重建头皮模型和筛选活性分子的方法

重建头皮模型和筛选活性分子的方法
【专利摘要】本发明涉及重建头皮模型、其制备方法及其用于评估化妆品、药品或皮肤病局部产品的效果的用途。本发明的重建头皮也可用于制备旨在治疗头皮皮肤症状的移植物。
【专利说明】重建头皮模型和筛选活性分子的方法
[0001]本发明涉及重建头皮模型、其制备方法及其用于评估化妆品、药品或皮肤病局部产品的效果的用途。
[0002]根据本发明的重建头皮也可用于制备要移植到哺乳动物上，更特别移植到人类患者如遭受三度烧伤患者上的移植物。
[0003]近年来已开发出或多或少类似于人皮肤的重建皮肤模型。可提及的重建皮肤模型的实例包括下列文献中描述的模型:EP O 285 471、EP O 285 474、EP O 418 035、WO90/02796、WO 91/16010、EP O 197 090、EP O 020 753、FR 2 665 175、FR 2 689 904。这些模型首先使为更好地理解皮肤在机械学领域和生理学领域中的作用所进行的必需的研究成为可能，其次构成化妆品和/或药品活性剂的活性或局部成分的副作用的预测试验。
[0004] 申请人:已经观察到，这些模型适用于涉及人体皮肤的研究，但它们对涉及特殊皮肤一头皮的研究不理想。就 申请人:所知，迄今尚未提出过重建头皮模型。
[0005]头皮是位于头发下，即覆盖颅骨的皮肤部分。在成年人中，其面积为650至700平方厘米的范围。其具有常规结构，但有几个重要特征使其有别于人体其它部位的皮肤:
-由于这些细胞的更快速更新，其表皮更厚，
-其角质层更厚但无序，
-由于它们的更大量存在(大约200至300个毛囊/平方厘米)，其毛囊的活性更大，
-其皮脂腺的产出旺盛且其汗腺的活性高，这允许大量细菌和真菌在其中定殖。
[0006]一般而言，由于这些`细胞的易生产性，上述文献中描述的重建皮肤模型由真皮乳头或结缔组织鞘的成纤维细胞和/或取自外上皮鞘(也称作0RS，即外根鞘)的细胞制成。具体而言，在拔出头发时这些细胞被取出，并在将它们置于载体，通常真皮等价物上并在合适的培养基中培养时能制造表皮。但是，通过培养真皮乳头细胞而得的组织表现出与在体头皮不符的大分子(尤其是胶原)表达。通过培养ORS细胞而得的组织也没有头皮的特征。此外，没有观察到在在体头皮上发生的正常脱屑现象，因为ORS细胞从未与空气接触，它们不会脱屑。由此获得的模型因此不能用于体外再现头皮屑的出现。最后，使用这些各种细胞获得的表皮和真皮的大小和形态与头皮的表皮和真皮不同:在头皮的情况下，真皮比皮肤的情况中更厚和更内陷(invaginated)。
[0007] 申请人:已经证实，令人惊讶地，滤泡间头皮细胞的培养使得开发具有在体头皮的大部分特征的重建头皮模型。
[0008]这种头皮模型的一个特征是在最终基底上层中，即在表皮的颗粒层中表达内披蛋白和角蛋白KlO (尤其见图1)。颗粒层的细胞位于肩 廣下方。颗粒层(或
由三层具有致密的椭圆形核的扁平角质形成细胞形成。在由“拔除(lifting)”过程中所取的样品获得的头皮切片上发现内披蛋白和角蛋白KlO的迟发性表达，而在重建皮肤的切片中，在基底上层各处，即在马尔皮基粘液物质(其构成棘层)层的细胞中观察到这些标记物的表达。这表明根据本发明的头皮模型具有在体头皮的特性。
[0009]这些特征使得特别区分根据本发明的方法获得的头皮模型与标准重建皮肤模型成为可能。[0010]因此， 申请人:已经开发出制备头皮等价物的新颖方法。
[0011] 申请人:分离滤泡间头皮细胞并有意使用它们开发头皮等价物。
[0012]术语“头皮等价物”——在下文中也被称作头皮模型，是指铺在头皮真皮等价物上的头皮表皮等价物的组装物。这是经由技术方法体外制造的结构。
[0013]本发明因此涉及制备头皮等价物的方法，包括接种步骤和在真皮等价物上培养滤泡间头皮角质形成细胞的步骤，所述真皮等价物包含胶原和滤泡间头皮成纤维细胞。
