用于柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的基因操作和表达系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分离的启动子和合成显性选择构建体和增强子用于基因靶向的应用，用于在选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的物种中有效生产遗传修饰的细胞，所述物种特别是选自红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属、掷孢酵母属或黑粉菌属的物种。
【专利说明】用于柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的基因操作和表达系统
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请涉及于2011年6月10日提交的美国临时专利申请序列号61/495, 619且 要求其优先权。这个申请通过引用并入本文。
[0003] 序列提夺
[0004] 本申请随同电子格式的序列表一起提交。序列表名称为 2577207SequenceListing.txt，于2012年4月11日创建并且大小为31kb。序列表的电子 格式中的信息是本申请的部分，并且整体引入本文作为参考。
【背景技术】
[0005] 本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及在柄锈菌亚门 (Pucciniomycotina)和黑粉菌亚门（Ustilaginomycotina)的物种中的高效率基因操作和 强基因表达系统。
[0006] 本文用于阐明本发明背景的出版物及其他材料以及特别提供关于实践的另外细 节的案例通过引用并入，并且为了方便起见通过作者和日期在下述正文中提及，并且在所 附参考书目中按作者字母顺序列出。
[0007] 柄锈菌亚门是担子菌门中的真菌亚门（Kirk等人，2008)。它拥有具有重 要工业应用的许多物种。例如，红冬孢酵母属（Rhodosporidium)和锁掷酵母属 (Sporidiobolus)中的许多物种，例如圆红冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides) (也称为瘦弱红酵母（Rhodotorula gracilis)、Rhodosporidium glutinis)、粘红酵母 (Rhodotorula glutinis)、Torula koishikawensis和Torula rubescens)和赫色掷抱酵母 (Sporobolomyces salmonicolor)，是能够高密度发酵的富油单细胞酵母（Hu等人，2009; Meng等人，2009)。这些物种具有作为用于生产长链烃的宿主的极大潜力，所述长链烃例如 三酰基甘油（TAG或脂肪）、脂肪酸酯（生化柴油）、脂肪醇、醇、内酯、萜类和维生素（Wu等 人，2010a ;Wu等人，2010b ;Zhao等人，2010a ;Zhao等人，2010b)。尽管基于PEG介导的原 生质体转染的方法已在圆红冬孢酵母中报道（Tully和Gilbert，1985)，但该方法是高度不 可靠的且需要营养突变型用于转化。由于质粒PHG2的不稳定性，转化载体不能应用于工业 菌株的基因操作，所述质粒PHG2含有圆红冬孢酵母的苯丙氨酸氨裂解酶（PAL)编码基因 (PAL)和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的LEU2基因作为选择标记，和DNA载体 整合的位点特异性模式。类似地，不存在可以在红冬孢酵母属中用于驱动实用基因或选择 标记表达的功能启动子。类似情况在掷孢酵母属（Sporobolomyces)中发现（Ianiri等人， 2011)。在另一个例子中，黑粉菌亚门中的物种特别是黑粉菌属（Ustilago)和Pseudozyma 已知生产糖脂，所述糖脂可以充当表面活性剂或杀真菌剂（Hewald等人，2005 ;Teichmann 等人，2010)。
[0008] 完整的基因操作和表达系统一般由下述组成：组成型或诱导型启动子；可选择标 记；DNA载体；将DNA引入宿主细胞内以整合到基因组内或作为附加体复制的方法；和抑制 或阻断目的基因表达的方法。
[0009] 根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导的转化（ATMT)是用于转化许 多真菌物种的方便方法（De Groot等人，1998)。转化效率可以通过下述得到改善：最佳化 用于土壤杆菌属（Agrobacterium)的pH值、在共培养过程中受体细胞和供体细胞的比例和 绝对值（Ji等人，2010)和使用衍生自T-DNA的增强子DNA序列（YE和Gilbertson，2009)。 在植物物种的ATMT中，已报道了改善转化的几种技术，包括植物组织的超声处理和真空渗 入（de Oliveira等人，2009);驱动选择标记表达的更强启动子（Maehara等人，2010)和宿 主防御应答的控制（Khanna等人，2007 ;Vega等人，2008)。这些修饰的效应在真菌的ATMT 中仍未得到证实。
