用于诊断和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供诊断猫科动物的甲状腺功能亢进的存在或风险的方法，所述方法包括测量在来自猫科动物的生物样品中的选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平：例如IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOX1、DUOX2(ThOX)、TGFB1、CSTD、DCN和SEPP1及其表达产物，其中相对于来自正常猫科动物或猫科动物群体的样品中的表达对照值或猫科动物的基线值，样品中一种或多种生物标志物表达的升高表明甲状腺功能亢进的存在或风险；治疗经所述诊断的猫科动物的方法；和用于实施所述方法的组合物、试剂和试剂盒。
【专利说明】用于诊断和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的组合物和方
法
发明领域
[0001]本发明涉及用于诊断和/或监测猫科动物的甲状腺功能亢进和与甲状腺功能亢进有关或由甲状腺功能亢进引起的猫科动物疾病和病症的组合物、材料和方法。[0002]发明背景
甲状腺功能亢进是猫科动物中最常见的激素异常。它最常见于老年猫科动物，在雌性中略微比雄性中更常见。甲状腺功能亢进是因甲状腺激素、特别是甲状腺素或T-4过量产生引起。T-4的过量产生显著提高动物的基础代谢率，导致体重减轻、食欲增加、烦燥、皮毛差、心动过速、饮水和排尿增加、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、发热、血压升高和最终的衰弱、精神萎靡、肌肉震颤、消瘦和死亡。晚期甲状腺功能亢进常与肾脏问题和心脏问题有关。有效治疗包括使用抑制甲状腺激素产生的药物(例如甲巯咪唑或卡比马唑)、破坏过度活跃的甲状腺细胞的放射性碘疗法和外科甲状腺切除术。然而，如果疾病发现得太晚，损害则可能是不可逆的。因此，早期诊断至关重要。
[0003]用于诊断甲状腺功能亢进最常见的试验是针对T-4的血液检验，其中T-4水平显著升高表明甲状腺功能亢进；或者T-3抑制试验，其测量T-4在响应给予T-3时的抑制，其中缺乏抑制表明甲状腺功能亢进状态。然而，猫科动物的T-3和T-4水平在每日过程中可波动，使得试验不可靠，而且还存在可能人为降低T-4水平的各种疾病，因此掩蔽了甲状腺功能亢进状态。使用锝的甲状腺放射性成像是可行的，并且可用于检测肿瘤或异常的甲状腺组织，但它却是昂贵的。
[0004]因此，需要检测猫科动物甲状腺功能亢进的高效且有效的备选方法。
[0005]已开发出研究差异基因表达的多种方法，例如DNA微阵列、表达标签测序(EST)、基因表达连续分析(SAGE)、扣除杂交、扣除克隆和mRNA差别显示(DD)、RNA任意引物PCR(RAP-PCR)、实时PCR (RT-PCR)、代表性差别分析(RDA)、二维凝胶电泳、质谱法和针对蛋白质的基于蛋白质微阵列的抗体结合。
[0006]由于参与甲状腺功能亢进的生物学途径和内在分子相互作用以及胞间信号转导过程的复杂性，十分需要了解遗传水平上发生的相互作用。猫科动物中甲状腺功能亢进早期阶段失调基因的检测有助于在全基因组基础上了解猫科动物甲状腺功能亢进的生物学，这将有助于设计用于确定甲状腺功能亢进的发展风险、确定甲状腺功能亢进的诱因、诊断甲状腺功能亢进以及设计和监测甲状腺功能亢进的治疗方案的方法。
[0007]更详细地了解涉及整个基因表达概况的生物学途径可有助于开发诊断程序、试剂和检验试剂盒以及疾病途径中的有益药物、营养药和营养品(膳食)的干预。这些方法能够早期检出并可能预防或治疗潜在的病症。参与甲状腺病症病理学的失调基因可用作重要的生物标志物，用于诊断和可能预防或治疗所述病症，并且优化合适药物、营养药和营养品(膳食)干预的选择。
