从混合核酸样品分离靶核酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于将靶核酸从混合核酸样品中分离的方法、组合物和试剂盒。所述方法、组合物和试剂盒包括非进行型内切核酸酶(例如，限制性内切酶)或结合靶核酸(例如，具有甲基化特异性)的抗体。混合核酸样品可包含原核和真核生物核酸和/或来自超过一种原核或真核生物体的核酸。
【专利说明】从混合核酸样品分离靶核酸
[0001 ] 关于联邦政府资助的研究或开发的声明
[0002]本发明是在由国土安全部授予的合同号:
[0003]HSHQDC -10-C- 00019下通过政府支持进行的。政府具有本发明的某些权利。
[0004]关于电子提交的序列表
[0005]将电子提交的序列表(名称:
[0006]3179_0010001_SEQIDListingPCTasci1.txt ;大小:2, 226 字节；创建日期:2012年6月26日)的内容通过引用整体并入本文。
[0007]发明背景
[0008]本发明总地来说涉及 用于从混合核酸样品分离靶核酸的方法和组合物。
[0009]生物威胁物的快速检测和详尽分析在缓和对目标群体的影响中是非常重要的。检测和分析的一般方法是收集环境样品(空气、水、食物、人组织)并且确定样品是否包含来自生物威胁物(细菌、病毒等)的任何核酸(DNA或RNA)。该方法中主要遇到的问题是环境样品不是纯的，通常包含比靶生物威胁物核酸显著更多的本底真核生物核酸，从而使得难以分离或扩增靶核酸。事实上，原核和真核生物核酸的复杂混合物在自然界中是常见的；生物体的混合群体存在于空气、水和土壤中，并且细菌和植物或人的共生体是生命的真实状态。除了检测样品中的这些生物威胁物外，还存在从更大的真核生物基因组(2.3兆碱基-16千兆碱基)分开和分离相对小的生物威胁物例如细菌(4-6兆碱基)的基因组的研究和商业原因。换句话说，该基因组大小差异相当于单个人细胞给混合物提供为单个大肠杆菌(E.coli)细胞的约1000倍的遗传物质。这具有从大多数混合样品产生巨大量的真核生物DNA的作用，从而妨碍混合样品中细菌的检测和鉴定。
[0010]败血症是其中生物威胁物的检测是非常困难的状况的一个实例。败血症是世界范围内非冠脉重症监护病房的首要致死原因，并且其复杂病原范围包括革兰阳性和革兰阴性细菌。已报道血液中的细菌水平超过1000个菌落形成单位(CFU)/mL血液，在其它情况下少于lCFU/mL血液。即使在最高浓度水平(约1000个细菌/ml血液)，细菌DNA相较于相同体积中的IO9个血细胞(IO7个包含DNA)(这等同于人DNA是细菌DNA的1000万倍)也是微不足道的。
[0011 ] 从包含真核生物DNA的混合样品分开和分离细菌DNA的综合解决方法目前还不可获得。通常培养混合样品以差异性扩大细菌在样品中的百分比。实际上，对于败血症，参照实验室中病原体鉴定的标准仍然是通过培养物的检测。一般地，培养物需要I至5天来使病原体充足地生长出来以进行确认。培养法也是用于食品测试和环境样品的标准。通过监控炭疽芽孢杆菌(B.anthraxcis)-特异性噬菌体产生的斑，细菌感染的鉴定在炭疽感染中变得更快，提供了大于90%的灵敏度和特异度。然而，FDA批准的噬菌体裂解测定是基于实验室的，需要由熟练技术员花费8-24小时来完成，并且仅仅是枚举细菌而非将其纯化出来进行分析。
[0012]作为基于培养物的检测法的替代法，可将从混合原核/真核生物环境样品分离的核酸经历基于高灵敏性聚合酶链式反应(PCR)的测定来检测生物威胁物靶序列。例如，FDA已批准了用于从鼻拭子鉴定特定威胁物例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和链球菌属的某些种(Streptococcus spp.)的快速实时PCR技术。金黄色葡萄球菌Gene Ohm试剂盒(Becton Dickinson, USA)需要鼻拭子的悬浮物,快速裂解,随后在约2小时内以公布的98.9%的灵敏度和96.7%的特异度进行扩增。然而，鼻拭子样品的真核生物核酸本底相较于血液样品较低。此外，该方法限定于特定细菌的单纯检测，从而不允许分离和纯化细菌靶基因组以进行分析，从而在检测未知原核生物威胁物中是无效的。
[0013] 血液中细菌的检测已从通过机械/化学裂解产生的粗制裂解物实现。在该方法中，原核生物DNA的检测需要昂贵的实时PCR测定，例如Roche SeptiFastTM系统，或可选择地，质谱测定例如Abbot Plex-1D系统。这些系统未被FDA批准，并且仅可处理1.5ml的血液，限制了其灵敏度。此外，这些测定也不允许从原核生物威胁物分离和纯化遗传物质以用于另外的分析。
