合成基因的制作方法
【专利摘要】本发明提供了特别适合于在植物中良好表达的编码感兴趣蛋白质的合成核酸序列。要求保护的合成序列利用的植物优化密码子大致为它们在天然存在于植物物种中的基因中平均利用的相同频率。本发明进一步包括使用合成DNA序列，该合成DNA序列用于除草剂耐受性、水和/或热应激耐受性、健康的油修饰及用于转化标志物基因和选择标志物基因。教导了含有合成序列的DNA构建体和转基因植物，也教导了在农业中使用所述植物的方法和组合物。
【专利说明】合成基因
[0001]发明背景
[0002]为了在转基因植物中实现异源蛋白质的期望表达水平，已经发现了有益的是以多种方式改变天然的(有时称为野生型或初始的)DNA编码序列，例如使得密码子选择更紧密匹配宿主植物物种的密码子选择，和/或因此编码序列的G+C含量更紧密匹配通常存在于宿主植物物种的编码序列中的G+C水平，和/或使得除去使mRNA不稳定的某些序列。例如，已经使用这些方法中的一种或多种来改善苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, B.t.)晶体蛋白昆虫毒素在植物中的表达。参见例如美国专利N0.5380301，美国专利N0.5625136，美国专利N0.6218188，美国专利N0.6340593，美国专利N0.6673990，美国专利N0.7741118。密码子简并性容许使用与那些在初始DNA编码序列中使用的密码子不同的密码子生成编码感兴趣蛋白质的合成DNA序列。
[0003]关于除去可以使mRNA不稳定的序列，美国专利N0.7741118披露了一批16种多聚腺苷酸化信号序列(栏15，表1I)，并且要求减少意图在植物中表达的合成编码序列中的此类序列的数目。下文在表1中列出了 US 7741118，表1I中列出的多聚腺苷酸化信号序列:
[0004]表1:US 7741118，表1I中列出的多聚腺苷酸化信号序列。
【权利要求】
1.一种用于在玉米细胞中表达感兴趣蛋白质的合成DNA序列，其包含: a)编码所述感兴趣蛋白质的经密码子优化的DNA序列， b)至少一种选自下组的多聚腺苷酸化信号序列:1类和II类，其中: I类选自下组:AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和 CATAAA ;且 II类选自下组:ATATAT, TTGTTT，TTTTGT，TGTTTT，TATATA, TATTTT，TTTTTT，ATTTTT，TTATTT,TTTATT,TAATAA,ATTTAT,TATATT,TTTTAT,ATATTT,TATTAT,TGTTTG,TTATAT,TGTAAT,和 AAATAA ;且 其中所述经密码子优化的DNA序列含有至少一种来自II类的多聚腺苷酸化信号序列，且其中所述合成DNA序列比所述蛋白质的天然DNA序列含有更少的II类多聚腺苷酸化信号序列，并且与所述天然DNA序列相比含有相同数目的I类多聚腺苷酸化信号序列。
2.权利要求1的合成DNA序列，其基本上没有II类多聚腺苷酸化信号序列。
3.权利要求1的合成DNA序列，其没有II类多聚腺苷酸化信号序列。
4.权利要求1的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码选自下组的天然蛋白质:杀虫蛋白、除草剂耐受性蛋白、应激耐受性相关蛋白、和油概况修饰蛋白(oil profilemodification protein)。
5.权利要求4的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码杀虫蛋白。
6.权利要求4的合成DNA·序列，其中所述合成DNA序列编码芳氧基链烷酸双加氧酶(aryloxyalkanoate dioxygenase) I 蛋白。
7.—种用于在大?细胞中表达感兴趣蛋白质的合成DNA序列,其包含: a)编码所述感兴趣蛋白质的经密码子优化的DNA序列， b)至少一种选自下组的多聚腺苷酸化信号序列:1类和III类，其中: I类选自下组:AATAAA，AATAAT，AACCAA，ATATAA，AATCAA，ATACTA，ATAAAA，ATGAAA，AAGCAT，ATTAAT，ATACAT，AAAATA，ATTAAA，AATTAA，AATACA，和 CATAAA ;且 III类选自下组:ATTTTT, TATTTT，TTATTT，TTTATT，TTTTTT，TTTTAT, AATTTT，TTTTTA,ATATAT, TAATTT, TTAATT,AAATTT,AAATAA,ATATTT,TTTGTT TTGTTT,ATTATT,ATTTTA,TTTAAT,和 TTTTAA，且 其中所述经密码子优化的DNA序列含有至少一种来自III类的多聚腺苷酸化信号序列，且其中所述合成DNA序列比所述蛋白质的天然DNA序列含有更少的III类多聚腺苷酸化信号序列，并且与所述天然DNA序列相比含有相同数目的I类多聚腺苷酸化信号序列。
8.权利要求7的合成DNA序列，其基本上没有III类多聚腺苷酸化信号序列。
9.权利要求7的合成DNA序列，其没有III类多聚腺苷酸化信号序列。
10.权利要求7的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码选自下组的天然蛋白质:杀虫蛋白、除草剂耐受性蛋白、应激耐受性相关蛋白、和油概况修饰蛋白。
11.权利要求10的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码杀虫蛋白。
12.权利要求10的合成DNA序列，其中所述合成DNA序列编码芳氧基链烷酸双加氧酶I蛋白°
13.一种选自下组的合成DNA序列:SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 11，SEQ ID NO: 17，SEQ IDNO:23, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:53, SEQ IDNO:59, SEQ ID NO:65,和 SEQ ID N0:71。
14.一种用于表达感兴趣蛋白质的DNA构建体，其包含5 ’非翻译序列、感兴趣蛋白质的编码序列、和3’非翻译区，其中所述5’非翻译序列含有植物细胞中有功能的启动子，所述编码序列是权利要求1的合成DNA编码序列，且其中所述3’非翻译序列包含转录终止序列和多聚腺苷酸化信号。
15.一种用于表达感兴趣蛋白质的DNA构建体，其包含5’非翻译序列、感兴趣蛋白质的编码序列、和3’非翻译区，其中所述5’非翻译序列含有植物细胞中有功能的启动子，所述编码序列是权利要求7的合成DNA编码序列，且其中所述3’非翻译序列包含转录终止序列和多聚腺苷酸化信号。
16.一种转基因植物，其含有权利要求1的合成DNA序列。
17.一种转基因植物，其含有权利要求7的合成DNA序列。
18.—种控制谷物或种子中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求5的合成DNA的植物获得所述谷物或种子。
19.一种控制谷物或种子中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求11的合成DNA的植物获得所述谷物或种子。
20.一种控制谷物或种子中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求5的合成DNA的植物获得所述谷物或种子。
21.一种控制粗粉(meal)或面粉(flour)中的有害生物的方法，其包括从含有权利要求5的合成DNA的谷物获得所述粗粉或面粉。
22.—种源自权利要求16的转基因植物的组合物，其中所述组合物是选自下组的商品:粗粉、面粉、蛋白质浓缩物、或油。
23.一种源自权利要求17的转基因植物的组合物，其中所述组合物是选自下组的商品:粗粉、面粉、蛋白质浓缩物、或油。
【文档编号】C12N5/04GK103597070SQ201280028762
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月13日 优先权日:2011年4月15日
【发明者】I.M.拉里努阿, D.J.默洛, A.S.雷迪, A.K.希拉马莱斯瓦米塞卡, A.T.伍斯利 申请人:陶氏益农公司