[0010] 众所周知真菌细胞还可以通过下述进行转化：完整细胞或原生质体的电穿孔（Wu 和Letchworth，2004);和原生质体的转染（(Meyer，2008;Turgeon等人，2010)或简单化 学诱导以增加细胞壁渗透性（Gietz和Woods，2002 ;Hill等人，1991 ;Ito等人，1983)。随 机插入诱变是用于快速鉴定未知基因的有力工具。尽管限制性酶介导的整合（REMI)可以 用于改善在PEG介导的转化方案中线性化DNA载体的整合（B0lker等人，1995 ;Maier和 Schafer，1999)，但这种方法受阻于基因组DNA的大缺失、多重插入和未加标签的诱变包括 染色体重排（:B6lker等人，1995 ;Meyer 等人，2003 ;Sweigard 等人，1998)。另一方面，ATMT 已公认为这个方面的优良工具（Choi等人，2007 ;Soltani等人，2008)。
[0011] 真菌转化体的选择已由表达修饰抗生素和除草剂的蛋白质的人工构建体证实。常 用基因包括赋予针对潮霉素 B的抗性的潮霉素磷酸转移酶（hpt)(Bundock等人，1995); 赋予针对诺尔丝菌素的抗性的诺尔丝菌素乙酰转移酶（nat) (Ji等人，2010 ;KrUgel等人， 1988)、赋予针对卡那霉素或G418或新霉素的抗性的氨基糖苷3'-磷酸转移酶（aph)或新 霉素磷酸转移酶（npt) (Goldstein和McCusker，1999 ;Scorer等人，1994)、赋予针对博来霉 素（Zeocin)的抗性的印度斯坦链异壁菌（Streptoalloteichus hindustanus)博来霉素基 因（ble) (Pfeifer等人，1997 ;Takeno等人，2005);赋予针对除草剂草甘膦的抗性的5-烯 醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶（aroA)基因（Comai等人，1983);赋予针对除草剂双丙氨 磷的抗性的草胺膦乙酰转移酶（pat) (Goldstein和McCusker，1999);赋予针对除草剂磺酰 脲的抗性的乙酰乳酸合酶（acs)基因（Haughn等人，1988)。
[0012] 基因缺失和重排是现代遗传学中至关重要的基因靶向技术。然而，由于低基因靶 向频率，生成此类突变体通常是非常有挑战性的。显著改善基因靶向频率的技术在许多生 物体中是高度寻求的。
[0013] 在高等真核DNA非同源末端连接（NHEJ)系统中，DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK) 全酶包含称为Ku70和Ku80的约70和80kDa的多肽异二聚体，其与DNA链断裂结合，从而 召募且激活称为DNA-PKcs的470-kDa催化亚基（Smith和Jackson，1999)。虽然Rad51和 Rad52对于HR途径中的DSB修复是必需的（van Attikum等人，2003)，但DNA-PKcs/Ku复合 体和XRCC4/连接酶IV在哺乳动物系统中的NHEJ途径中是至关重要的（van Attikum等人， 2001)。然而，关于DNA-PKcs亚基的同系物在真菌中仍未鉴定。近年来，已存在关于通过缺 失其关键组分中的一个或多个破坏NHEJ途径来成功改善基因缺失频率的几个报道（KUck 和Hoff，2010)。这种技术难以应用。
[0014] 另一方面，已报道了抑制DNA-PK活性的大量化合物，包括渥曼青霉素 (wortmanin) (Boulton 等人，1996)、LY294002 (Rosenzweig 等人，1997)、香草醒（Durant 和 Karran，2003)、NU1025 (Boulton 等人，1999)、roi28763(Tentori 等人，2002)、 八614361(51?11行21^等人，2003)、顯7026[2-(吗啉-4-基）-苯并[11]色-4-酮；2-(4-吗 啉基）-4H-萘酚[1，2-b]吡喃-4-酮]和NU7441 [8-(4-二苯并噻吩）-2-(4-吗啉 基）-4H-1-苯并吡喃-4-酮]。后面两种被认为在动物中是更特异性和有力的DNA-PK抑制 剂（Veuger等人，2003;Willmore等人，2004)。在真菌中不存在DNA-PK的情况下，不了解 是否存在促进基因靶向的化合物。
[0015] 目前，红冬孢酵母属、掷孢酵母属、孢堆黑粉菌属（Sporisorium)和黑粉菌属中的 物种的遗传转化是完全不可用的或无效的，并且是可再生化学制品和生物燃料进展的主要 障碍。
【发明内容】
