粘多糖贮积症和其它溶酶体病症的抗TNF-α疗法

粘多糖贮积症和其它溶酶体病症的抗TNF-α疗法
【专利摘要】本发明涉及通过施用用于酶替代疗法的试剂和用于抗TNF-α疗法的试剂；通过施用戊聚糖聚硫酸酯疗法；或通过施用底物减少疗法和抗TNF-α疗法治疗患有溶酶体病症的受试者的方法。本发明进一步涉及通过施用用于抗TNF-α疗法的试剂，减少通过酶替代疗法治疗的患有溶酶体病症的受试者的炎性细胞因子的方法。
【专利说明】粘多糖贮积症和其它溶酶体病症的抗TNF-α疗法
[0001]本申请要求2011年6月20日提交的美国临时专利申请序列号61 / 498，946和2011年12月12日提交的美国临时专利申请序列号61 / 569，452的权益，二者均据此通过引用整体并入。
[0002]本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权编号1R01DK087185下受政府支持而进行。政府具有本发明的某些权利。
【技术领域】 [0003]本发明涉及粘多糖贮积症和其它溶酶体病症的抗TNF-α疗法。
[0004]发明背景
[0005]溶酶体贮积症表示一类40种以上的不同遗传性疾病并且由溶酶体中存在的酶异常引起。患有溶酶体贮积症的个体根据所涉特定病症和特殊基因型呈现出许多临床症状。溶酶体贮积症相关的临床症状可对患病个体及其家人有破坏性的影响。例如，网状内皮组织疾病、中枢神经系统功能障碍、行为问题和严重智力迟钝是许多溶酶体贮积症的特征。在称为粘多糖贮积症(MPS)的特定溶酶体贮积症类别中，其它临床症状可包括骨骼异常、脏器肿大、角膜混浊和变形特征。
[0006]粘多糖贮积症(MPS)是一类导致葡糖胺聚糖(GAG)分解代谢有缺陷的11种不同的酶缺乙。Neufeld 等，The Mucopolysaccharidoses,在 Met細LIC 細 Moleculae BasisofInheritedDisease342 1-3452中(Scriver等编辑，McGraw-Hill) (2001)。由于这些遗传性酶缺陷，葡糖胺聚糖(GAG)在MPS患者的溶酶体和其它细胞内隔室以及细胞外结缔组织基质中逐渐累积。不出所料，在结缔组织器官，包括软骨、皮肤和骨中这些酶缺乏的主要临床后果最明显。主要临床特征包括面容和颅发育粗糙且异常、肢体短小、退行性关节病、气管和心脏瓣膜缺陷，和在一些情况下的神经系统牵连。患者通常天生没有可见的MPS临床特征，但是可发展进行性的临床牵连。在严重的情况下，患病儿童可能需要固定的医疗管理，但是仍然常常在青春期之前死亡。
[0007]另一种类型的溶酶体忙积症，尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease),也称为鞘磷脂沉积病，包括一类特征在于网状内皮系统的泡沫细胞浸润的病症。尼曼-匹克病中的泡沫细胞变得充满神经鞘磷脂并且，在较小程度上，充满其它膜脂质包括胆固醇。在A和B型疾病中尼曼-匹克病是由酶酸性神经鞘磷脂酶的失活引起，B型中残留酶活性更多(见 Kolodny 等，“Storage Diseases of the Reticuloendothelial System,，，在 Nathan 細?ski, s Hemat0Logy of Infancyand Childhqqd 弟 5 版，弟 2 卷中，1461_1507 (David G.Nathan 和 Stuart
H.0rkin编辑，ff.B.Saunders C0.) (1998))。尼曼-匹克病中主要器官系统的病理生理学可简要总结如下。脾是A和B型患者受最广泛牵连的器官。肺部在不同程度上受牵连，并且B型患者的肺病理是由于慢性支气管肺炎致命性的主要原因。肝牵连可变，但是严重患病患者可能患有危及生命的肝硬化、门静脉高血压和腹水。对淋巴结的牵连根据疾病的严重程度可变。中枢神经系统牵连区分了尼曼-匹克病的主要类型。虽然大部分B型患者未经历中枢神经系统牵连，但这是A型患者的特征。在尼曼-匹克病中肾脏受中度牵连。[0008]已经评估了几种方法对这些溶酶体贮积症的治疗，包括骨髓移植和酶替代疗法。已经证实骨髓移植在不同程度上有效，但是，当单独施用时，对骨和关节的作用有限。Clarke，LA, iiThe Mucopolysaccharidoses:A Success of Molecular Medicine，，，ExpertRev.Mol.Med.10:el(2008)o其也受到免疫抑制和清髓性药剂的有害副作用及移植物抗宿主病的发生妨碍。尽管这些复杂因素常常仍然显著，但是使用脐带血已经部分减轻了这些复杂因素。酶替代疗法牵涉静脉内输注重组酶，通常每周一次或两周一次。Clarke，LA, iiThe Mucopolysaccharidoses:A Success of Molecular Medicine，，，ExpertRev.Mol.Med.10:el(2008)o在很大程度上，酶替代疗法的有效性依赖于易于递送至网状内皮组织器官(例如，肝脏、脾)，但是较少递送至其它器官的输注酶的生物学分布。对于MPS病症而言，酶替代疗法可用于3种类型:MPS 1(赫尔勒/施艾氏综合征(Hurler / Schie Syndrome))(Wraith 等，“Mucopolysaccharidosis Type II (HunterSyndrome):A Clinical Review and Recommendatiohs For Treatment in the Eraof Enzyme Replacement Therapy，，，Eur.J.Pediatr.167:267-77 (2008) ；Cox-Brinkman等，“Ultrastructural Analysis of Dermal Fibroblasts in MucopolysaccharidosisType I !Effects of Enzyme Replacement Therapy and Hematopoietic CellTransplantation，”Ultrastruct.Pathol.34:126-32 (2010) ;Coppa 等，“Effect of6Yearsof Enzyme Replacement Therapy on Plasma and Urine Glycosaminoglycans inAttenuated MPS I Patients，，，Glycobiology20:1259-73 (2010)) ;MPS II(亨特氏综合征(Hunter Syndrome))(Glamuzina 等，“Treatment of Mucopolysaccharidosis TypeII(Hunter Syndrome)With Idursulfase:The Relevance of Clinical Trial EndPoints，” J.1nherit.Metab.Dis.