[0014]可以根据各种方法，例如文献EP O 418 035、WO 00/29553或EP O 285 471中描述的那些制备真皮等价物，小心使用上述成纤维细胞。
[0015]可提到的真皮等价物包括胶原/成纤维细胞混合网架、已预先去表皮化的真皮、人工膜，例如Millipore牌过滤器，基于胶原的皮下基质、塑料、或与细胞生活力相容的任何其它载体。本发明的真皮等价物优选是胶原网架或胶原海绵形式。
[0016]术语“胶原网架”是现有技术中公知的(Bell等人1979，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.76，N0.3，第1274-1278页)，其表示已使用数十年的已知真皮等价物模型。
[0017]优选地，根据本发明，根据Asselineau 等人，1987 (Models in dermat0., vol.1ll,Ed Lowe & Maibach, 1-7)介绍的方法制备该网架。
[0018]术语“胶原海绵”也是本领域技术人员已知的。其是指基于胶原的生物聚合物(例如:BASF Beauty Care 出售的 Mimedisk?)。
[0019]根据本发明，胶原可以是任何来源的任何类型的胶原。就此而言，参考Van derRest 和 Garonne 的，1990，Biochem., vol.72, 473-484 或 1991，Faseb Journal, vol.5，2814-2823的综述中提到的各种类型的胶原。因 此，根据本发明，该胶原优选选自1、III或V类型的纤维胶原。
[0020]优选地，根据本发明，使用动物来源的胶原，特别是牛源胶原。
[0021]根据本发明优选使用的胶原是I型胶原。根据本发明最优选使用牛I型胶原。
[0022]无需说，根据本发明，可以使用任何比例和/或不同来源的不同类型胶原的混合物。
[0023]优选地，该真皮等价物是收缩胶原网架，并优选在该网架收缩2至6天后，更优选在3至5天后，再更优选在3天后进行角质形成细胞接种。胶原凝胶的收缩优选归因于滤泡间头皮成纤维细胞对胶原的作用。
[0024]滤泡间头皮成纤维细胞和/或角质形成细胞优选分别从获自头皮样品的真皮和表皮中分离。在一个优选实施方案中，已预先从这种样品中除去外上皮鞘的角质形成细胞，例如通过脱除所述样品上的毛发。例如使用镊子拔除头皮样品上的毛发以从样品上完全除去外上皮鞘的角质形成细胞。
[0025]优选经由下列步骤获得滤泡间头皮角质形成细胞:
-通过头皮样品的蛋白水解处理，特别通过使头皮样品与分散酶或嗜热菌蛋白酶接触，将头发真皮与表皮分离，
-回收头皮表皮，
-使由此获得的头皮表皮与胰蛋白酶接触，
-回收滤泡间头皮角质形成细胞；和 -培养由此获得的角质形成细胞。[0026]角质形成细胞在接种前根据Rheinwald和Green的技术(Cell, vol.6,331-344，1975)通过在本领域技术人员已知的合适培养基中在生长因子，尤其是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸和PH缓冲液存在下在由成纤维细胞构成的营养载体上培养而扩增。特别地，这种培养基尤其可含有至少一种角质形成细胞促有丝分裂生长因子(例如表皮生长因子(EGF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)，特别是KGF)、胰岛素、氢化可的松和任选的抗生素(例如:庆大霉素或两性霉素B)。
[0027]有利地，所述培养基还可包含血清或垂体提取物(例如牛来源)、肾上腺素、转铁蛋白和/或非必需氨基酸。
[0028]用于这种培养的成纤维细胞更优选是3T3成纤维细胞。3T3成纤维细胞是本领域技术人员公知的。这是自1962年起就为人所知的一种成纤维细胞系。“3T3”是指“3xl05细胞的3天传代接种”。