[0008]可利用猫科动物中基因表达的水平和/或所表达的基因产物起作用的水平测定以选择用于治疗或预防用途的合适药剂。通过基因表达概况，技术人员可在选择作为预防或治疗猫科动物的肾病的药剂的合适药物时利用该数据。基因表达数据和分析还可用于通过利用指示肾功能健康状态的生物标志物，选择对促进正常甲状腺功能表现具有有益作用的营养组合物、膳食补充剂和营养药。
[0009]迄今在针对与猫科动物疾病诊断有关的基因表达概况筛选猫科动物基因组方面只进行了极有限的工作。尚未广泛进行在猫科动物健康群体相对于患有疾病(例如本说明书所述甲状腺功能亢进)的群体方面的研究。很少可获得有关猫科动物基因组表达概况、尤其有关猫科动物的肾病随时间推移而发展的数据。
[0010]甲状腺功能亢进是猫科动物死亡的主要原因。为了有效治疗甲状腺功能亢进，在对心脏和/或肾存在不可逆的损害之前，早期诊断和治疗是必要的。因此，需要更好的方法以鉴定患有甲状腺功能亢进或 甲状腺功能亢进风险升高的动物，使得它们可被适当治疗。
[0011]发明概述
本发明人研究了患甲状腺功能亢进的猫科动物的甲状腺组织和全血中的基因表达。在组织研究中，在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物之间发现1308个显著差异表达基因，其FDR (假发现率)=0.1，表达的倍数变化>=+/-1.25。在全血研究中，在甲状腺功能亢进的猫科动物和无甲状腺功能亢进的猫科动物间发现了 1094个显著基因，具有与上文所示的相同的截止值(cutoff)。在组织研究中，发现已知参与导致甲状腺激素产生的途径的所有基因在甲状腺功能亢进的猫科动物中上调。这些基因的表达增加显然促进猫科动物机体中的高T4产生。在全血研究中，发现60个基因与从实质组织材料中发现的那些基因重叠，其表现在与在组织研究中观察到的相同的方向上调节。如在全血以及在组织中的试验，通过使用这60个基因，可将甲状腺功能亢进的猫科动物与正常猫科动物区别开来。列于下表A和表B的这60个基因，可允许检测猫科动物甲状腺功能亢进。
[0012]因此，本发明提供用于诊断和/或监测猫科动物的甲状腺功能亢进和与甲状腺功能亢进有关或由甲状腺功能亢进引起的猫科动物疾病和病症的组合物、材料和方法，包括用于以下的组合物和方法:测定猫科动物的甲状腺功能亢进的发展风险、鉴定猫科动物的甲状腺功能亢进的诱因、诊断猫科动物的甲状腺功能亢进、设计和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的治疗方案和监测猫科动物的甲状腺功能亢进的状态，其中通过利用从获自所述猫科动物的生物试验样品中分离和测量的至少一种相关生物标志物，可检出甲状腺功能亢进，其中所述生物标志物的表达与所述疾病正相关或负相关。用于本发明的组合物和方法的实践的相关生物标志物包括存在于所述猫科动物的所述生物试验样品中的多核苷酸或蛋白质。用于本发明方法的实践的生物试验样品可包括例如来自所述猫科动物的组织样品。还可根据所进行的分泌，选择生物标志物，使得它们可在血清或血浆中或在尿液中检出。因此生物试验样品还可以是获自所述猫科动物的生物流体的样品，例如血液或尿液。
[0013]发现在甲状腺激素过量产生中特别上调的基因包括:
IYD (增加4.55倍):该基因编码催化一碘酪氨酸和二碘酪氨酸(其是甲状腺激素产生的卤化副产物)的氧化NADPH依赖性脱碘的酶。该蛋白质的N端起膜锚着点的作用。该基因的突变由于激素生成异常4型(其亦称为脱碘酶缺乏或碘酪氨酸脱卤素酶缺乏或甲状腺激素生成4型)所致，引起先天性甲状腺功能减退。
[0014]TG (增加2.02倍):甲状腺球蛋白(Tg)是一种主要由甲状腺产生的糖蛋白同二聚体。它起甲状腺素和三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine)的合成底物以及无活性形式的甲状腺激素和碘的储存的作用。甲状腺球蛋白自内质网分泌至其碘化部位，随后在滤泡腔中进行甲状腺素生物合成。该基因的突变引起甲状腺激素生成异常(表现为甲状腺肿)，并且与中度至重度先天性甲状腺功能减退有关。