[0016] 本发明涉及使转化细胞能够高度有效生产的合成构建体和转化方法，所述转化细 胞选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门中的物种。特别相关的物种是红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌 属、掷孢酵母属和黑粉菌属中的那些，在其中存在具有用于将可再生资源生物转化成高价 值产品的极大潜力的许多物种，所述高价值产品例如甘油三酯、生物柴油、脂肪醇、维生素、 内酯、萜类和生物表面活性剂。
[0017] 在第一个方面，本发明提供了多核苷酸序列，其充当例如用于潮霉素磷酸转移酶 (hpt)和诺尔丝菌素乙酰转移酶基因（nat)的基因表达的强启动子，并且允许转化细胞在 选自红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属和黑粉菌属的物种中的有效选择。在一个实施方案中， 启动子包含SEQ ID N0:1中所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列。在另外的实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:3中所示的核苷 酸序列。在进一步的实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:4中所示的核苷酸序列。在另一 个实施方案中，启动子是棉蚜（Ashibia gossipii)的tef启动子，并且包含SEQ ID N0:5 中所示的核苷酸序列。在另外的实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:51中所示的核苷酸序 列。在进一步的实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:55中所示的核苷酸序列。在另一个实 施方案中，启动子是粘红酵母的硬脂酰-CoA δ 9-去饱和酶启动子，并且包含SEQ ID N0:56 中所示的核苷酸序列。这些启动子各自在红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属、掷孢酵母属、红酵 母属（Rhodotorula)、Pseudozyma和黑粉菌属中执行强烈基因表达中是有效的。使用本文 描述的用于鉴定此类启动子的技术，可以从曲霉菌属（Aspergillus)、红冬孢酵母属、红酵 母属、掷孢酵母属、孢堆黑粉菌属、Pseudozyma和黑粉菌属中的其他物种中鉴定另外的强启 动子。此外，使用常规启动子筛选测定法可以分离这些启动子的可操作片段，并且使用本文 描述的技术可以筛选经转化的真菌细胞的有效选择。
[0018] 在第二个方面，本发明提供了包含衍生自选自下述的物种的分离启动子的合 成显性选择构建体：曲霉菌属、红冬孢酵母属、掷孢酵母属、孢堆黑粉菌属、红酵母属、 Pseudozyma和黑粉菌属，关于其的启动子可操作地连接至合适标记的编码序列，所述合适 标记的编码序列可操作地连接至转录终止子。此类构建体在促进选自下述的物种中的转 化细胞生产中是有效的：红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属、掷孢酵母属、红酵母属、Pseudozyma 或黑粉菌属。在一个实施方案中，合适标记是赋予抗生素抗性的蛋白质。在另一个实施方案 中，合适标记是赋予除草剂抗性的蛋白质。在一个实施方案中，实现这种功能的标记的编码 序列是天然存在或人工制备且含有至少约60%GC的编码序列。在第二个实施方案中，实现 这种功能的标记的编码序列是天然存在或人工制备且含有约63%GC的编码序列。在第三个 实施方案中，实现这种功能的标记的编码序列是天然存在或人工制备且含有约70%GC的编 码序列。在一个实施方案中，此类编码序列的至少约70%密码子三联体以C或G结束。在 另一个实施方案中，此类编码序列的超过约80%密码子三联体以C或G结束。在一个实施 方案中，此类编码序列在至少约40%的总丝氨酸（Ser)残基中包含UCG密码子。在一个实 施方案中，关于药物抗性的编码序列包含SEQ ID NO:6中所不的核苷酸序列。在另一个实 施方案中，关于药物抗性的编码序列包含SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列。在另外的实 施方案中，关于药物抗性的编码序列包含SEQ ID NO:8中所不的核苷酸序列。在一个实施 方案中，可以使用在真菌物种中可操作的任何转录终止子。
[0019] 在第三个方面，本发明提供了基于对物种显性选择的转化方法，所述物种选自 柄锈菌亚门和黑粉菌亚门，特别是红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属、黑粉菌属、红酵母属、 Pseudozyma或掷孢酵母属（锁掷酵母属）中的物种。在一个实施方案中，转化方法是根瘤 土壤杆菌介导的转化（ATMT)。在另一个实施方案中，转化方法是电穿孔。在另外的实施方 案中，转化方法是转染。在进一步的实施方案中，转化方法是生物射弹（biolistic)。