(2011))；和 MPS VI (马-拉综合征(Maroteaux-LamySyndrome)) (Decker 等，“Enzyme Replacement Therapy for Mucopolysaccharidosis VI:Growth and Pubertal Development in Patients Treated With Recombinant HumanN-Acetylgalactosamine4_Sulfatase，” J.Pediatr.Rehabi1.Med.3:89-100 (2010)；Valayannopoulos 等，“Mucopolysaccharidosis VI Orphanet，，，J.Rare Dis.12:5 (2010)；McGill 等，“Enzyme Replacement Therapy for Mucopolysaccharidosis VI From8Weeksof Age-A Sibling Control Study，，，Clin.Genet.77:492-498 (2010))。已经在酶替代疗法后注意到生活质量显著改善，包括活动性、呼吸和关节灵活性改善。然而，很少或没有证据证明酶替代疗法直接影响MPS患者的软`骨和骨病，因此认为这些积极临床效应主要源自软组织变化(例如，腱)。还对MPS病症评估了其它实验疗法，包括基因疗法(Cotugno等，“Different Serum Enzyme Levels are Required to Rescue the Various SystemicFeatures of the Mucopolysaccharidoses，，，Hum.GeneTher.21:555-69 (2010) ；Herati等，“Radiographic Evaluation of Bones and Joints in MucopolysaccharidosisI and VII Dogs After Neonatal Gene Therapy，，，Mo I.Genet.Me tab.95:142-51 (2008))和使用与细胞特异性祀向序列融合的重组酶(Lu等，“Expression inCHO Cells and Pharmacokinetics and Brain Uptake in the Rhesus Monkey of anIgG-1duronate-2-Sulfatase Fusion Protein，，，Biotechnol.Bioeng.(2011) ；0sbom 等，“Minicircle DNA-Based Gene Therapy Coupled With Immune Modulation PermitsLong-term Expression of a -L-1duronidase in Mice With Mucopolysaccharidosis TypeI,”Mol.Ther.19:450-60 (2011))。
[0009]戊聚糖聚硫酸酯(PPS)是FDA批准口服药，其在几种疾病，包括溶酶体贮积症和更具体地MPS病症(本申请)以及关节炎、糖尿病、椎间盘退变和年龄相关的神经退行性疾病的动物模型中具有有效的抗炎和临床效应。当前批准PPS用于间质性膀胱炎患者，并且已经通过临床试验证明了其安全性。PPS抑制白细胞募集并且干扰趋化因子、细胞因子和生长因子的一些功能，从而减少炎症和活性氧簇(ROS)。
[0010]据信肿瘤坏死因子α (TNF-α)在各种病症中起重要作用，所述病症包括(例如)炎症(例如类风湿性关节炎)、克罗恩氏病(Crohn' s disease)、溃瘍性结肠炎和多发性硬化。已经非常详细地研究了 TNF-α和受体⑶120a、⑶120b。呈其生物活性形式的TNF-α为三聚体并且相邻亚基形成的沟对于细胞因子-受体相互作用很重要。已经研发了几种拮抗细胞因子作用的策略并且当前用于治疗各种疾病状态。
[0011]对TNF-α具有足够特异性和选择性的TNF-a抑制剂可能是预防或治疗病症的有效预防或治疗性药物化合物，其中已经暗示TNF-a为病原体。已经描述了借助于TNF-a抗体治疗中毒性休克(Rathjen等的欧洲专利N0.0486526)、肿瘤消退、抑制细胞毒性(Rathjen 等的美国专利 N0.6, 448, 380, Rathjen 等的美国专利 N0.6, 451, 983, Rathjen等的美国专利N0.6，498，237)、自身免疫性疾病例如RA和克罗恩氏病(Feldmann等的欧洲专利 N0.0663836,Aggarwal 等的美国专利 N0.5，672，347，Le 等的美国专利 N0.5，656，272)、移植物抗宿主反应(Aggarwal等的美国专利N0.5，672，347)、细菌性脑膜炎(Hector等的欧洲专利N0.0585705)的方法。先前的工作还已揭示了在MPS动物模型中炎症对软骨和骨病的重要影响，并且表明对敲除小鼠中Toll样受体4(TLR4)信号的基因抑制或TNF抑制剂与Naglazyme联合使用明显改善了软骨和骨病。然而目前没有可用药物对治疗溶酶体贮积症，特别是粘多糖贮积症和尼曼-匹克病完全有效。虽然在动物模型中有效，但是TNF抑制剂是可能导致显著副作用的静脉内用药，并且可能难以实现对MPS患者的长期使用。
`[0012]本发明目的是克服本领域的这些和其它不足。