[0015]SLC5A5, NIS (增加4.6倍):该基因编码钠葡萄糖协同转运蛋白家族的成员。编码的蛋白质负责组织(例如甲状腺和分泌乳汁的乳房组织)中碘的摄取。被甲状腺摄入的碘被掺入代谢调节剂三碘甲腺原氨酸(T3)和四碘甲腺原氨酸(T4)中。该基因的突变与甲状腺激素生成异常I有关。
[0016]TPO (增加4.06倍):该基因编码一种膜结合糖蛋白。编码的蛋白质起酶的作用，并且在甲状腺功能中起重要作用。该蛋白质在甲状腺球蛋白的酪氨酸残基的碘化和碘化酪氨酸对之间形成苯氧基酯中起作用以产生甲状腺激素、甲状腺素和三碘甲腺原氨酸。该基因的突变与甲状腺激素生成的几种病症有关，包括先天性甲状腺功能减退、先天性甲状腺肿和甲状腺激素有机化缺陷IIA。
[0017]TSHR (增加2.2倍):由该基因编码的蛋白质是一种膜蛋白，并且是甲状腺细胞代谢的主要控制器。编码的蛋白质是促甲状腺素(thyiOthiOpin)和甲状腺刺激素(thyrostimulin)的受体，并且其活性受腺苷酸环化酶介导。该基因的缺陷是几种类型的甲状腺功能亢进的原因。
·[0018]DU0X2, ThOX (增加1.55倍):由该基因编码的蛋白质是一种糖蛋白和NADPH氧化酶家族的成员。甲状腺激素的合成被位于甲状腺滤泡细胞顶端膜上的蛋白质复合物催化。该复合物含有碘化物转运蛋白、甲状腺过氧化物酶和包括该编码的蛋白质和DUOXl的过氧化物产生系统。已知该蛋白质为双重氧化酶，因为它具有过氧化物酶同源结构域和gp9 Iphox结构域两者。
[0019]在甲状腺功能亢进的猫科动物的血液和甲状腺组织两者中上调的其它基因包括下列基因:
表A
【权利要求】
1.一种诊断猫科动物中甲状腺功能亢进的存在或高风险的方法，所述方法包括测量在猫科动物的生物样品中选自以下的一种或多种生物标志物的表达水平:表A和表B所列的基因；IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl 和 DU0X2 (ThOX)中的任一种；及其表达产物，其中相对于来自正常猫科动物或猫科动物群体的样品中的表达对照值和/或相对于来自猫科动物之前的各个基线值，样品中一种或多种生物标志物表达的改变表明甲状腺功能亢进的存在或高风险。
2.权利要求1的方法 a.其中所述一种或多种生物标志物包括IYD、TG、SLC5A5、NIS、TP0、TSHR、DU0X1、DU0X2(ThOX)、TGFBl和/或CSTD或其表达产物，且其中相对于来自正常猫科动物或猫科动物群体的样品中的表达对照值和/或相对于来自猫科动物之前的各个基线值，样品中IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBl 和 / 或 CSTD 或其表达产物的表达增加表明甲状腺功能亢进的存在或高风险，和/或 b.其中所述一种或多种生物标志物包括DCN和/或SEPPl，或其表达产物；且其中相对于来自正常猫科动物或猫科动物群体的样品中的表达对照值和/或相对于来自猫科动物之前的各个基线值，样品中DCN和/或SEPPl或其表达产物的表达降低表明甲状腺功能亢进的存在或高风险。
3.权利要求1的方法，其中通过使用(i)包含与对应于待测量的一种或多种生物标志物的mRNA或cDNA互补的一种或多种寡核苷酸的DNA微阵列，或(ii)用对应于待测量的一种或多种生物标志物的mRNA或cDNA的寡核苷酸引物的定量聚合酶链式反应，测量一种或多种生物标志物的基因表达,来测定一种或多种生物标志物的表达水平。
4.权利要求3的方法，其中测量一种或多种生物标志物的基因表达的步骤包括:(i)从组织样品中分离RNA，(ii)反转录RNA，获得相应的cDNA，(iii)分离由此获得的cDNA并使之片段化，(iv)使cDNA片段与DNA微阵列接触，所述微阵列包含与对应于待测量的一种或多种生物标志物的cDNA互补的一种或多种寡核苷酸，和(V)检测cDNA片段和DNA微阵列中的一种或多种寡核苷酸之间的杂交。