[0014]因此，需要允许选择性分离混合样品中的原核生物核酸，从而允许进一步分析和表征靶原核生物基因组的方法。此外，需要允许基于非特异性原核生物性状的分开和分离以便可能鉴定和表征先前未知的细菌威胁物的方法。最后，需要不需要昂贵的定量PCR测定的方法。
[0015]发明概述
[0016]鉴于与目前分离方案相关的问题，本发明提供了用于从核酸的混合样品高效分离核酸(例如，将原核生物或细菌核酸与真核生物核酸分开)的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，方法利用对于原核生物界独特的DNA的表观遗传学修饰，从而提供了原核生物核酸从混合环境或临床样品的快速高效分离和鉴定。这样，本发明允许快速诊断和允许进一步基因组表征和分析生物威胁物。
[0017]在一个实施方案中，方法包括步骤:(I)在足以允许表观遗传结合剂与具有表观遗传学修饰的核酸形成复合物的条件下，将表观遗传结合剂应用于样品；(2)分离表观遗传学结合剂/核酸复合物；(3)纯化存在于分离的复合物中的核酸；和(4)分析纯化的核酸。在一个方面，表观遗传学结合剂是特异性结合原核生物表观遗传学修饰的分子或分子复合物，所述表观遗传学修饰是例如选自N4-甲基胞嘧啶(MmC)、N6-甲基腺嘌呤(N6mA)和任何其它原核生物特异性表观遗传学修饰。表观遗传学结合剂选自多克隆抗体、单克隆抗体、缀合的多克隆或单克隆抗体、限制性内切酶、缀合的限制性内切酶、结合-突变型限制性内切酶以及具有对于上述表观遗传学修饰的特异性亲和力的其它分子或分子复合物。
[0018]在另一个实施方案中，提供了表观遗传学特异性降解法。方法包括在足以允许表观遗传学特异性降解因子在缺乏特定表观遗传学修饰的序列上选择性切割核酸的条件下将表观遗传学特异性降解因子应用于样品，其中所述表观遗传学修饰存在于靶核酸中。在表观遗传学特异性切割后，非靶核酸被耗尽，并且靶核酸被分析。可向该方法添加额外的步骤，所述步骤将在下文中的详细说明中进行进一步论述。
[0019]在另一个实施方案中，提供了表观遗传学-结合剂组合物。在优选实施方案中，表观遗传学结合剂是针对特异于靶核酸的表观遗传学修饰例如MmC或N6mA的单克隆抗体或其抗原结合片段。在相关实施方案中，表观遗传学结合剂是突变的限制性内切酶，其在具有特异于靶核酸的表观遗传学修饰的子序列上选择性结合靶核酸，但不切割靶核酸。在任一实施方案中，任选地生物素化表观遗传学结合剂，或用第二分子缀合表观遗传学结合剂以帮助从样品分离结合剂/核酸复合物。
[0020]本发明不限于上述实施方案，根据下文中的详细说明中提供的论述和实施例其它实施方案和应用将变得显然。
[0021]附图概述
[0022]根据下列详细说明和附图，可更全面地理解本发明的不同实施方案，所述详细说明和附图形成了本申请的部分。
[0023]图1A显示了用于MADA展示的合成接头的序列(SEQ ID NO:1)。接头具有与GATC位点相容的多核苷酸悬突。引物使得能够扩增包含接头的片段(例如，引物#1和引物#2，如所标示)(SEQ ID N0:8和9)。必要时存 在NotI限制性位点以用于片段的线性化。图1B显示可用于MADA展示的替代性合成接头序列(SEQ ID N0:2_7，其中SEQ ID N0:2与3退火，SEQ ID N0:4 与 5 退火，SEQ ID N0:6 与 7 退火)。
[0024]图2显示甲基化选择性降解使得能够分离原核生物(大肠杆菌)和真核生物(小麦)DNA。DpnI仅切割在GATC位点的腺嘌呤上甲基化的DNA。DpnII仅当GATC未被甲基化时才切割。细菌和真核生物DNA的混合物是差异限制性的，从而使得能够通过限制性末端的尺寸或相容性来进行分离。
[0025]可作图的序列读出的超高通量筛选(UHTS)鉴定在图3中显示了细菌的富集。将序列的MegaBlast分类作图，显示了细菌序列的近30倍的富集(图3A和3B)。还显示了纯化前和纯化后降解的生物体混合物中包含GATC位点的序列读出的分析(图3C和3D)。
[0026]图4显示N6mA富集导致大肠杆菌K-12MG1655的高均匀覆盖。将ICx BioassaysSPEED导管用于将每一个读出的前32bp定位至染色体的线性图示。(图4A和4C)。覆盖深度从富集前的0.24跃升至富集后的6.0X。列出了 99%的所得覆盖水平。(图4B和4D)。按位置的覆盖显示在整个染色体上的平均分布。