[0013]发明概述
[0014]本发明的第一方面涉及治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法。这种方法包括选择患有溶酶体贮积症的受试者并且在治疗所选受试者的溶酶体贮积症有效的条件下，向所选受试者施用用于酶替代疗法的试剂和用于抗TNF-α治疗的试剂。
[0015]本发明的第二方面涉及减少通过酶替代疗法治疗的患有溶酶体贮积症的受试者的炎性细胞因子的方法。这种方法包括在减少所述受试者的炎性细胞因子有效的条件下，向受试者施用用于抗TNF-α治疗的试剂。
[0016]本发明的第三方面涉及治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法。这种方法包括选择患有溶酶体贮积症的受试者并且在治疗所选受试者的溶酶体贮积症有效的条件下，向所选受试者施用戍聚糖聚硫酸酯(PPS)。
[0017]本发明的第四方面涉及治疗有与溶酶体贮积症相关的骨骼病理的受试者的方法。所述方法包括选择有与溶酶体贮积症相关的骨骼病理的受试者并且在治疗受试者的溶酶体贮积症有效的条件下，向所选受试者施用用于底物减少疗法的试剂和用于抗TNF-α治疗的试剂。
[0018]虽然酶替代疗法(ERT)可用于几种溶酶体贮积症，但是这种治疗对骨骼系统的益处非常有限。先前的工作已经表明了 Toll样受体4 / TNF-α炎性途径在粘多糖贮积症(MPS)骨骼病理中的重要性，并且因此，本发明检查了在VI型MPS的大鼠模型中联合抗TNF- α疗法与ERT的附加益处。这样做时，用Naglazyme? (重组人N-乙酰基-半
乳糖胺-4-硫酸酯酶)或通过联合方法使用Naglazymeii^p大鼠特异性抗TNF-α药物CNTO1081处理MPS VI大鼠8个月。两种方法均导致TNF- α和核因子κ -B配体的受体激活剂(RANKL)的血清水平明显降低，并且联合治疗减少了关节软骨中的TNF-α。对培养的关节软骨细胞的分析表明，联合疗法还恢复了胶原蛋白IIAl表达，并且减少了凋亡标志PARP的表达。通过ERT改善了运动活性和活动性，并且这些通过联合治疗显著增强。通过联合疗法改善了 MPS VI动物的气管畸形，并且骨长度有适度改善。气管中的神经酰胺水平明显降低。MicroCT(显微CT)分析并未证明来自任一治疗对骨微结构的任何显著积极效应，骨生长板也没有组织学改善。本发明的结果证明，联合ERT与抗TNF-α疗法改善了治疗效果并且导致显著临床益处，并且抗TNF-α疗法一起改善了经改善的治疗效果并且也导致显著临床益处。结果还进一步验证了 TNF-α、RANKL和其它炎性分子作为溶酶体贮积症(包括MPS病症)的生物标志的有用性。
[0019]过去几年，本发明的研究人员一直在研究MPS动物模型中的关节和骨病理，长期目标是研发单独或连同ERT、BMT或基因疗法一起的改进疗法(Simonaro等，“Bone Marrow Transplantation in Newborn Rats With MucopolysaccharidosisType VI !Biochemical，Pathological，and Clinical Findings，，，Transplantation63:1386-93 (1997) ;Simonaro等，“Articular Chondrocytes From Animals With a DermatanSulfate Storage Disease Undergo a High Rate of Apoptosis and Release NitricOxide and Inflammatory Cytokines:A Possible Mechanism UnderlyingDegenerativeJoint Disease in the Mucopolysaccharidoses，，，Lablnvest1.81:1319-1328 (2001)；Simonaro 等，“Joint and Bone Disease in Mucopolysaccharidosis VI and VII:Identification of New Therapeutic Targets and Biomarkers Using AnimalModels,^ Pediatr.Res.57:701-707 (2005)，其全部据此通过引用整体并入)。作为这项正在进行的研究的一部分， 已经鉴定了 MPS动物模型中的许多异常，包括MPS关节软骨细胞的死亡(凋亡)增加、MPS滑膜成纤维细胞过度增殖和MPS生长板的组织破坏。研究人员已经发现，向正常关节软骨细胞的培养基中添加GAG诱导凋亡和炎性标志的释放，表明GAG贮积本身可能是MPS病症中的引发性、促炎性事件(SimonaiO等，“Mechanism of Glycosaminoglycan-Mediated Bone&Joint Disease:1mplications forthe Mucopolysacchafidoses&Other Connective Tissue Diseases，，’Amer.J.Path.172:112-122(2008)，其据此通过引用整体并入)。MPS细胞中的GAG贮积还导致Toll样受体4(TLR4)信号途径的激活，引起TNF-α和其它炎性细胞因子的释放。
