用于引导细胞迁移的装置和实施这种装置的引导方法
【专利摘要】本发明的主题是用于引导细胞迁移的装置，包括具有用于与细胞接触的织纹表面的底层，所述织纹表面具有由突起物网络构成的各向异性的三维结构，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。根据另一个方面，本发明也涉及用于引导细胞迁移的方法，包括使细胞与具有织纹表面和各向异性三维结构的底层接触，所述结构由之前描述的倾斜突起物构成。根据本发明的装置或方法可以特别应用于皮肤病学、移植学和组织工程领域。
【专利说明】用于引导细胞迁移的装置和实施这种装置的引导方法
【技术领域】
[0001]本发明的主题是用于引导细胞迁移的装置，包括具有织纹表面的底层，所述织纹表面具有用于与细胞接触的各向异性的三维结构。
【背景技术】
[0002]细胞迁移对许多生理过程例如器官形成和伤口愈合而言是必不可少的。在它们的天然环境中，细胞迁移的方向和速度由可以是化学(趋化因子)或物理(微环境)的许多信号来引导。
[0003]在体外，这些现象可以被复制或转移以将迁移方向施加于细胞，例如使用趋化物或电场或通过调节细胞的机械环境。
[0004]例如，文献EP-A-1199354描述了通过细胞迁移的化学控制在表面上形成细胞图案(pattern)。事实上，在文献EP-A-1199354中，表面被处理以便显示出由促进细胞生长的化合物和其他不促进细胞生长的化合物组成的预图案。然后在该预图案上开始细胞的培养。然而，通过这种系统类型控制细胞迁移的效果主要取决于根据所培养细胞的性质促进或阻止细胞生长的化合物的选择。
[0005]文献US2007/0009572在其部分描述了制备微织纹或纳米织纹的可生物降解的薄膜的方法，所述薄膜包含其上淀积肌细胞的通道，其宽度可以为10-160μπι。所进行的测试表明肌细胞沿着所述通道彼此对准，以及它们的形态被修改以具有伸长的形状。该方法的目的不是使细胞以优选方向迁移，而只是促进其彼此对准以获得均匀的细胞堆叠。
[0006]文献US2009/02481445也描述了使用包含微通道或一系列彼此平行的微通道的表面根据三维结构引导细胞定向的方法，所述微通道的宽度大于细胞的宽度，以使细胞可以进入其中，以及所述微通道的横截面是任意的。关于该之前的文献，该方法的目的不是使细胞以优选方向迁移，而只是促进其彼此对准。
[0007]Mahmud等(Nature Physics2009, 4，606页)提出了棘齿形式的粘合剂图案以引导细胞迁移。所观察到的效果是基于通道的粘合剂部分和基底的非粘合剂部分之间的粘附性差异，这样当粘合剂和非粘合剂部分之间的差异特性随着时间的过去降低时，不再观察到引导细胞迁移。另外，线性通道或棘齿形式的通道上的粘附性使其可以将细胞仅保持在这些粘合剂图案上，即一维空间上，以及例如不允许组织在二维表面上的构成。最后，Mahmud等描述的图案总是垂直于由输送细胞的表面形成的平面的突起物。
[0008]可以使细胞迁移的自然现象转向的这些方法也可以在体内获得应用。
[0009]文献US2009/0093879特别提供了一种植入物，其表面上具有微米或纳米三维图案。这些图案尤其可以控制微生物或成纤维细胞在植入物表面的粘附(当后者植入生物时)，从而改进伤口愈合。
[0010]该文献US2009/0093879提出表面微米结构或纳米结构可以引导负责愈合的细胞，因此它们可以变得以有序方式构成在植入物表面。
[0011]当发生时，这种细胞迁移沿着给定方向的控制也可以在除了围绕植入物的细胞的强制构成外的医学领域中具有应用，例如细胞在伤口表面的定向的迁移或通过组织工程产生人造器官。
[0012]因此，需要可以引导细胞沿着所选方向迁移的新的装置，其效果不取决于考虑中的移动细胞类型，其使用简单，对组织不是很侵入性的且随着时间的过去稳固。
【发明内容】
[0013]对于本申请的目的，表达“引导细胞迁移”用于指使细胞优先以一个方向而不是所有其他方向迁移。换句话说，迁移的引导破坏根据考虑中的方向的迁移对称性。迁移的“引导”不同于其中细胞优先以两个相对方向迁移，而没有这些方向之一比其他方向有利的细胞迁移的“定向”。
[0014]因此，本申请的目的是提供用于引导细胞迁移的装置，所述装置包括具有用于与细胞接触的织纹表面的底层，所述织纹表面具有由突起物的网络构成的各向异性的三维结构，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
[0015]与描述限制细胞对准的通道或微通道的现有技术文献相反，本发明可以根据各向异性方向引导细胞，从而在与根据给定表面的组织构成一致的平面中形成网络。
[0016]根据第二个方面，本发明的主题还在于用于引导细胞迁移的方法，包括使细胞与具有织纹表面的底层接触，所述织纹表面具有各向异性的三维结构，所述结构由之前描述的倾斜的突起物构成。
[0017]最后，根据另 一个方面，本发明的主题是用于引导细胞迁移的试剂盒，包含具有之前描述的织纹表面的底层，所述织纹表面具有由突起物的网络构成的各向异性的三维结构，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜，以及其上用于输送细胞的支持表面。
[0018]根据本发明的装置或方法，特别是可以应用于皮肤病学、移植学和组织工程领域。