[0027]图5显示连接至粘性BamHI末端的接头使分子环化并且保护它们免受降解，从而使得能够进行PCR扩增。
[0028]图6显示线性相对于环状DNA分子的选择性降解，这使得能够选择性扩增靶分子。DpnII限制性酶切的人基因组DNA(gDNA)对质粒安全性DNA酶敏感(比较泳道2和3)，而通过接头连接产生的环状分子(泳道5，pUC19对照)对所述酶不敏感。
[0029]图7显示利用接头连接的表观遗传学特异性降解法对于分离和扩增混合样品中的靶DNA是有效的。
[0030]图8显示利用接头连接的表观遗传学特异性降解法有效地扩增细菌基因组DNA，同时选择性降解单个混合物中的人基因组DNA。
[0031]图9在表观遗传学特异性富集后使用QPCR定量细菌基因组富集和人基因组降解的水平。针对人男性DNA的DYZ基因座和大肠杆菌细菌DNA的16S基因座的引物和探针用于测量扩增前和扩增后混合物中来自每一种生物体的基因组DNA的水平。
[0032]图10显示在修饰条件下，限制性内切酶能选择性结合N6mA而不进行切割。
[0033]图11显示生物素化的DpnI (bDpnl)优先于重叠的未甲基化的651bp DNA片段特异性结合甲基化477bp DNA片段并且阻滞其凝胶迁移。
[0034]图12显示首先与甲基化的477bp DNA片段一起温育、随后与抗生物素蛋白珠粒一起温育的bDpnl显示出比用bDpnl预先涂覆抗生物素蛋白珠粒时更低的特异性。[0035]图13显示通过凝胶分析评估的靶DNA在前哨DNA片段上的结合的特异度。将IOOng的非靶DNA片段(651bp)和IOOng的靶DNA片段(477bp)混合，将其与80ul至180ul的bDpnl涂覆的抗生物素蛋白珠粒结合。30分钟后，将来自洗涤或洗脱级份的样品加载至琼脂糖凝胶上。前哨片段可用作评估反应的效率的对照。
[0036]图14显示从包含Iug的人DNA的混合样品回收细菌靶DNA的效率。将递减量的大肠杆菌基因组DNA(IOng-1pg)掺入Iug的人DNA。利用针对细菌16S和人DYZ (各自针对它们各自的标记物频率进行标准化)的定量聚合酶链式反应(qPCR)评估回收。
[0037]图15显示细菌和人DNA的结合时间过程，所述结合时间过程显示本发明的实施方案的快速结合和高度特异性。将bDpnl涂覆的珠粒添加至500pg的大肠杆菌(带方框的虚线)与Iug的人男性DNA(带圆圈的虚线)的混合物中。在指定的时间上，利用磁铁收集珠粒并洗涤。将大肠杆菌的16S基因和人的DYZ的qPCR用于定量结合的量。
[0038]图16显示示例性基因组混合物以及SCODA和DpnI富集法的作用。
[0039]图17显示DpnI富集使基因组覆盖增加至约15倍而不在整个4.6MB基因组上引入显著的偏向性。图17A显示富集前覆盖，插图以20倍增加的尺度显示相同的数据来突出显示富集前基因组覆盖模式。图17B显示富集后覆盖显著增加。显示了关键特征例如基因组覆盖的低和高点(分别为末端和复制起始点(OriC))，和覆盖中的人工掺入(细菌噬菌体DLP, Rec 和 Qin)。[0040]图18显示抗血清对N6-甲基-2-脱氧腺苷(N6mA)的特异性。通过利用不同水平的腺嘌呤(方块)或N6mA (菱形)攻击在竞争性ELISA版式中测试一式三份血清样品。误差棒描述了样品间的标准差。仅IOOng的N6mA导致50%的血清对N6mA涂覆的ELISA板的结合的抑制。与之相比较，IOug的腺嘌呤(试剂的100倍增加)导致约30%的抑制。
[0041]图19显示来自甲基化和未甲基化的寡核苷酸上的测试的多克隆和单克隆抗体的ELISA信号。图19A显示将含腺嘌呤㈧或N6m-腺嘌呤(6mA或N6mA)的寡核苷酸固定在微量滴定孔中，并且测试其对不同抗体的结合。来自N6mA寡核苷酸的高信号和相应地来自未甲基化的寡核苷酸的低信号表示特异性，如通过3个分隔的克隆所例示的。可将这些与来自小鼠1、4、8、9的最终取血多克隆血清(4个分隔的克隆)相比较。也显示了无抗体对照(无abs)。图19B显不6mA对A的信号比。
[0042]图20显示图19的抗体对人和大肠杆菌基因组DNA的特异性。通过滴定每一个孔中的列出的基因组DNA进行ELISA。450mm处的光密度(0D450)显示抗体对每一个基因组的反应性。
[0043]图21显示实施例7的方法的流程图。
[0044]图22显示掺入土壤样品的大肠杆菌DNA相较于单独的大肠杆菌DNA不能扩增，这表明PCR的抑制剂存在于土壤样品中。从喜林芋属或鸡蛋花属植物下方收集富含腐殖酸的商业表层土壤样品。级份表示为〃非靶〃或〃靶〃，如实施例8中描述的。