[0020]因此，本发明使MPS小鼠(MPS VII，Sly疾病)与TLR4敲除小鼠交配，并且发现双敲除MPS动物的TNF-α、ILl-β、RANKL和其它细胞因子明显减少，骨生长改善且骨生长板更加有组织并且软骨细胞死亡减少(Simonaro等，“Involvement of the Toll-LikeReceptor4Pathway and Use of TNF-Alpha Antagonists for Treatment of theMucopolysaccharidoses, ” Proc.Natl.Acad.Sc1.107:222-7 (2010)，其据此通过引用整体并入)。这使研究人员在MPS VI大鼠中使用CNT0i08i，Remicade?的大鼠特异性等效物，FDA批准的用于关节炎和其它炎症性疾病中的抗TNF- α单克隆抗体对抗TNF- α疗法进行初步分析(Weaver,AL,“Efficaey and Safety of the Ant1-TNF Biologic Agents, ^od.Rheumatol.14:101-112 (2004)，其据此通过引用整体并入)。在该研究中，发现CNT0181治疗降低了 MPS VI动物的炎性细胞因子水平，并且还减少了凋亡性关节软骨细胞的数量。然而，对骨生长没有影响或运动活性没有临床改善。在本发明中，已经在MPS VI大鼠中扩展了那些发现并且评估了抗TNF-α和联合ERT /抗TNF-α方法。发现抗TNF-α方法和联合ERT /抗TNF-α方法提供了胜过单独ERT的几种益处。这些包括步态和运动活性改善、气管更薄、畸形更少及骨适度更长。在关节软骨中胶原蛋白IIAl表达也恢复，并且凋亡减少。
[0021]本申请基于的基本前提是:(a)溶酶体贮积症例如MPS所需的新疗法将改善对软骨和骨(包括脊柱)的治疗；(b)必须在人类使用之前在适当动物模型中验证这些疗法；和(C)治疗时疾病的严重程度将对功效有重大影响。
[0022]本发明还提出，PPS可能是MPS的首种口服药，并且也可能是对这些病症中的软骨和骨病有重大影响的首种治疗。这种假设基于:(a)证明炎症在MPS软骨和骨病的病理生理学上的重要作用的先前研究；(b)PPS对炎症和软骨形成的已知效应；和(c)在一种MPS (MPSVI，马-拉病)的大鼠模型中使用PPS的早期初步数据。考虑到PPS已经通过安全试验并且经FDA批准，也可基于本发明提出的动物模型研究“快速跟踪”其在MPS患者中的用途。需要注意的是，因为预计PPS不会增强残留酶活性或导致MPS患者的GAG减少，所以在这些病症中其使用可与ERT联合。PPS也可单独用于治疗溶酶体贮积症。PPS是肝素样GAG分子。因此，预计不会为是GAG贮积病的MPS病症或其它溶酶体贮积症提供益处。实际上，在本发明的教导之 前，可能已经预计到PPS会使这些病症恶化。本发明首次教导，尽管事实是PPS为GAG样分子，但是其的确对MPS和其它溶酶体贮积症提供了实质性益处。
[0023]总之，对软骨和骨病的治疗表示了溶酶体贮积症例如MPS中未满足的重要医疗需要，并且本发明可对溶酶体贮积症患者，特别是患有MPS的患者的治疗和照料有重大且迅速的影响。
[0024]附图简述
[0025]图1A-1C说明了 ERT和联合ERT /抗TNF-α疗法在MPS VI大鼠中的抗炎作用。图1A中，MPS VI大鼠接受ERT (黑色)或联合ERT /抗TNF- α (灰色)治疗8个月(η=8只/组)。使用抗TNF-α的抗体(CNT01081)进行抗TNF-α疗法。最后一次注射2天后使动物安乐死并收集血清。还收集年龄匹配(37周)的正常(浅灰色)和未经治疗的MPS
VI(白色)血清，并且使用免疫测定试剂盒测定TNF- α和RANKL水平(见以下实施例)。如先前所示，未经治疗的MPS VI动物这两种炎症标志的水平明显升高，并且二者通过ERT或联合治疗显著减少(*Ρ〈0.005)。在两种治疗方法之间未观察到显著差异。图1B中，未经治疗的MPS VI大鼠与正常动物相比，表现出关节软骨中TNF-α免疫染色(红色)明显提高，其通过ERT适度减少并且通过联合治疗标准化。图1C中，在未经治疗的MPS VI和经ERT治疗的滑膜中，有绒毛(SV)形成和滑膜浸润至软骨下骨(箭头，SB)的增生性滑膜(*)明显。虽然贮积细胞仍存在，但是经联合疗法治疗的动物表现出明显更少的关节炎症。
[0026]图2A-2B示出了未经治疗和经治疗的MPS VI大鼠的运动活性和步态分析。图2A中，MPS VI大鼠接受ERT (箱形)或联合ERT /抗TNF-α (圆形)治疗8个月(η=8只/组)。使用抗体CNTO1081进行抗TNF-α疗法。最后一次注射2天后，它们接受3个不同速度下的加速转棒分析，并且将其表现与未经治疗、年龄和性别匹配的MPS VI动物(三角形)做比较。在10RPM下，两组经治疗的大鼠留在转棒上的时间最长(180秒)，明显比未经治疗的动物长(ρ〈0.005)。速度越高这种趋势变得越明显，并且ERT和联合组之间也存在显著区别(Ρ*〈0.005)。绘制了单个动物的时间，并且用水平线指出每一组的平均值。图2Β中，治疗后动物还接受了步态分析。使用两种不同颜色的食用色素标记大鼠走过管道的前爪和后爪，并且由爪印测量了脚步间的距离和脚步角度。每只大鼠测试至少3次，并且图2Α-2Β中示出了平均爪印值的总结。可以看出，对于ERT和联合治疗动物而言，后爪移动角度从60° (未经治疗)分别减小到45° (与未经治疗相比ρ=0.004)和30° (与未经治疗相比P=0.0001)。另外,动物每一步可移动其前爪的距离从2.8cm(未经治疗)增加到4.2cm并且在联合治疗组(P=0.03)中显著地增加到5.1cm0在ERT组中动物移动其后爪的距离不变，并且在联合组中仅适度增加(从4.9至5.1cm)。
[0027]图3A-3C示出了未经治疗和经治疗的MPS VI大鼠的骨长度和微结构。图3A中，MPS VI大鼠接受ERT (黑色)或联合ERT /抗TNF- α (灰色)治疗8个月(η=8只/组)。用抗体CNT01081进行TNF- α疗法。最后一次注射2天后使动物安乐死，并且收集股骨和胫骨进行miciOCT分析。将结果与未经治疗、年龄和性别匹配的MPS VI大鼠(白色)比较，并且将值表示为正常对照的百分比。ERT并未增加股骨或胫骨的长度，而联合法分别导致~6和14%的增加。需要注意的是，与未经治疗的MPS VI组中的74和77%相比，联合治疗组中的胫骨和股骨平均为正常的~88和84%。图3B示出了冠状面的microCT分析。在未经治疗和经治疗的MPS VI大鼠中，干骺端骨中的骨小梁密度减小，长骨体生长板变形并且断裂，并且相对于正常股骨 ，骺骨小梁紊乱。检测到由于联合疗法的轻微改善。图3C是对股骨中间骨干区域的microCT分析，显示轴位有皮层下骨小梁浸润至髓隙。虽然在治疗后注意到骨小梁浸润有所减少，但是这些不可通过定量度量确认。