5.权利要求4的方法，其中cDNA片段和DNA微阵列中的一种或多种寡核苷酸之间的杂交在严格条件下进行。
6.权利要求1的方法，其中通过所表达蛋白质的抗体，检测生物标志物的表达水平。
7.权利要求1的方法，其中通过使用定量质谱法测量样品中蛋白质的量，来检测生物标志物的表达水平。
8.权利要求1的方法，其中相对于正常或基线组织中表达的对照值，所述生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平为至少30%。
9.权利要求1的方法，其中将所述生物样品中一种或多种生物标志物的表达水平相对于已知具有相对稳定表达的一种或多种基因的表达归一化。
10.权利要求1的方法，其中测量来自相同样品的至少5种生物标志物的表达水平。
11.权利要求1的方法，其中所述生物样品是血液或甲状腺组织的样品。
12.—种治疗、改善或延迟甲状腺功能亢进进展的方法，所述方法包括通过权利要求1的方法诊断甲状腺病症的存在或高风险并通过饮食和/或药物处理所述病症。
13.权利要求13的方法，其中所述饮食是其中碘的水平小于0.35 mg/kg、硒的水平小于0.1 mg/kg和/或花生四烯酸的水平小于或等于0.02%的饮食。
14.权利要求13的方法，其中所述对有其需要的猫科动物的治疗包括给予有效量的抑制T-4产生的药物、给予放射性碘疗法和/或施行外科甲状腺切除术。
15.一种用于权利要求1的方法以诊断猫科动物中甲状腺功能亢进的存在或风险的试剂盒，其包含用于测量来自猫科动物的生物样品中选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DUOX2 (ThOX)、TGFB1、CSTD、DCN和SEPPl及其表达产物的一种或多种生物标志物的基因表达的工具，和 使用所述工具测量来自猫科动物的生物样品中的一种或多种生物标志物的表达并诊断猫科动物中甲状腺功能亢进的存在或风险的使用说明。
16.权利要求16的试剂盒，其中所述用于测量一种或多种生物标志物的工具包括能够检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针。
17.权利要求17的试剂盒，其包含DNA微阵列，所述DNA微阵列包含能够检测一种或多种生物标志物的基因表达的一种或多种核酸探针。
18.权利要求16的试剂盒，其中所述用于测量一种或多种生物标志物的工具包括能够检测一种或多种生物标志物的一种或多种抗体或适配体。
19.权利要求19的试剂盒，其为ELISA形式，所述试剂盒包含能够检测一种或多种生物标志物的一种或多种抗体、对应于所述生物标志物用作标准物的分离蛋白和缓冲液。
20.识别猫科动物蛋白质的抗体，所述蛋白质选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBU CSTD, DCN 和 SEPPl 的表达产物。
21.识别 猫科动物蛋白质的适配体，所述蛋白质选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBU CSTD, DCN 和 SEPPl 的表达产物。
22.分离和纯化的或重组的猫科动物蛋白质，所述蛋白质选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBU CSTD, DCN 和 SEPPl 的表达产物。
23.能够与猫科动物基因杂交的寡核苷酸探针，所述基因选自IYD、TG、SLC5A5、NIS、TPO、TSHR、DUOXl、DU0X2 (ThOX)、TGFBl、CSTD, DCN 和 SEPPl。
【文档编号】C12Q1/68GK103597097SQ201280029497
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年6月14日 优先权日:2011年6月15日
【发明者】S.阿尔-穆拉尼, 高向明 申请人:希尔氏宠物营养品公司