[0020] 根据ATMT实施方案，该方法包括下述步骤：（a)制备含有下述的合成DNA构建 体：可操作地连接至（ii)关于可选择标记的编码序列的（i)衍生自曲霉菌属、红冬孢酵母 属、掷孢酵母属、孢堆黑粉菌属、红酵母属、Pseudozyma或黑粉菌属的启动子,所述可选择标 记的编码序列可操作地连接至（iii)可操作地连接的转录终止子；(b)将DNA构建体插入 T-DNA二元载体内；（c)将所得到的T-DNA载体引入土壤杆菌属菌株内；（d)优选在土壤杆 菌属毒力诱导物例如乙酰丁香酮（acetosynringone)(AS)的存在下，使土壤杆菌属细胞与 真菌细胞一起在固体培养基上或放在固体培养基之上的膜上共培养，以转化真菌细胞；（e) 在固体培养基上或放在固体培养基之上的膜上直接选择经转化的菌落。选择培养基可以进 一步补充有以完全抑制土壤杆菌属和未经转化的真菌细胞生长的浓度的物质。在一个实施 方案中，启动子是本文描述的启动子。在另一个实施方案中，可选择标记的编码序列是本文 描述的编码序列。在一个实施方案中，选择培养基或共培养培养基含有至少约1.5%琼脂。 在另一个实施方案中，选择培养基或共培养培养基含有约2%-约3%琼脂。
[0021] 在第四个方面，本发明提供了用于真菌中的基因靶向的改良方法。特别地，哺乳动 物DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK)抑制剂可以大量补充至用于转化的培养基。在一个实施方 案中，DNA-PK抑制剂是NU7026(2-(吗啉-4-基）-苯并[h]色-4-酮；2-(4-吗啉基）-4H-萘 酚[l，2-b]吡喃-4-酮）。在另一个实施方案中，培养基中的NU7026量为约0. ΙμΜ-约 50 μ Μ。在另外的实施方案中，DNA-PK抑制剂可以与任何转化方案一起使用，所述转化方案 例如ATMT、电穿孔、转染、生物射弹等。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1A-1D显示转化载体的图示。图1A :pEX2 ;Pgpd指玉米黑粉菌（Ustilago maydis)的gpd启动子。图IB :pEC3。图1C :pEC3PxxxhptR ;Pxxx指示位于P盒中的多种 启动子。图ID :pEX3GPDA-EGFP。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界。T35S :花椰菜 花叶35S基因终止子；Tnos :根瘤土壤杆菌胭脂碱合酶转录终止子；egfp :增强型绿色荧光 蛋白基因。
[0023] 图2A-2D显示可选择标记对圆红冬孢酵母的ATMT的作用。对于玉米黑粉菌和圆 红冬孢酵母，关于转化体的选择用100 μ g/ml潮霉素 B执行。图2A :与AGL1共培养的圆红 冬孢酵母。图2B :与AGL1 (pEX2)共培养的圆红冬孢酵母。图2C :推定转化体的菌落PCR。 图2D :使用nat作为选择标记的推定转化体的菌落PCR。
[0024] 图3A和3B显示在潮霉素抗性菌落中的GFP表达。图3A :针对100 μ g/ml潮霉素 B选择8天的菌落；图3B :针对200 μ g/ml潮霉素 B选择8天的菌落。
[0025] 图4 :显示在多种共培养培养基pH下获得的圆红冬孢酵母转化体的DNA印迹。WT ; 野生型圆红冬孢酵母。印迹针对hpt-3进行探测。
[0026] 图5显示甘鹿鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum)转化体的DNA印迹分析。基 因组DNA用BamHI消化且用[32P]_标记的hpt DNA片段探测。泳道1-18是来自推定转化 体的DNA。泳道19是甘蔗鞭黑粉菌野生型DNA。分子标记在左侧上指示。
[0027] 图6显示具有不同启动子的粘红酵母转化体的DNA印迹。PgpdUm、PgpdA Kt、PgpdAAn 和PtefAg分别指来自玉米黑粉菌、圆红冬孢酵母、构巢曲霉和棉蚜的gpd启动子。印迹针对 hpt-3进行探测。
[0028] 图7显示DNA-PK抑制剂的结构是NU7026 (2-(吗啉-4-基）-苯并[h]色-4-酮； 2-(4-吗啉基）-4H-萘酚[1，2-b]批喃-4-酮）。
【具体实施方式】
[0029] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技 术人员通常理解相同的含义。
[0030] 如本文使用的术语"有效选择"意指使用任何真菌分离物在90mm培养皿中的至少 两个真正转化体的直接选择。
[0031] 如本文使用的术语"强表达"意指标记蛋白质或mRNA表达至使用已知检测方法可 检测的水平，所述已知检测方法例如GFP的荧光、GUS和lacZ基因的活性测定法。