[0028]图4A-4B说明了未经治疗和经治疗的MPS VI大鼠的气管缺损。图4A中，在研究结束时(37周龄)从经治疗(用抗体CNT01081)和未经治疗的MPS VI和正常动物收集气管。如该代表性图所说明，未经治疗的MPS VI大鼠的气管明显增厚并且异常、萎陷，内部开口狭窄、扁平。这些异常通过ERT未改变，但是通过联合治疗明显改善，导致气管变圆，横切面面积几乎统计标准化。图4B是对气管的免疫组织化学分析，显示在未经治疗和经ERT治疗的动物(红色)的上皮细胞中，促炎性和促凋亡神经鞘脂(神经酰胺)的表达增加，与炎症性疾病的发生一致。来自联合治疗组的气管显示出几乎正常的神经酰胺表达。
[0029]图5A-5B示出了来自未经治疗和经治疗的MPS VI大鼠的关节软骨细胞中的蛋白质表达。图5A中，MPS VI大鼠接受ERT或联合ERT /抗TNF-α治疗8个月(η=8只/组)。使用抗体CNT01081进行抗TNF- α疗法。最后一次注射2天后使动物安乐死，并且分离和处理关节软骨细胞进行蛋白质印迹(图5Α)。如该代表性实验所示，单独ERT增加胶原蛋白X的表达，并且在更适度的程度上增加胶原蛋白IIAl的表达。除胶原蛋白IIAl表达水平更加明显外，在联合治疗组中看到类似观察结果。为确认这些观察结果，对来自未经治疗、经ERT治疗和联合治疗动物的关节软骨部分进行了胶原蛋白IIAl的免疫荧光显微分析(图5Β)。如图5Β所示，与正常类似，在联合治疗组中存在更高的胶原蛋白IIAl表达(红色)。还通过蛋白质印迹检查了经治疗和对照动物中凋亡标志PARP的表达，并且仅通过联合治疗减少。另外，通过两种治疗方法减少了在MPS VI中升高的聚蛋白多糖酶(aggrecanase)ADAMT S5的水平。
[0030]图6A-6D示出了经PPS治疗的MPS VI大鼠的结果。维持MPSVI大鼠正常供水(图6A)或含有25mg /天PPS的水(n=6只/组)(图6B)。治疗开始时动物为6月龄，并且进行治疗3个月。在治疗结束时拍摄颅骨和吻部图像。示出了代表性图像。图6C中示出了吻长，而图6D中示出了颅骨长度。还由每只动物的放射照片确定了颅骨长度和宽度测量，并用柱状图示出了数据(图6C、6D)。白色=正常9月龄，灰色=正常供水的MPS VI大鼠；蓝色=接受了 PPS的MPS VI大鼠。*=ρ〈0.01。
[0031]图7A-7F示出了正常大鼠(图7A、7D)、经PPS治疗的MPS VI大鼠(图7C、7F)和未经PPS治疗的MPS VI大鼠(图7B、7E)的颅骨放射照片(图7A、7B、7C)和microCT图像(图7D、7E、7F)。维持MPS VI大鼠正常供水或含有25mg /天PPS的水(n=6只/组)。治疗开始时动物为6月龄，并且进行治疗3个月。上图示出了放射照片(图7A、7B、7C)，并且下图为microCT图像(图7D、7E、7F)。与未经治疗的MPS VI相比，在经PPS治疗的MPS VI大鼠中发现更长的吻部和更薄的颅骨。放射照片中的线供参考。由这些放射照片测量了图6A-6D中示出的关于颅骨长度和宽度的定量数据。
[0032]图8A-8F示出了正常大鼠(图8A、8B)、经PPS治疗的MPS VI大鼠(图8E、8F)和未经PPS治疗的MPS VI大鼠(图8C、8D)的示出牙列变化的microCT图像。维持MPS VI大鼠正常供水或含有25mg /天PPS的水(n=6只/组)。治疗开始时动物为6月龄，并且进行治疗3个月。未经治疗的MPS VI大鼠具有长得太大导致与正常大鼠相比牙齿排列异常的门牙(箱形)。通过PPS治疗矫正了下颚和不整齐。
[0033]图9描绘了用和未用PPS的MPS VI大鼠的转棒分析。保持6月龄的MPS VI大鼠用或不用PPS3个月(n=6只/组`)，并且在处死之前使用加速转棒装置分析。灰色=正常供水的MPS VI大鼠；蓝色=接受了 PPS的MPS VI大鼠。注意到经治疗的MPS VI大鼠可留在转棒上的时间比未经治疗的大鼠长2倍以上。*=p〈0.02。
[0034]图10A-10B说明了经PPS治疗和未经治疗的大鼠的免疫组织化学分析。图1OA是经PPS治疗的MPS VI大鼠中肝脏和脾的免疫组织化学分析，与未经治疗、年龄匹配的9月龄MPS动物相比，显示出TNF- α表达降低。图1OB中，在经PPS治疗的动物中血清TNF水平也降低。
[0035]图1IA-1IC示出了经治疗和未经治疗的MPS VI大鼠中的血清炎症标志。在6个月(浅灰色)、I个月(深灰色)或产前(黑色)开始用PPS治疗3组MPS VI大鼠。在9月龄时处死所有动物。因此治疗持续时间分别为3个月、8个月或9.75个月。通过ELISA测定测量几种炎症标志的血清水平，并且与正常(阴影)或未经治疗的MPS VI动物(白色)比较。Ν=6只/组。图1lA中示出了炎症标志MIP-1a的血清水平，而图1lB中示出了标志Rantes的水平并且图1lC中示出了 TNF-α的水平。与未经治疗的MPS VI大鼠相比，所有治疗组的这些炎症标志的水平显著降低(〈0.001)。
[0036]图12A-12C示出了在I月龄时MPS VI大鼠的治疗结果。图12Α和12Β中，I月龄MPS VI大鼠维持正常供水或含有25mg /天PPS的水8个月(n=6只/组)。示出了代表性图像。箭头指出了未经治疗的动物中眼部卟啉分泌、宽大的颅骨和吻部及小耳朵，在经治疗的动物中明显改善。图12C中，在加速转棒装置上测试动物。在20RPM下经治疗的MPSVI大鼠可留在转棒上的时间比未经治疗的大鼠长2倍以上。另外，在高达35RPM (正常的60%)的速度下仅正常和经治疗的大鼠能够留在转棒上。
[0037]图13说明了经PPS治疗的MPS VI大鼠的气管。在6个月、I个月和产前开始用PPS治疗第1、2和3组动物。在9个月时将其处死并分离气管。图像显示，与正常的相比，未经治疗的MPS VI大鼠的气管萎陷，并且这在所有PPS治疗组中有所改善。
[0038]图14A-14C示出了对经治疗(6月龄)和未经治疗的MPS VI大鼠的脊椎病的评估。图14A示出了正常对照(左侧)和MPS VI (右侧)动物的藏红(Safranin) -O /快绿染色。图14B说明了腰椎运动节段的生物力学结果，表明MPS动物具有较低中性区刚度和压缩蠕变时间常数，并且表示胶原蛋白完整性和GAG功能削弱。图14C示出了对照、MPS和经治疗(T)组的矢状面放射照片，表明对于MPS而言椎间盘高度指数(DHI，定义为通过2相邻椎骨的平均高度标准化的椎间盘高度)高于对照，并且对骨骼成熟动物(6月龄)的PPS治疗并不影响该参数，引起早期干预。