[0045]图23显示从河床淤泥或浅表河水、赭石包被的沙或火山泥分离的DNA的16S PCR特征谱。无模板对照(NTC)和人DNA不被16S引物扩增，而IOOng的大肠杆菌产生具有细菌生物体的特征的条带。此外，来自河床淤泥、珊瑚砂丘和火山泥洗液的分离的DNA和未结合的级份不扩增。结合和洗脱的级份从所有样品扩增。
[0046]图24显示黑麦花粉对利用和不利用DpnI富集的大肠杆菌16SqPCR测定的影响。将通过16S qPCR测定检测的大肠杆菌DNA的量作为花粉输入物的函数作图(实线)，而大肠杆菌的水平保持恒定(虚线)。随后将抑制水平的花粉(10，000和100，000ug/ml)掺入使用DpnI分离的大肠杆菌样品。将结合的("DpnI结合的％")和未结合的("DpnI未结合的％〃)级份中检测到的大肠杆菌DNA的量以占大肠杆菌DNA的总量的百分比作图。
[0047]发明详述
[0048]本发明涉及特异于来自特定来源的核酸的表观遗传学修饰的利用。在一个应用中，本发明的实施方案可用于分开和分离存在于包含过量真核生物DNA的样品中的原核生物DNA。更具体地，本发明的实施方案涉及利用对于原核生物DNA独特的表观遗传学修饰，以选择性分离和分析在混合样品中发现的原核生物DNA。
[0049]在一些实施方案中，本发明涉及用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的方法。在一些实施方案中，方法包括将所述混合样品与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸(例如，结合靶核酸的表观遗传学修饰或甲基化)的抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方案中，方法包括(i)将混合样品与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段接触；和(ii)将包含复合物的样品的第一级份与包含非靶核酸的样品的第二级份分开。在一些实施方案中，方法包括(i)将所述混合样品与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段接触，其中形成非进行型内切核酸酶或抗体或其抗原结合片段与靶核酸的复合物；和(ii)将包含复合物的样品的第一级份与包含非靶核酸的样品的第二级份分离。在一些实施方案中，保留第一级份和第二级份。在一些实施方案中，非进行型内切核酸酶结合靶核酸，但不切割靶核酸。在一些实施方案中，方法还包括
(iii)将(ii)的第一级份与非进行型内切核酸酶或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段接触；其中非进行型内切核酸酶结合靶核酸，但不切割靶核酸；其中形成非进行型内切核酸酶或抗体或其抗原结合片段与靶核酸的复合物；和(vi)将包含(iii)的复合物的级份与包含非靶核酸的样品的级份分离。
[0050]本发明的其它实施方案涉及用于富集包含靶核酸和非靶核酸的混合样品中的靶核酸的方法。在一些实施方案中，方法包括利用切割靶核酸但不切割非靶核酸的甲基化敏感性或甲基化依赖性内切核酸酶降解所述混合样品，或用结合表观遗传学修饰的抗体或其抗原结合片段温育所述混合样品。在一些实施方案中，方法还包括利用内切核酸酶降解样品；其中内切核酸酶切割非靶核酸但不切割靶核酸，从而导致与切割的靶核酸不相容的非靶核酸末端。在一些实施方案中，方法还包括将连接子连接至切割的靶核酸，或环化切割的靶核酸。在一些实施方案中，方法还包括耗尽非靶核酸。
[0051] 本发明还涉及用于将靶核酸与混合样品分离的组合物和试剂盒。在一些实施方案中，组合物包含(i)含有靶核酸和非靶核酸的混合样品和(ii)结合靶核酸但不切割靶核酸的非进行型内切核酸酶，或结合靶核酸的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，试剂盒包括(i)结合靶核酸但不切割靶核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶；和(ii)具有适合于非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割靶核酸的条件的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒包括识别甲基化核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶。