和木霉属宿主细胞的转化的方法记载在 EP 238023、Yelton 等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:1470-1474 以及Christensen 等人,1988, Bio/Technology6:1419-1422 中。用于转化键抱菌属物种的适当方法由Malardier等人，1989，Gene78:147-156和WO 96/00787记载。酵母可以由 Becker and Guarente, In Abelson, J.N.and Simon, Μ.1., editors, Guide to YeastGenetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumel94, ppl82-187, Academic Press, Inc., New York ；Ito 等人,1983, J.Bacteriol.153:163 ；以及 Hinnen 等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1920 记载的方法来转化。
[0143]胞嘧啶脱氨酶活性的去除或降低
[0144]在第五个方面，本发明还涉及制备亲本细胞的突变体的方法，其包括使第一个方面的编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸或其片段失活、破坏或缺失，导致在相同条件下培养时，与亲本细胞相比，突变体细胞产生 更少的所编码胞嘧啶脱氨酶或不产生所编码的胞嘧啶脱氨酶。
[0145]突变细胞可以使用本领域公知的方法，例如插入、破坏、取代或缺失，通过减少或消除多核苷酸的表达来进行构建。在优选的方面，使多核苷酸失活。将要修饰或失活的多核苷酸可以是，例如，活性所必需的编码区或其一部分，或者是编码区的表达所需的调控元件。这种调控序列或控制序列的例子可以是启动子序列或其功能部分，即足以影响多核苷酸的表达的部分。其他用于可能的修饰的控制序列包括，但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终止子和转录激活因子。
[0146]多核苷酸的修饰或失活可以通过使亲本细胞进行诱变并选择其中多核苷酸的表达已经降低或消除的突变体细胞来进行。例如，可以是特异性的或随机的诱变，可以通过使用合适的物理或化学诱变剂，通过使用适当的寡核苷酸，或者通过使DNA序列进行PCR产生的诱变来进行。而且，诱变可以通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。
[0147]适用于当前目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外(UV)辐射、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、0-甲基羟胺、亚硝酸、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。
[0148]当使用这些试剂时，诱变的进行通常是通过将要诱变的亲本细胞在适当的条件下在所选择的诱变剂的存在下进行孵育，并筛选和/或选择表现出降低的基因表达或没有基因表达的突变细胞。
[0149]多核苷酸的修饰或失活可以通过在基因或其转录或翻译所需的调控元件中插入、替换或缺失一个或多个核苷酸而进行。例如，可以插入或去除核苷酸，以引起终止密码子的引入、起始密码子的去除或开放阅读框的变化。这些修饰或失活可以根据本领域已知的方法通过点诱变或PCR产生的诱变而完成。尽管在原则上，修饰可以在体内进行，即直接在将要修饰的表达多核苷酸的细胞上进行，但优选修饰在体外进行，如下文所例示。
[0150]消除或减少多核苷酸的表达的方便方式的例子基于基因取代、基因缺失或基因破坏的技术。例如，在基因破坏法中，将与内源多核苷酸对应的核酸序列在体外诱变，以产生有缺陷的核酸序列，然后将其转化到亲本细胞中，产生有缺陷的基因。通过同源重组，有缺陷的核酸序列取代内源多核苷酸。可能会希望，有缺陷的多核苷酸也编码可用于选择多核苷酸已经被修饰或破坏的转化子的标记物。在一方面，多核苷酸被例如本文所述的可选择标记物所破坏。
[0151]本发明还涉及抑制细胞中具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的表达的方法，包括对细胞施用双链RNA (dsRNA)分子或者在细胞中表达双链RNA (dsRNA)分子，其中dsRNA包含本发明的多核苷酸的子序列。在优选的方面，dsRNA的长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个双核苷酸。