[0039]图15示出了对经PPS治疗的MPS VI大鼠中的关节软骨细胞的分析。在6个月、I个月和产前开始用PPS治疗第1、2和3组动物。在9个月时将其处死，分离并培养关节软骨细胞3周。然后通过蛋白质印迹法对其分析。注意到，与正常相比，在MPS VI大鼠软骨细胞中炎症标志TNF- α、Ρ38和Cox_2升高，并且在经治疗的MPS VI大鼠中这些水平降至正常。ADAMTS-5是在未经治疗的MPS VI大鼠软骨细胞中也升高并且在MPS VI治疗组中减少的降解蛋白聚糖的聚蛋白多糖酶。
[0040]图16示出了经PPS治疗的尼曼-匹克病小鼠的转棒分析。在I月龄时开始用PPS治疗I月龄尼曼-匹克病小鼠(酸性神经鞘磷脂酶敲除型)持续3个月(25mg / kg/天)。然后使用设为20RPM的加速转棒装置对其分析。经PPS治疗的NPD小鼠表现得明显比未经治疗的NPD小鼠更好(p〈0.01)。两组仍显著低于野生型。
`[0041]发明详述
[0042]本发明的第一方面涉及一种治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法。这种方法包括选择患有溶酶体贮积症的受试者并且在治疗所选受试者的溶酶体贮积症有效的条件下，向所选受试者施用用于酶替代疗法的试剂和用于抗TNF-α治疗的试剂。
[0043]根据本发明所述的溶酶体贮积症是其中由于溶酶体酶缺乏而发生溶酶体酶底物存在或积累，以致产生不良影响(例如，底物异常积累或异常底物生成)的任何病症。可生成异常量的溶酶体酶(例如，酶可能在受试者中根本不表达，可能低水平表达或可能高水平表达)或可能(例如)由于突变或不适当的蛋白质折叠而功能异常。根据本发明所述的溶酶体酶是细胞溶酶体隔室内所含的，使其中所含细胞副产物代谢的任何水解酶。如本文所使用的底物指一种或多种溶酶体酶的溶酶体底物。未对要通过本发明的方法治疗的溶酶体贮积症强加特殊限制，只要溶酶体贮积症是本领域同样公认的病症。
[0044]本发明的溶酶体贮积症可细分为下列疾病状态:神经鞘脂贮积症、粘多糖贮积症、糖蛋白贮积症、粘脂贮积症、II型糖原贮积症、蜡样脂褐质沉积症和属于“其它”类别的疾病状态(Caillaud 等，“Gene Therapy in Lysosomal Diseases,，，Biomed.Pharmacother.54:505-12 (2000) ;Nathan 和 Oski,Hematqlqgy qF Infancy and Childhqqd,第 35 章，W.B.Saunders (2003),二者据此通过引用整体并入)。几乎所有溶酶体贮积症均为常染色体隐性。对此两个著名的例外是为X连锁的法布里病(Fabry' s Disease)和亨特氏综合征(Hunter, s Syndrome)(Blazar等的美国专利申请20070009500，其据此通过引用整体并入)。
[0045]本发明的溶酶体贮积症可包括但不限于神经鞘脂贮积症、粘多糖贮积病(粘多糖贮积症)、糖蛋白贮积症、粘脂贮积症、II型糖原贮积症、蜡样脂褐质沉积症和其它溶酶体蛋白功能异常。更具体地，所述病症可为但不限于GMl神经节苷脂沉积症(Landing病)、GM2神经节苷脂沉积症变型B / BI (戴撒氏病(Tay-Sach' s disease))和变型O (山德霍夫氏病(Sandhoff' s disease))、异染性脑白质病变、克拉伯病(Krabbe ' sdisease)、法布里病、高歇氏病(Gaucher ' s disease)、尼曼-匹克病(A、B、C)、法布里病、沃尔曼氏病(Wolman' s disease)、奥斯汀氏病(Austin, s disease)、I型粘多糖忙积症(赫尔勒氏病(Hurler' s disease)或赫尔勒氏综合征)、施艾氏症(Scheie' sdisease)、赫尔勒-施艾氏症(Hurler-Scheie' s disease)、11 型(亨特氏症(Hunter, sdisease) )、III 型(沙费利波氏症(Sanfilippo ' s disease)、IIIA-D 型、IV 型(莫基奥氏症(Morquio ' s disease))、IVA 和 B 型、VI 型(马-拉氏症(Maroteaux-Lamy ' sdisease))、VII型(Sly病)、IX型、致密性成骨不全症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、岩藻糖苷贮积症、ct -甘露糖苷忙积症、β -甘露糖苷忙积症、Schindler病(Schindler' s disease)、Kanzaki病(Kanzaki ' s disease)、粘脂忙积症I型(唾液酸忙积症)、IB型(半乳糖唾液酸贮积症)及I1、III和IV型(粘脂贮积症)、II型糖原贮积症(特征在于庞普氏病(Pompe ' s disease))、桑-哈二氏症(Santavuor1-Haltia disease)、詹-比二氏病(Jansky-Bielshowsky disease)、贝敦氏症(Batten disease)、库夫斯病(Kufs disease)、特征在于CLN5、CLN6、CLN7和CLN8基因座突变的疾病状态和/或其它溶酶体贮积病，例如唾液酸贮积病(婴幼儿形式，扎拉病(Salla disease))和甲基丙二酸尿症(Blazar等的美国专利公布N0.2007 / 0009500 ;0kamura等的美国专利N0.7，951，545，二者据此通过引用整体并入)。