在其它实施方案中，试剂盒包括(i)结合靶核酸但不切割靶核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶，或结合靶核酸的生物素化抗体或其抗原结合片段；(ii)固体支持材料；和(iii)特异于生物素化的结合剂。在一些实施方案中，试剂盒还包括甲基化核酸阳性对照。[0052]DNA的修饰见于所有界中。追寻本发明，检查DNA甲基化的不同形式，并指出N4-甲基胞嘧啶(MmC)和N6-甲基腺嘌呤(N6mA)仅见于或主要见于细菌中。N6mA特别具有吸引力，因为其作为DNA腺嘌岭甲基化酶(DAM)蛋白修饰的结果仅见于细菌中，虽然在原核生物中还存在其它腺嘌呤甲基化酶。DAM是在细菌(包括但不限于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotubercolosis))中发现的必需腺嘌呤甲基化酶。表I提供了显示dam甲基化的细菌的非完全列表。许多细菌在GATC序列内的腺嘌呤的N6位置甲基化，所述甲基化在染色体中大致每256个碱基发生一次，从而产生遍在的靶。细菌毒力通过N6mA进行控制，包括鞭毛、菌毛、粘着蛋白的产生、I1、III和IV型分泌、毒素合成和输出。当细菌复制它们的基因组时，它们可通过甲基化的不存在将初生子链与亲代区分开来。因此，本发明的实施方案利用了细菌籍以识别它们自己的亲代DNA的该机制，这是对细菌的存活和病原性至关重要的功能，对于该功能已进行了研究。先前已利用抗体实现了除N6mA外的修饰的核苷酸的检测。
[0053] 表1.使用dam甲基化的威胁性细菌
[0054]
【权利要求】
1.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品分离靶核酸的方法，包括: (i)将所述混合样品与非进行型内切核酸酶接触； 其中所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸，但不切割靶核酸； 其中形成所述非进行型内切核酸酶与所述靶核酸的复合物；和 (ii)将包含所述复合物的样品的第一级份与包含所述非靶核酸的样品的第二级份分开。
2.权利要求1的方法，其中保留所述第一级份和第二级份。
3.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含分离至所述第一级份或所述第二级份中的抑制剂。
4.权利要求3的方法，其中所述抑制剂是腐殖酸。
5.权利要求3的方法，其中所述抑制剂是柴油机烟尘。
6.权利要求3的方法，其中所述抑制剂是选自表6的抑制剂。
7.权利要求3的方法，其中所述抑制剂是环境或临床污染物。
8.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含来自至少两种不同原核生物体的核酸。
9.权利要求1的方法,其中所述混合样品包含来自人和细菌生物体的核酸。
10.权利要求1的方法,其中所述混合样品包含来自真核和原核生物体的核酸。
11.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含来自至少两种不同真核生物体的核酸。
12.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含来自未知生物体的核酸。
13.权利要求1的方法，其中所述接触在具有适合于所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液中进行。
14.权利要求13的方法，其中所述述缓冲液包含适合于所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割靶核酸的Mg2+浓度。
15.权利要求14的方法,其中所述Mg2+浓度低于10mM。
16.权利要求13的方法，其中所述述缓冲液不包含Mg2+。
17.权利要求13的方法，其中所述述缓冲液包含二价阳离子。
18.权利要求13的方法，其中所述缓冲液包含Ca2+、Cd2+、Sr2+、Ba2+、Co2+或Mn2+。
19.权利要求13的方法，其中所述缓冲液包含浓度为至少50mM的Ca2+。
20.权利要求13的方法，其中所述缓冲液包含为缓冲液的Mg2+浓度至少500倍的Ca2+浓度。