[0029]滤泡间头皮角质形成细胞的培养优选是与已预先停止增殖(优选通过预先辐照(例如用UV)或通过预先用丝裂霉素处理它们)的成纤维细胞(优选3T3成纤维细胞)的共培养物。丝裂霉素(特别是丝裂霉素C)阻断这些细胞的增殖，但不阻止它们产生有助于角质形成细胞增殖的营养物质。
[0030]根据另一实施方案，角质形成细胞在接种前通过在已用纤连蛋白(例如“涂有纤连蛋白”的培养箱)或用胶原(例如“涂有I型胶原”的培养箱)处理或增补的培养基上或在富培养基，如Epilife?培养基(Gibco)上培养而扩增。
[0031]分散酶(也称作中 性蛋白酶)是属于蛋白酶家族的酶，其具有裂解纤连蛋白和I和IV型胶原的能力。
[0032]优选经由下列步骤获得滤泡间头皮角质形成细胞:
-通过头皮样品的蛋白水解处理，尤其通过使头皮样品与分散酶或嗜热菌蛋白酶接触，将头发真皮与表皮分离，
-回收头皮真皮，
-使由此获得的头皮真皮与胶原酶和/或胰蛋白酶接触，
-回收滤泡间头皮成纤维细胞；和 -培养由此获得的成纤维细胞。
[0033]清楚理解的是，上文提到的酶以本领域技术人员已知的能使它们实现所需作用的浓度使用。其优选是用于将头皮真皮与表皮分离的分散酶。胰蛋白酶(Gibco)可以由头皮表皮获得滤泡间头皮角质形成细胞的悬浮液。胶原酶(Boehringer)和/或胰蛋白酶可以由头皮真皮获得滤泡间头皮成纤维细胞的悬浮液。
[0034]优选通过过滤经由胰蛋白酶或胶原酶的作用获得的悬浮液、接着在本领域技术人员已知的条件下离心和再悬浮离心团块来进行滤泡间头皮角质形成细胞或成纤维细胞的回收。
[0035]更特别地，本发明的方法包括:
a-用滤泡间头皮角质形成细胞接种位于浸在培养基中的载体上的胶原网架； b-使滤泡间头皮角质形成细胞在所述胶原网架表面增殖；
C-升高所述载体以使培养基在生产过程中不覆盖表皮等价物的上表面。
[0036]该载体特别是载体格栅。[0037]特别通过用滤泡间头皮成纤维细胞接种培养基、接着添加胶原而获得本发明的真皮等价物。
[0038]本发明的方法可包含下列培养步骤:
a)例如从在接种了动物或人组织碎片的营养培养基上生成的单层培养物中收取收缩细胞，
b)使用补充了真皮细胞外基质的组分，特别是胶原的营养培养基，
所述混合物形成凝胶，其收缩，排出营养培养基，从而形成真皮等价物，特别是收缩胶原网架。
[0039]通过受控胰蛋白酶化或通过使用胶原酶，获自健康人类供体并从单层培养物中收取的滤泡间头皮成纤维细胞将用作收缩细胞。
[0040]根据本发明的制备方法的实施包括用滤泡间头皮角质形成细胞接种真皮等价物或真皮基质。
[0041]保持能在所述基质表面增殖角质形成细胞的条件，使用与所述角质形成细胞接触的至少一种最低营养培养基 ，优选如实施例1中介绍的3F培养基促进这种滤泡间头皮角质形成细胞培养物的生长。
[0042]有利地，在基质上接种角质形成细胞后，通过浸在覆盖角质形成细胞的这种营养培养基中，将植入的基质保持优选5至7天。
[0043]接下来，使该真皮等价物与空气接触。为此，将其置于相对于容器底升高的载体格栅上，并调节营养培养基的水平以刚好覆盖载体格栅但该营养培养基在生产过程中不覆盖皮肤等价物的上表面。
[0044]根据本发明的方法，接种了滤泡间头皮角质形成细胞的收缩真皮等价物因此优选通过浸在培养基中培养5至7天，接着在合适的载体上露出5至7天。
[0045]由此构造的根据本发明的头皮等价物充分分化和有序。其也总体均匀。
[0046]根据本发明的方法的一个变体，通过将选自真皮乳头的成纤维细胞和/或结缔组织鞘的成纤维细胞和/或完整真皮乳头和/或结缔组织鞘和/或结缔组织鞘片段的毛发成纤维细胞植入已收缩或在收缩过程中的所述真皮头皮等价物中(特别植入胶原网架中)，可以获得包含毛发的头皮等价物。这可以例如使用注射器实施。在滤泡间成纤维细胞已开始它们对胶原的作用后加入这些毛发成纤维细胞、完整真皮乳头、结缔组织鞘和/或结缔组织鞘片段。它们的添加因此不与滤泡间头皮成纤维细胞同时进行。毛发成纤维细胞优选以1000至10 000个细胞量添加，即每100个滤泡间头皮成纤维细胞大约I至10个毛发成纤维细胞的比例。