[0152]dsRNA优选为小干扰RNA (siRNA)或微RNA (miRNA)。在优选的方面，dsRNA是用于抑制转录的小干扰RNA。在另一优选方面，dsRNA是用于抑制翻译的微RNA。[0153]本发明还涉及这些双链RNA (dsRNA)分子，包含用于抑制细胞中多肽表达的多肽编码序列SEQ ID N0:59的一部分。尽管本发明不受任何具体作用机制的限制，dsRNA可以进入细胞，并导致类似序列或相同序列的单链RNA (ssRNA)(包括内源mRNA)的降解。当细胞暴露于dsRNA时，来自同源基因的mRNA通过称作RNA干扰(RNAi)的过程而选择性地降解。 [0154]本发明的dsRNA可以用于基因沉默。在一方面，本发明提供使用本发明的dsRNAi来选择性地降解RNA的方法。该方法可以在体外、先体外后体内或在体内实施。在一方面，dsRNA分子可以用于在细胞、器官或动物中产生功能缺失的突变。用于制造并使用dsRNA分子以选择性地降解RNA的方法为本领域公知；参见，例如，美国专利第6，489，127 ；6，506，559 ;6，511，824 ;和 6，515，109 号。
[0155]本发明还涉及亲本细胞的突变细胞，其包含编码胞嘧啶脱氨酶多肽的多核苷酸或其控制序列或编码该多肽的沉默基因的破坏或缺失，导致与亲本细胞相比，突变细胞产生更少的胞嘧啶脱氨酶或不产生胞嘧啶脱氨酶。
[0156]胞嘧啶脱氨酶缺失的突变细胞特别可用作使用编码天然和异源目标蛋白的基因进行转化的宿主细胞。因此，本发明还涉及制备自然或异源多肽的方法，包括:(a)在有利于多肽生产的条件下培养突变细胞；和6)回收多肽。术语“异源多肽”是指对于宿主细胞来说并非天然的多肽，例如，天然蛋白的变体。宿主细胞可以包含多于一个拷贝的编码天然或异源多肽的多核苷酸。
[0157]用于培养和纯化目标产物的方法可以通过本领域已知的方法来实施。
[0158]实施例
[0159]分子克隆技术记载于Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.(1989)Molecularcloning:a laboratory manual (第二版)Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, New York。
[0160]塵
[0161]用于DNA操作的酶(例如限制性内切酶、连接酶等)可得自New EnglandBiolabs, Inc.,并根据制造商的说明书进行使用。
[0162]培养基和试剂
[0163]用于缓冲液的化学品和底物均为分析级的市售产品。
[0164]Cove:342.3g/L鹿糖、20ml/L COVE盐溶液、IOmM乙酰胺、30g/L纯化(noble)琼脂。
[0165]Cove顶层琼脂:342.3g/L蔗糖、20ml/L COVE盐溶液、IOmM乙酰胺、10g/L低熔点琼脂糖。
[0166]Cove-2:30g/L 蔗糖、20ml/L COVE 盐溶液、IOmM 乙酰胺、30g/L 纯化琼脂。
[0167]Cove-N (tf)平板由 342.3g 鹿糖、20mlCove 盐溶液、3g NaNOjP 30g 纯化琼脂组成，加水至I升。
[0168]Cove-N平板由30g鹿糖、20mlCove盐溶液、3g NaNO3和30g纯化琼脂组成,加水至I升°
[0169]COVE 盐溶液由 26g KCl、26g MgSO4.7H20、76g KH2PO4 和 50mlCove 痕量金属组成，加水至I升。
[0170]用于COVE 的痕量金属溶液由 0.04g NaB4O7.10Η20、0.4gCuS04.5Η20、1.2gFeSO4.7Η20、1.0g MnSO4.H2O,0.8g 中性淀粉酶 II MoO2.2H20 和 10.0g ZnSO4.7H20 组成，加水至I升。
[0171]Cove-N顶层琼脂由342.3g鹿糖、20ml Cove盐溶液、3g NaNO3和IOg低熔点琼脂糖组成，加水至I升。
[0172]淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液由6.8g ZnCl2.7Η20、2.5gCuS04.5Η20、0.24gNiCl2.6Η20、13.9g FeSO4.7Η20、13.5g MnSO4.H2O 和 3g 柠檬酸组成，加水至 I 升。
[0173]YPG 由 4g 酵母提取物、Ig ΚΗ2Ρ04、0.5g MgSO4.7H20 和 15g 葡萄糖(ρΗ6.0)组成，加水至I升。
[0174]STC缓冲液由0.8Μ山梨糖醇、25mM Tris (pH8)和25mM CaCl2组成，加水至I升。
[0175]STPC缓冲液由STC缓冲液中40%PEG4000组成。
[0176]MLC由40g葡萄糖、50g大豆粉、4g柠檬酸(pH5.0)组成,加水至I升。
[0177]MSS由70g鹿糖、100g大豆粉(ρΗ6.0)组成,加水至I升。
[0178]MU-1 由 260g 麦芽糊精、3g MgSO4 *7H20,5g KH2PO4,6g K2S04、淀粉葡糖苷酶痕量金属溶液0.5ml和尿素2g (ρΗ4.5)组成，加水至I升。
[0179]KCl平板由0.6Μ KCl、20ml Cove盐溶液、3g NaNO3和30g纯化琼脂组成，加水至I升。