21.权利要求13的方法，其中所述缓冲液包含5-7的pH。
22.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶在内切核酸酶的阳离子结合基序中包含突变。
23.权利要求22的方法，其中突变是选自表3的突变。
24.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶包含选自ro基序、D/EXK基序、H-N-H基序或GIY-YIG基序的基序。
25.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶结合具有甲基化核酸的识别位点。
26.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶不结合具有甲基化核酸的识别位点。
27.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶具有甲基化特异性。
28.权利要求27的方法，其中所述非进行型内切核酸酶具有对于N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤的特异性。
29.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶包含可检测的标记。
30.权利要求29的方法，其中所述可检测的标记是生物素、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多组氨酸(HIS)或地高辛。
31.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶不具有催化活性。
32.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶具有低于0.1%的催化活性。
33.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶具有低于1%的催化活性。
34.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶具有低于10%的催化活性。
35.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶是非进行型限制性内切酶。
36.权利要求1的方 法，其中所述非进行型内切核酸酶是Dpnl。
37.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶是重组酶、解离酶、转座酶、整合酶、修复酶、硫代磷酸酯蛋白例如DptBCDE或DptFGH或其它DNA结合蛋白。
38.权利要求1的方法，其中所述非进行型内切核酸酶结合至固体基质。
39.权利要求38的方法，其中所述固体基质是磁珠、微量滴定板孔、柱子表面。
40.权利要求1的方法,其中分离的核酸是至少90%的靶基因组。
41.权利要求1的方法，其中所述方法需要少于80分钟来完成。
42.权利要求1的方法，其中所述方法需要少于20分钟来完成。
43.权利要求1的方法，其中所述混合样品中的少于10%的非靶核酸被分离至所述第一级份中。
44.权利要求1的方法，其中所述混合样品中的少于1%的非靶核酸被分离至所述第一级份中。
45.权利要求1的方法，其中所述混合样品中的至少90%的靶核酸被分离至所述第一级份中。
46.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含5或更多log的非靶核酸。
47.权利要求1的方法，其中所述混合样品包含少于IOpg的靶核酸。
48.权利要求1的方法，其还包括: (iii)将(ii)的第一级份与非进行型内切核酸酶接触； 其中所述非进行型内切核酸酶结合所述靶核酸，但不切割所述靶核酸； 其中形成所述非进行型内切核酸酶与所述靶核酸的复合物；和 (vi)将包含(iii)的复合物的级份与包含非靶核酸的样品的级份分开。
49.用于富集包含靶核酸和非靶核酸的混合样品中的靶核酸的方法，包括: (i)利用切割靶核酸但不切割非靶核酸的甲基化敏感性或甲基化依赖性内切核酸酶降解所述混合样品； (ii)利用内切核酸酶降解样品；其中所述内切核酸酶切割非靶核酸但不切割靶核酸，从而产生与切割的靶核酸不相容的非靶核酸末端； (iii)将连接子连接至切割的靶核酸，或环化切割的靶核酸；和 (iv)耗尽所述非靶核酸。