[0047]通过将毛发成纤维细胞，如乳头成纤维细胞或结缔组织鞘的成纤维细胞或完整乳头或结缔组织鞘或结缔组织鞘片段植入真皮等价物中，角质形成细胞会再现体毛或头发(hair stalk (毛梗))的形态发生(Reynolds A.J., Lawrence C.Μ., Jahoda C.A., Humanhair follicle germinative epidermal cell culture.J.1nvest.Dermatol.1993Oct.:101 (4): 634-8) o
[0048]本发明的另一主题是可通过本发明的方法获得的头皮等价物。
[0049]这种头皮等价物在其颗粒层中表达内披蛋白和/或角蛋白K10，这是与在体头皮相当的表达。术语“相当的表达”是指在位于与在体组织中相同位置的细胞中和/或以相同强度发生的编码这些蛋白质的基因的表达。
[0050]考虑到该头皮等价物具有在体头皮的特征，其可以以与取自待治疗个体的颈背或枕骨区的移植物相同的方式同样成功地移植。例如Bouhanna等人(Dermatol.Surg.;Nov.2003, 29(11)，1130-4)介绍了自体移植技术。在移植后，根据本发明的头皮等价物因此具有适当替代原始头皮部分的能力。
[0051]该头皮等价物也可用于制备旨在治疗头皮皮肤症状，如烧伤、愈合缺陷或灰发症并因此要移植到哺乳动物上，更特别移植到人类患者，如遭受三度烧伤患者上的移植物。移植物定义为要移植的组织部分。
[0052]因此，本发明的另一主题涉及如上定义的头皮等价物，其用于治疗上文提到的头皮皮肤症状之一。这种头皮等价物或移植物在内披蛋白和角蛋白KlO的表达方面具有与在体头皮相当的特征(即在表皮的最终颗粒层中表达内披蛋白和角蛋白K10)。本发明因此还涉及如上所述的头皮等价物用于制造治疗这些头皮皮肤症状之一用的移植物的用途。
[0053]无论用于其制备的工艺如何变化，所得到的头皮等价物是可用作需要动物实验的任何试验(例如关于活性剂的释放、它们的经皮渗透和/或它们的吸收和/或它们的生物利用度的研究，或关于活性剂和/或化妆品、药品或皮肤病学成分的耐受度、相容性或效力的研究)的替代试验的三维模型。
[0054]因此，本发明的另一主题是如上所述的头皮等价物用于测试化合物在头皮上的经皮渗透和/或吸收和/或生物利用度和/或效力和/或用于测试头皮对化合物的耐受度和/或相容性的用途。
[0055]这一用途因此使得看出化合物是否渗入头皮的各种层或是否确实具有所需效果成为可能。
[0056]这种头皮等价物尤其可用于鉴别作为毛发生长调节剂的化合物和/或作用于头皮的质量和体内平衡，尤其作用于头皮脱屑、治疗头皮屑或敏感头皮的分子。
[0057]此外，其能用于寻找与头皮的正常或病理状态相关的生物标记。另一优点在于有可能研究毛囊、汗腺或皮脂腺的工作以更接近在体头皮。
[0058]这一模型是通过注射干细胞诱发毛发形成所必需的。
[0059]根据本发明的重建头皮模型能够量化能由干细胞(例如由球部细胞)诱发毛发形成的分子的活性。
[0060]包含毛囊的头皮等价物尤其能够实施体毛或头发生长动力学并因此能用于需要许多在体内环境中尽可能完整的真发(live hairs)的任何研究，如毛发周期的研究和能影响这一周期的因素的研究，以及促进毛发生长的活性剂、抗脱发的活性剂或减慢毛发生长的活性剂的研究。
[0061]用于鉴定新颖活性剂的产品筛选法包括步骤(a)使所述受试产品与根据本发明的头皮等价物接触，然后步骤(b)分析所述产品对头皮等价物的至少一个参数的作用和步骤(c)选择改进所述参数的产品。
[0062]优选地，为了实施步骤(a)，局部施加受试产品，例如配制成标准局部制剂或引入
培养基中。