[0180]5-氟胞嘧啶储备液`:1000mg5-氟胞嘧啶，溶解于Iml0.9INaCl溶液。
[0181]购买的材料(大肠杆菌(E.coli)、质粒和试剂盒)
[0182]将大肠杆菌DH5-a (Toyobo)用于质粒构建和扩增。市售的质粒/载体TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)和 pBluescript II SK- (Stratagene#212206)用于 PCR 片段的克隆。扩增的质粒用Qiagen?质粒试剂盒(Qiagen)回收。连接用DNA连接试剂盒(Takara)或T4DNA连接酶(Boehringer Mannheim)进行。聚合酶链式反应(PCR)用Expand TM PCR系统(Boehringer Mannheim)进行。使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)来纯化PCR片段并从琼脂糖凝胶中提取DNA片段。
[0183]菌株
[0184]米曲霉BECh-2记载于丹麦专利申请PA 1999 01726中。使用构巢曲霉菌株NRRL1092作为供体菌株。
[0185]表达宿主菌株黑曲霉NN059095通过Novozymes分离，并且是分离自土壤的黑曲霉NN049184的衍生种。对NN059095进行遗传修饰，以破坏淀粉葡糖苷酶活性的表达。
[0186]米曲霉ToC1512记载于W02005/070962实施例11中。
[0187]质粒
[0188]表达质粒pHUda440和来自瓣环栓菌(Trametes cingulata)的淀粉葡糖苷酶的核苷酸序列记载于专利申请W02006/069289。
[0189]质粒pJaL574以及单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)、构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Pgpd)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)的核苷酸序列记载于W007045248的实施例9中。
[0190]表达盒质粒pJaL790以及中性淀粉酶II启动子(Pna2)的核苷酸序列记载于专利公开 W02005070962 中。
[0191]JA126淀粉酶表达载体记载于专利申请10729.0OO-US中。[0192]质粒pDV8记载于专利WO 2001/068864实施例8中。
[0193]质粒pJaL504记载于实施例10中。
[0194]质粒P JaL504_ δ -Bgl 11记载于实施例10中。
[0195]质粒pJaL554记载于专利W02000/050567A1实施例1中。
[0196]质粒pJaL574记载于实施例10中。
[0197]质粒pJaL835记载于实施例10中。
[0198]质粒pJaL955记载于实施例10中。
[0199]质粒pJaL1022记载于实施例10中。
[0200]质粒pJaL1025记载于实施例10中。
[0201 ] 质粒pJaL1027记载于实施例10中。
[0202]质粒pJaL1029记载于实施例10中。
[0203]质粒pJaLl 120记载于实施例10中。
[0204]质粒pJaL1123记载于实施例10中。
[0205]质粒pJaL1183记载于实施例10中。
[0206]质粒pJaL1194记载于 实施例10中。
[0207]质粒pJaL1202记载于实施例10中。
[0208]质粒pToC65记载于专利WO 91/17243中。
[0209]质粒pUC19:构建体记载于 Vieira 等人，1982，Genel9:259-268 中。
[0210]质粒pCR?4BluntTOPO? 得自 Invitrogen0
[0211]曲霉的转化
[0212]曲霉物种的转化可以使用酵母转化的通常方法来实现。本发明优选的方法描述如下。
[0213]将黑曲霉宿主菌株接种到补充有IOmM尿苷的100ml YPG培养基中，于32°C在80rpm下孵育16小时。收集球块，用0.6M KCl洗涤，并再悬浮于以20mg/ml的最终浓度含有市售 β _ 葡聚糖酶产品(GLUCANEX?, Novozymes A/S, Bagsvaerd，Denmark)的 20ml0.6ΜKCl中。将悬浮液于32°C在振动下(SOrpm)孵育，直至形成原生质体，然后用STC缓冲液洗涤两次。将原生质体用血球计进行计数，在8:2:0.1的STC: STPC:DMS0溶液中再悬浮，并调节至2.5 X IO7个原生质体/ml的最终浓度。将约4 μ g质粒DNA加入到100 μ I原生质体悬浮液中，轻轻混合，并在冰上孵育30分钟。加入Iml SPTC，将原生质体悬浮液在37°C下孵育20分钟。在加入10ml50°C Cove或Cove-N顶层琼脂之后,将反应物倒在Cove或Cove-N (tf)琼脂平板上，将平板在32°C下孵育5天。
[0214]PCR 扩增
[0215]5x PCR 缓冲液(包含 MgCl2) 20 μ?