50.权利要求49的方法，其中(iii)的环化靶核酸抗利用DNA酶或外切核酸酶的降解。
51.权利要求50的方法，其中(iii)的环化靶核酸抗利用质粒安全DNA酶、λ外切核酸酶、外切核酸酶V(RecB⑶)或外切核酸酶III的降解。
52.权利要求49的方法，其中所述连接子抗(iv)的耗尽。
53.权利要求49的方法，其中所述连接子包含选自颠倒的dT、硫代磷酸酯、茎环、甲基化、羟甲基化、腺苷酰化、葡糖基化和4个核苷酸或更长的3’ OH末端悬突的修饰。
54.权利要求49的方法，其中(ii)的内切核酸酶是在非靶核酸上形成平端的限制性内切核酸酶。
55.权利要求49的方法，其中非靶核酸的限制性内切核酸酶识别序列位于靶核酸的限制性内切核酸酶识别序列内。
56.权利要求49的方法，还包括使用针对连接子的引物扩增所述靶核酸。
57.权利要求56的方法，其中通过滚环扩增进行所述扩增。
58.权利要求56的方法，其中通过聚合酶链式反应进行所述扩增。
59.权利要求56的方法，其中使用Phi29DNA聚合酶进行所述扩增。
60.权利要求49的方法，其中同时进行(i)和(ii)。
61.权利要求49的方法，其中在(ii)之前进行(iv)。
62.权利要求49的方法，其中通过凝胶分离、大小排阻或外切核酸酶降解来进行所述耗尽。
63.一种用于从混合样品分离靶核酸的组合物，其包含: (i)包含靶核酸和非靶核酸的混合样品； (ii)结合至靶核酸但不切割所述靶核酸的非进行型内切核酸酶。
64.权利要求63的组合物，其中所述混合样品包含来自人和细菌生物体的核酸。
65.权利要求63的组合物，其中所述混合样品包含来自真核和原核生物体的核酸。
66.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶在所述内切核酸酶的阳离子结合基序中包含突变。
67.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶具有甲基化特异性。
68.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶具有对于N4-甲基胞嘧啶或N6-甲基腺嘌呤的特异性。
69.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶包含可检测的标记。
70.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶具有少于10%的催化活性。
71.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶是非进行型限制性内切酶。
72.权利要求63的组合物，其中所述非进行型内切核酸酶是Dpnl。
73.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品扩增靶核酸的试剂盒，其包括: (i)结合靶核酸但不切割所述靶核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶；和 (ii)具有适合所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的条件的缓冲液。
74.权利要求73的试剂盒，其中所述缓冲液包含适合所述非进行型内切核酸酶结合靶核酸但不切割所述靶核酸的Mg2+浓度。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述Mg2+浓度低于10mM。
76.权利要求73的试剂盒，其中所述缓冲液包含至少50mM的Ca2+浓度。
77.权利要求73的试剂盒，其中所述缓冲液包含5-7的pH。
78.一种用于从包含靶核酸和非靶核酸的混合样品扩增靶核酸的试剂盒，其包括:(i)结合靶核酸但不切割所述靶核酸的生物素化的非进行型内切核酸酶；(ii)固体支持材料；和(iii)特异于生物素化的结合剂。
79.权利要求78的试剂盒，其还包括:(iv)甲基化的核酸阳性对照。
80.权 利要求1的方法，其中所述非进行型酶以等于或大于靶DNA的摩尔比存在。
【文档编号】C12N9/16GK103958697SQ201280039177
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年6月26日 优先权日:2011年6月27日
【发明者】R·A·弗塞斯 申请人:前视红外系统股份有限公司