[0063]头皮等价物的参数优选选自预先选择的标记物在该头皮等价物中的表达、生成和/或活性和/或头皮等价物的脱屑。[0064]可特别通过分析与头皮的质量和/或体内平衡相关的标记物，例如表皮和/或真皮标记物，如结构蛋白，尤其是表皮分化蛋白和真皮基质的大分子蛋白的表达、生成和/或活性来进行步骤(b)。可提到的结构蛋白的实例是毛发角蛋白。
[0065]与头皮的质量和/或体内平衡相关的这些标记物可以是头皮脱屑、头皮屑状况或敏感头皮的代表。
[0066]当本发明的头皮模型包含已如上所述植入真皮等价物中的毛发成纤维细胞，如乳头成纤维细胞或结缔组织鞘的或完整乳头或结缔组织鞘成纤维细胞或结缔组织鞘片段时，该筛选试验也旨在鉴别能诱发毛梗生长的产品。
[0067]为此，该筛选法的步骤(b)分析对毛梗生长的作用。
[0068]当根据本发明的头皮模型包含免疫系统的细胞，如朗格汉斯细胞时，该筛选试验还旨在鉴别能诱发刺激或过敏反应的产品。
[0069]为此，该筛选法的步骤(b)分析产品对至少一个参数的作用，所述参数优选选自: -细胞毒性；
-炎症介质的释放； -通过组织学或通过乳酸脱氢酶(角质形成细胞膜完整性的标记物)的释放揭示的细胞损伤(Roguet 等人，J.Tox.1n vitro 6:303 (1992)和 Ponec M in In VitroToxicology.Eds Rougier, Maibach 和 Golberg p.107, 1994)；
-皮肤脂质，特别是神经酰胺和磷脂的合成和组成的改变(JID 86，598 (1986))；
-作为其分化的标记的上皮细胞的分层(M.Prunieras和R.Roguet Toxicologiecellulaire in vitro methodes et applications, Eds M.Adolphe, A.Guillouzo和F.Marano, INSERM 1995 出版，第 191-236 页)(Duffy P.A., Flint 0.P.:1n vitro dermalirritancy test.1n C.K.Atterwill 和 C.E.Steele (Eds):1n vitro methods inToxicology, Cambridge Univ.Press Cambridge 1987,第 279-297 页)(Use of skincell culture for in vitro assessment of corrosion and cutaneous irritancy,Roguet, Cell Biology and Toxicology, 1999:15， 63-75)。
[0070]分析产品作用的步骤(b)优选是在与受试产品接触的头皮等价物上测得的至少一个参数与在对照头皮等价物(其在相同条件下培养但没有接受受试产品)上测得的那些参数的比较。
[0071]选择改进头皮等价物的参数的产品的步骤(C)根据预先确定的标准的函数进行。
[0072]这种参数的改进可以是刺激、降低或完全或部分抑制所述标记物的表达、生成和/或活性和/或毛梗的生长和/或头皮等价物的脱屑。
[0073]选择所述产品的标准是例如这种产品对测量参数具有刺激或抑制作用。
[0074]本发明的头皮等价物也可用于化妆品、药品或皮肤病学化合物的自动筛选法以鉴别新颖活性剂。
[0075]图1更清楚图解本发明，但不限制其范围。
[0076]在该图中，照片显示使用抗内披蛋白抗体(1)和抗-KlO抗体(II)免疫标记后的重建皮肤(皮肤等价物)(A)、根据本发明的头皮等价物(B)和头皮样品(C)的切片。
[0077]下面给出的实施例代表本发明非限制性的示例。
[0078]实施例1 -头皮模型的制备从拉皮手术过程中收集的头皮样品(因此获自相对成熟的女性)或从获自相对年轻男性的头皮样品中分离滤泡间头皮角质形成细胞和成纤维细胞。
[0079] 为了分离这些头皮细胞，实施脱毛以除去外上皮鞘的角质形成细胞，然后将真皮与表皮分离以提取两种目标细胞群，即滤泡间成纤维细胞和角质形成细胞。