[0046]在本发明的一个实施方案中，溶酶体贮积症为神经鞘脂贮积症，其中神经鞘脂贮积症为尼曼-匹克病，神经鞘磷脂积累的一种疾病。B型尼曼-匹克病是由于酸性神经鞘磷脂酶阻碍而C型尼曼-匹克病 是由于胆固醇酯化缺陷。神经鞘脂贮积症的其它实例包括下列疾病，但是不限于这些疾病=GM1神经节苷脂沉积症(Landing病；β -半乳糖苷酶缺乏)、GMji经节苷脂沉积症变型B / BI (戴撒氏病；氨基己糖苷酶A缺乏)和变型0(山德霍夫氏病，己糖胺酶A和B缺乏)、异染性脑白质病变(芳基硫酸酯酶A缺乏)、克拉伯病(半乳糖神经酰胺酶缺乏)、法布里病(α-半乳糖苷酶缺乏)、高歇氏病(β-葡萄糖苷酶缺乏)、尼曼-匹克病(A、B、C ;神经鞘磷脂酶缺乏)、法布里病(神经酰胺酶缺乏)、沃尔曼氏病(酸性脂肪酶缺乏)和奥斯汀氏病(多种硫酸酯酶缺乏)。(Blazar等的美国专利公布N0.2007 / 0009500，其据此通过引用整体并入)。
[0047]在本发明的另一实施方案中，溶酶体贮积症为粘多糖贮积症。如本文所使用的术语粘多糖贮积症(MPS)指特征在于溶酶体中GAG积累和贮积的溶酶体贮积症的一个亚类。在一个特定实施方案中，根据本发明所述的粘多糖贮积症可包括MPS 1(赫尔勒/施艾氏综合征)、MPS II (亨特氏综合征)、MPS VI(马-拉综合征)、MPS 111(沙费利波综合征(Sanfilippo Syndrome) )、MPS IV (莫基奥综合征(Morquio Syndrome))和 / 或 MPSVII (Sly病)。表1中列出的可通过本发明的方法治疗的1-1X型粘多糖贮积症和缺乏酶类别的另外的实例包括以下表1所列实例(Okamura等的美国专利N0.7，951, 545,其据此通过引用整体并入)。
[0048]表1-粘多糖贮积症的类别
[0049]
【权利要求】
1.一种治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法，所述方法包括: 选择患有溶酶体贮积症的受试者并且 在治疗所选受试者的溶酶体贮积症有效的条件下，向所选受试者施用用于酶替代疗法的试剂和用于抗TNF-α治疗的试剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中用于酶替代疗法的所述试剂选自阿糖脑苷酶、伊米苷酶、葡糖脑苷脂酶α、拉罗尼酶、半乳糖苷酶β、加硫酶、重组阿葡糖苷酶α、Ν_乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶和艾度硫酸酯酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中用于抗TNF-α疗法的所述试剂选自英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗和那他珠单抗。
4.根据权利要求1所述的方法，其中用于抗TNF-α疗法的所述试剂为戊聚糖聚硫酸酯(PPS)。
5.根据权利要求1所述的方法，进一步包括: 施用附加疗法。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述附加疗法选自骨髓移植、伴侣疗法和基因疗法。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体贮积症选自神经鞘脂贮积症、粘多糖贮积病(粘多糖贮积症)、糖蛋白贮积症、粘脂贮积症、II型糖原贮积症、蜡样脂褐质沉积症和其它溶酶体蛋白功能异常。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为神经鞘脂贮积症，所述神经鞘脂贮积症为尼曼-匹克病。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为粘多糖贮积症，所述粘多糖贮积症为MPS I (赫尔勒/施艾氏综合征)、MPS II(亨特氏综合征)、MPS VI (马-拉综合征)、MPS 111(沙费利波综合征)、MPS IV(莫基奥综合征)或MPS VII (Sly病)。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到黏膜上进行。
11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括: 重复所述施用。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为婴幼儿或青少年。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者为成人。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有与溶酶体贮积症相关的骨骼病理。
15.一种减少通过酶替代疗法治疗的患有溶酶体贮积症的受试者的炎性细胞因子的方法，所述方法包括: 在减少所述受试者的所述炎性细胞因子有效的条件下，向所选受试者施用用于抗TNF-α治疗的试剂 。
16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括: 选择具有与溶酶体贮积症相关的骨骼病理的受试者接受所述施用。
17.根据权利要求15所述的方法，其中用于酶替代疗法的所述试剂选自阿糖脑苷酶、伊米苷酶、葡糖脑苷脂酶α、拉罗尼酶、半乳糖苷酶β、加硫酶、重组阿葡糖苷酶α、Ν_乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶和艾度硫酸酯酶。
18.根据权利要求15所述的方法，其中用于抗TNF-α疗法的所述试剂选自英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗和那他珠单抗。
19.根据权利要求15所述的方法，其中用于抗TNF-α疗法的所述试剂为戊聚糖聚硫酸酯(PPS)。
20.根据权利要求15所述的方法，进一步包括: 施用附加疗法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述附加疗法选自骨髓移植、伴侣疗法和基因疗法。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶酶体贮积症选自神经鞘脂贮积症、粘多糖贮积病(粘多糖贮积症)、糖蛋白贮积症、粘脂贮积症、II型糖原贮积症、蜡样脂褐质沉积症和其它溶酶体蛋白功能异常。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为神经鞘脂贮积症，所述神经鞘脂贮积症为尼曼-匹克病。