[0032] 本发明涉及使转化细胞能够高度有效生产的合成构建体和转化方法，所述转化细 胞选自柄锈菌亚门和黑粉菌亚门中的物种。特别相关的物种是红冬孢酵母属、掷孢酵母 属、孢堆黑粉菌属、红酵母属、Pseudozyma和黑粉菌属中的那些，在其中存在具有用于将可 再生资源生物转化成高价值产品的极大潜力的许多物种，所述高价值产品例如甘油三酯、 生物柴油、脂肪醇、内酯、萜类和维生素和生物表面活性剂。此类菌株的例子包括但不限于 圆红冬抱酵母、Rhodosporidium azoricum、Rhodosporidium babjevae、Rhodosporidium concentricum、双倒卵形红冬抱酵母（Rhodosporidium diobovatum)、Rhodosporidium fluvial> Rhodosporidium kratochvilovae、Rhodosporidium lusitaniae、海洋红酵母 (Rhodosporidium paludigenum)、球红冬抱酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum)、圆 红冬抱酵母、玫红掷抱酵母（Sporobolomyces roseus)、Sporobolomyces carnicolor、 Sporobolomyces salmoneus、Sporisorium scitamineum、玉米黑粉菌、Pseudozyma Antarctica、Pseudozyma aphidis。
[0033] 在一个方面，本发明提供了包含可操作地连接至关于可选择标记的编码序列的启 动子的多核苷酸构建体，所述关于可选择标记的编码序列可操作地连接转录终止子。启动 子衍生自选自下述的真菌物种：黑粉菌属的物种、曲霉菌属的物种和红冬孢酵母属的物种， 并且提供编码序列在柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的经转化的真菌细胞中的强表达。多核苷酸 构建体提供了柄锈菌亚门和黑粉菌亚门的经转化的真菌细胞的有效选择。多核苷酸构建体 特别用于有效选择红冬孢酵母属、孢堆黑粉菌属、黑粉菌属、红酵母属、Pseudozyma和掷孢 酵母属（锁掷酵母属）的经转化的真菌细胞。
[0034] 在一个实施方案中，启动子衍生自编码甘油醛3-磷酸脱氢酶（gpd)的基因或编码 蛋白质翻译延伸因子（tef)的基因。
[0035] 在一个实施方案中，启动子包含SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列。在另一个实 施方案中，启动子包含SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列。在另外的实施方案中，启动子包 含SEQ ID N0:3中所示的核苷酸序列。在进一步的实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:4中 所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，启动子是SEQ ID N0:5中所示的棉姆的tef启 动子。在另外的实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:51中所示的核苷酸序列。在进一步的 实施方案中，启动子包含SEQ ID N0:55中所示的核苷酸序列。在另一个实施方案中，启动 子是粘红酵母的硬脂酰-CoA δ 9-去饱和酶启动子，并且包含SEQ ID N0:56中所示的核苷 酸序列。使用本文描述的用于鉴定此类启动子的技术，可以从曲霉菌属、红冬孢酵母属、红 酵母属、掷孢酵母属和黑粉菌属中的其他物种中鉴定另外的强启动子。此外，使用常规启动 子筛选测定法可以分离这些启动子的可操作片段，并且使用本文描述的技术可以筛选经转 化的真菌细胞的有效选择。
[0036] DNA操作领域技术人员众所周知的技术，核酸杂交可以用于鉴定其他合适的多核 苷酸。依照本发明，使用的其他合适启动子可以通过鉴定多核苷酸而获得，所述多核苷酸通 过在低严格条件、中等严格条件或高严格条件下杂交与上文描述的启动子选择性杂交。选 择性杂交序列一般彼此具有至少50%序列相同性，优选至少70%、80%或90%序列相同性，并 且最优选95%、98%或99%序列相同性。
[0037] 使用本领域技术人员众所周知的算法或计算机程序和这些技术，基因组和核苷酸 数据库的数据库搜索和同源性搜索基于核苷酸的比对鉴定相似的DNA或RNA分子。依照本 发明，使用的其他合适多核苷酸可以通过调节序列的多核苷酸的计算机芯片鉴定而获得， 所述调节序列彼此具有至少50%序列相同性，优选至少70%、80%或90%序列相同性，并且最 优选95%、98%或99%序列相同性。
[0038] 在一个实施方案中，启动子包含（i)与SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少50% 相同性的核苷酸序列，（ii)与SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷酸序 列，（iii)与SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)与SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)与SEQ ID NO: 2的核苷酸序列 具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)与SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少95%相同 性的核苷酸序列，和（vii)与SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少98%相同性的核苷酸序 列。