[0080] 实验方案:
除非另行指明，在 Bell 等人 1979 (P.N.A.S.USA, 76，1274-1278)，Asselineau 和Prunieras, 1984, (British J.0f Derm., 111, 219-222)或 Asselineau 等人，1987，(Models in dermat0., vol.1ll, Ed.Lowe 和 Maibach, 1-7)中描述了实施例中使用的
所有培养基和缓冲液。
[0081] 培养基MEM + 10% FCS + 3F (被称作3F培养基)具有下列组成:
【权利要求】
1.制备头皮等价物的方法，其特征在于在真皮等价物上接种和培养滤泡间头皮角质形成细胞，所述真皮等价物包含胶原和滤泡间头皮成纤维细胞。
2.根据前一权利要求的方法，其特征在于该真皮等价物是收缩胶原网架且在所述网架收缩2至5天后进行角质形成细胞接种。
3.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述滤泡间头皮成纤维细胞和角质形成细胞分别从获自头皮样品的真皮和表皮中分离。
4.根据前一权利要求的方法，其特征在于所述滤泡间头皮角质形成细胞获自已预先从中除去外上皮鞘的角质形成细胞的头皮样品。
5.根据权利要求3或4的方法，其特征在于经由下列步骤获得该滤泡间头皮角质形成细胞: -通过头皮样品的蛋白水解处理，将头皮真皮与表皮分离， -回收头皮表皮， -使由此获得的头皮表皮与胰蛋白酶接触， -回收滤泡间头皮角质形成细胞；和 -培养由此获得的角质形成细胞。
6.根据前一权利要求的方法，其特征在于所该角质形成细胞培养物是与预先用丝裂霉素处理或辐照的成纤维细胞的共培养物或在补充了纤连蛋白或胶原的培养基上的培养物。
7.根据权利要求3的方法，其特征在于经由下列步骤获得该滤泡间头皮成纤维细胞: -通过头皮样品的蛋白水解处理，`将头皮真皮与表皮分离， -回收头皮真皮， -使由此获得的头皮真皮与胶原酶和/或胰蛋白酶接触， -回收滤泡间头皮成纤维细胞；和 -培养由此获得的成纤维细胞。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于接种了滤泡间头皮角质形成细胞的收缩真皮等价物通过浸在培养基中培养5至7天，接着在合适的载体上露出5至7天。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于其包括步骤:将选自真皮乳头的成纤维细胞和/或结缔组织鞘的成纤维细胞的毛发成纤维细胞，和/或完整真皮乳头和/或结缔组织鞘和/或结缔组织鞘片段植入已收缩或在收缩过程中的所述真皮等价物中。
10.头皮等价物，其特征在于其在其颗粒层中展现出内披蛋白和/或角蛋白KlO的表达。
11.通过根据权利要求1至9任一项的方法获得的头皮等价物。
12.根据前一权利要求的头皮等价物，其特征在于其在其颗粒层中展现出内披蛋白和/或角蛋白KlO的表达。
13.如权利要求10至12任一项所述的头皮等价物，其用于治疗头皮皮肤症状。
14.根据前一权利要求使用的头皮等价物，其特征在于所述皮肤症状是头皮烧伤。
15.根据权利要求10至12任一项的头皮等价物用于测试化合物在头皮上的经皮渗透和/或吸收和/或生物利用度和/或效力的用途。
16.用于鉴别新颖活性剂的产品筛选法，其包括步骤(a)使所述受试产品与根据权利要求10至12任一项的头皮等价物接触，然后步骤(b)分析所述产品对头皮等价物的至少一个参数的作用和步骤(c)选择改变所述参数的产品。
【文档编号】C12N5/071GK103764816SQ201280026055
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年5月30日 优先权日:2011年5月30日
【发明者】K.巴卡 申请人:莱雅公司