24.根据权利要求15所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为粘多糖贮积症，所述粘多糖贮积症为MPS I (赫尔勒/施艾氏综合征)、MPS II(亨特氏综合征)、MPS VI (马-拉综合征)、MPS 111(沙费利波综合征)、MPS IV (莫基奥综合征)或MPS VII (Sly综合征)。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉`内注射、动脉内注射、肌内注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到黏膜上进行。
26.根据权利要求15所述的方法，进一步包括: 重复所述施用。
27.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者为婴幼儿或青少年。
28.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者为成人。
29.一种治疗患有溶酶体贮积症的受试者的方法，所述方法包括: 选择患有溶酶体贮积症的受试者并且 在治疗所选受试者的溶酶体贮积症有效的条件下，向所选受试者施用戊聚糖聚硫酸酯(PPS)。
30.根据权利要求29所述的方法，进一步包括: 施用附加疗法。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述附加疗法选自骨髓移植、伴侣疗法和基因疗法。
32.根据权利要求29所述的方法，所述溶酶体贮积症选自神经鞘脂贮积症、粘多糖贮积病(粘多糖贮积症)、糖蛋白贮积症、粘脂贮积症、II型糖原贮积症、蜡样脂褐质沉积症和其它溶酶体蛋白功能异常。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为神经鞘脂贮积症，所述神经鞘脂贮积症为尼曼-匹克病。
34.根据权利要求29所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为粘多糖贮积症，所述粘多糖贮积症为MPS I (赫尔勒/施艾氏综合征)、MPS II(亨特氏综合征)、MPS VI (马-拉综合征)、MPS 111(沙费利波综合征)、MPS IV (莫基奥综合征)或MPS VII (Sly病)。
35.根据权利要求29所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到黏膜上进行。
36.根据权利要求29所述的方法，进一步包括: 重复所述施用。
37.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者为婴幼儿或青少年。
38.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者为成人。
39.根据权利要求29所述的方法，其中所述受试者具有与溶酶体贮积症相关的骨骼病理。
40.一种治疗具有与溶酶体贮积症相关的骨骼病理的受试者的方法，所述方法包括: 选择具有与溶酶体 贮积症相关的骨骼病理的受试者并且 在治疗所述受试者与溶酶体贮积症相关的骨骼病理有效的条件下，向所选受试者施用用于底物减少疗法的试剂和用于抗TNF- α治疗的试剂。
41.根据权利要求40所述的方法，其中用于底物减少疗法的所述试剂选自美格鲁特和Eliglustat0
42.根据权利要求40所述的方法，其中用于抗TNF-α疗法的所述试剂选自英夫利昔单抗、阿达木单抗、依那西普、戈利木单抗和那他珠单抗。
43.根据权利要求40所述的方法，其中用于抗TNF-α疗法的所述试剂为戊聚糖聚硫酸酯(PPS)。
44.根据权利要求40所述的方法，进一步包括: 施用附加疗法。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述附加疗法选自酶替代疗法、骨髓移植、伴侣疗法和基因疗法。
46.根据权利要求40所述的方法，其中所述溶酶体贮积症选自神经鞘脂贮积症、粘多糖贮积病(粘多糖贮积症)、糖蛋白贮积症、粘脂贮积症、II型糖原贮积症、蜡样脂褐质沉积症和其它溶酶体蛋白功能异常。
47.根据权利要求40所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为神经鞘脂贮积症，所述神经鞘脂贮积症为尼曼-匹克病。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述溶酶体贮积症为粘多糖贮积症，所述粘多糖贮积症为MPS I (赫尔勒/施艾氏综合征)、MPS II(亨特氏综合征)、MPS VI (马-拉综合征)、MPS 111(沙费利波综合征)、MPS IV(莫基奥综合征)或MPS VII (Sly综合征)。
49.根据权利要求40所述的方法，其中所述施用经口服、通过吸入、通过鼻内滴注、局部、经皮、肠胃外、皮下、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、胸膜内、腹膜内或通过敷用到黏膜上进行。
50.根据权利要求40所述的方法，进一步包括: 重复所述施用。
51.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者为婴幼儿或青少年。
52.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者为成人。
【文档编号】C12N13/00GK103764824SQ201280037341
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2011年6月20日
【发明者】爱德华·H·舒克曼, 凯洛格拉·M·西蒙娜罗, 加里·E·斯特赖克, 海伦·维拉萨拉 申请人:西奈山医学院