[0039] 在另一个实施方案中，启动子包含（i)与SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)与SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)与SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)与 SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)与SEQ ID N0:51的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)与SEQ ID NO: 51的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)与SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0040] 在进一步的实施方案中，启动子包含⑴与SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)与SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)与SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)与 SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)与SEQ ID N0:55的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)与SEQ ID NO: 55的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)与SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0041] 在另一个实施方案中，启动子包含（i)与SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)与SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)与SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)与 SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)与SEQ ID N0:56的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)与SEQ ID NO: 56的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)与SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0042] 关于可选择标记的编码序列编码可选。可选择标记编码序列用于选择经转化的细 胞或组织。通常，可选择标记编码序列将编码抗生素抗性，其中合适的编码序列包括下述中 的至少一组：编码针对抗生素壮观霉素的抗性的编码序列、针对zeomycin的抗性的编码序 列、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶（spt)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新 霉素磷酸转移酶（nptll)基因、编码针对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶（hpt或aphiv) 基因、编码针对诺尔丝菌素的抗性的乙酰乳酸合酶（als)基因或诺尔丝菌素乙酰转移酶基 因。可替代地，植物可选择标记编码序列将编码除草剂抗性例如针对磺酰脲型除草剂、草 铵膦、草甘膦、铵、溴苯腈、咪唑啉酮和2, 4-二氯苯氧乙酸盐（2, 4-D)的抗性，包括编码针对 作用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂例如草胺膦或basta的抗性的基因（例如bar基 因）。一般参见国际
【发明者】L·H·纪, Y·B·刘, C·M·J·许, L·H·孙 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司