【权利要求】
1.一种分离的编码具有胞嘧啶脱氨酶活性的多肽的多核苷酸，所述多肽选自: (a)与SEQ ID NO: 60的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多肽； (b )由在中等严格条件、中高度严格条件、高度严格条件或极高度严格条件下与(i ) SEQID NO:59的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii) (i)或(ii)的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽； (c)由与SEQID NO: 59的多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的多核苷酸所编码的多肽； (d)SEQID N0:60的多肽的在一个或多个位置包含替换、缺失和/或插入的变体；以及 Ce)具有胞嘧啶脱氨酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的多肽片段。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其编码具有与SEQID NO:60至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的多核苷酸，其在中等严格条件、中高度严格条件、高度严格条件或极高度严格条件下与(i) SEQ ID NO:59的多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补物进行杂交。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的多核苷酸，其与SEQID NO:59的多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的多核苷酸，其编码具有SEQID N0:60氨基酸序列的多肽的片段，其中该片段具有胞嘧啶脱氨酶活性。
6.根据权利要求1~4中任一项所述的多核苷酸，其编码具有SEQID N0:60氨基酸序列的胞嘧啶脱氨酶多肽。
7.—种核酸构建体或表达载体,包含权利要求1~6中任一项所述的多核苷酸,所述多核苷酸与一个或多个介导胞嘧啶脱氨酶多肽在合适表达宿主细胞中生产的控制序列可操作地连接。
8.一种使用权利要求1~6中任一项所述的多核苷酸作为阴性选择标记物的方法，包括以下步骤: (a)提供包含一个或多个权利要求1~6中任一项所述的编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的宿主细胞； (b)用整合性核酸构建体转化所述宿主细胞，所述整合性核酸构建体在位点特异性地整合到宿主基因组中时，使至少一个编码 胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸失活，从而与步骤(a)的宿主细胞相比，所得的宿主细胞产生更少的胞嘧啶脱氨酶或不产生胞嘧啶脱氨酶； (C)在包含足量5-氟胞嘧啶的选择性介质中培养所转化的宿主细胞，5-氟胞嘧啶通过胞嘧啶脱氨酶转化为抑制性浓度的有毒5-氟尿嘧啶；以及 (d)选择可以在所述选择性介质中生长并具有减少的胞嘧啶脱氨酶活性或具有不可测出的胞嘧啶脱氨酶活性的所得宿主细胞。
9.一种使用权利要求1~6中任一项所述的多核苷酸作为阳性选择标记物的方法,包括以下步骤: (a)提供不具有可测出的胞嘧啶脱氨酶活性的宿主细胞； (b)用包含至少一种可表达的权利要求1~6中任一项所述的编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的核酸构建体转化所述宿主细胞； (C)在有益于胞嘧啶脱氨酶的表达的条件下，在包含嘧啶从头合成抑制剂的介质中培养所转化的宿主细胞； (d)选择生长中的包含至少一种编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸的宿主细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述核酸构建体还包含编码目标蛋白的多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述目标蛋白是酶，优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如，氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。
12.—种制备亲本宿主细胞的突变体的方法，包括使权利要求1~6中任一项所述的多核苷酸失活，得到比所述亲本细胞产生更少的所编码的胞嘧啶脱氨酶多肽的突变体。
13.根据权利要求8~12中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真菌宿主细胞；优选为丝状真菌宿主细胞；更优选为枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、黑管菌属、拟蜡菌属、金孢属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢菌属、腐质霉属、巨座壳属、毛菌霉、毁丝菌属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞，或最优选为泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟腊菌、Ceriporiopsis caregiea、浅黄拟腊菌、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟腊菌、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱、Chrysosporium Iucknowense> 幾状金抱、Chrysosporium pannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞、粗毛云芝、杆孢状镰孢、谷类镰孢、克鲁克威尔镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟枝孢镰孢菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镰孢霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、脉射菌、刺芹侧耳、太瑞斯梭孢壳、长绒毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康氏木霉、长梗木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
14.一种重组宿主细胞，包含至少一个染色体整合的权利要求1~6中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸与一个或多个介导所编码的胞嘧啶脱氨酶的产生的控制序列可操作地连接。
15.根据权利要求14所述的重组宿主细胞，其为真菌宿主细胞；优选为丝状真菌宿主细胞；更优选为枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、黑管菌属、拟蜡菌属、金孢属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰孢菌属、腐质霉属、巨座壳属、毛菌霉、毁丝菌属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞，或最优选为泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟腊菌、Ceriporiopsiscaregiea、浅黄拟腊菌、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟腊菌、Chrysosporium inops、嗜毛金色抱、Chrysosporiumlucknowense、！^状金抱、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞、粗毛云芝、杆孢状镰孢、谷类镰孢、克鲁克威尔镰孢菌、黄色镰孢菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟枝孢镰孢菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镰孢霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米赫毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉胞菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、脉射菌、刺芹侧耳、太瑞斯梭孢壳、长绒毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康氏木霉、长梗木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
16.权利要求1~6中任一项所述的多核苷酸或权利要求7中所述的核酸构建体或载体作为微生物转化过程中的选择标记物的用途，其中将目标多核苷酸转化到合适的微生物宿主细胞中，然后将所述微生物宿主细胞在阳性或阴性选择压力条件下进行培养，来选择所述选择标记物的存在或不存在。
【文档编号】C12N9/78GK103562385SQ201280025319
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年5月23日
【发明者】宇田川裕晃 申请人:诺维信公司