[0019]对于本申请的目的，术语“各向异性结构”或“具有各向异性几何学的结构”用于指其几何学具有根据给定轴确定的各向异性方向的结构。
[0020]在本发明上下文中，各向异性结构的各向异性的方向特别地是细胞迁移的方向。
[0021]根据本发明的装置使用具有织纹表面的底层，所述织纹表面的三维结构由倾斜突起物的网络构成。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1阐明了包含圆柱形倾斜突起物的网络的织纹表面。
[0023]图2阐明了织纹表面和支持表面之间的细胞的限制。
[0024]图3阐明了根据本发明装置的多种用途。
[0025]图3A):用于在一个方向引导细胞的简单粘合剂结构。
[0026]图3B):以约5 μ m的间隔限制织纹表面和支持表面之间的细胞。
[0027]图3C):在凝胶型软底层上应用织纹表面。
[0028]图3D):在活组织上应用织纹表面。
[0029]图4阐明了用于制备根据本发明的织纹表面的方法的多个步骤:[0030]图4A)阐明了其上淀积了涂有光敏树脂层的铬层的玻璃板。
[0031]图4(B)和(C)阐明了经由光刻工艺在光敏层上形成图案以及通过蚀刻将其转移到铬层。
[0032]图4(D)阐明了在所形成的图案上应用树脂层。
[0033]图4(E)阐明了紫外线照射树脂层。
[0034]图4(F)阐明了紫外线照射后形成的倾斜突起物。
[0035]图4 (G)阐明了 PDMS聚硅氧烷层的连续淀积。
[0036]图4⑶阐明了所形成的阴性PDMS模子。
[0037]图4(1)阐明了在阴性PDMS模子上应用构成根据本发明的织纹表面的一层材料。
[0038]图4 (J)阐明了所形成的三维表面。 [0039]图5呈现了根据本发明的织纹表面的光学显微照片。
[0040]图6表示细胞迁移24小时的平均方向的柱状图。
[0041]底层
[0042]在本申请上下文中，引导细胞迁移的技术效果借助于之前描述的特定织纹表面来获得，所述织纹表面具有由突起物的网络构成的各向异性的三维结构，当所述织纹表面接触细胞时所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
[0043]根据本发明装置的具有织纹表面，特别是微米织纹或纳米织纹表面的底层可以是粘合剂的或非粘合剂的。
[0044]粘合剂底层的选择特别可以进一步改进已经借助于使用根据本发明的特定表面的装置获得的引导细胞迁移的技术效果。
[0045]可适于根据本发明的底层的粘合剂材料可特别地是亲水性或疏水性的，当合适时，其用细胞粘附促进剂处理，以及特别选自:
[0046]-生物相容的塑料(例如通常用于细胞培养的聚苯乙烯(PS);聚硅氧烷聚合物，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，尤其是用于芯片上实验室装置的；嵌段共聚物例如苯乙烯-乙烯/ 丁烯-苯乙烯(SEBS)的凝胶，用于制备敷料；或可生物降解和可用于植入物或用作人造组织支持物的聚乳酸和羟基乙酸(PLGA，PLA:亲水性的)。这些塑料中的一些可以有利地通过氧等离子体活化以增加其亲水性或促进细胞粘附；
[0047]-陶瓷，通常为亲水性陶瓷，例如金属氧化物，或氮化物，例如玻璃(S12)、氮化硅(Si3N4)、二氧化钛(T12)或其他。这些材料用于细胞培养、实验室芯片装置和移植学。这些材料可以有利地通过氧等离子体活化以增加其亲水性或促进细胞粘附；
[0048]-惰性材料例如金、钼、钯或其氧化或氮化表面稳定的金属，例如铬或钛，其用于植入物。有利地，所述金属可用硫醇族分子处理以增加或降低其细胞粘附能力。
[0049]也可以通过化学处理所述支持材料促进细胞粘附。然后可由:
[0050]-带电聚合物(聚电解质)，其通过静电相互作用强烈吸附在氧化表面上(对于氧化物而言自然吸附，或通过使用氧等离子体活化表面人造吸附)；例如，聚L-赖氨酸(PLL)或聚鸟氨酸(PORN);或
[0051]-细胞粘附蛋白(整联蛋白)或胞外基质蛋白(纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白)或模拟这些蛋白的肽，例如RGD (精氨酰甘氨酰天冬氨酸)基序。[0052]在本发明上下文中，也可以调节底层的粘附性以优化细胞的活动性。事实上，细胞在底层上的粘附水平可以通过用粘合剂分子和非粘合剂分子的比率计量混合物处理所述粘合剂底层来调节。例如，可以使用PLL-PEG和PLL-PEG-RGD的混合物或PLL-PEG和纤维连接蛋白的混合物。
[0053]根据一个优选的实施方案，具有织纹表面的底层是非粘合剂底层，即，细胞不能附着在其上的底层，这样它们可以在不破坏细胞的情况下被移动。这些非粘合剂底层也称为抗污底层。
[0054]底层的非粘合性对应于所述底层的低蛋白吸附能力以及低细胞粘附能力，这通常使其可以限制炎性反应。
[0055]可适于根据本发明具有织纹表面的底层的非粘合剂材料可以尤其是超疏水性材料-在这种情况下使用氟聚合物(例如聚四氟乙烯(PTFE))-或凝胶，例如聚丙烯酰胺(PAM)或聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。
[0056]或者，非粘合剂底层可由通过化学处理成为非粘合性的材料组成。
[0057]使得底层成为非粘合性的化学处理可以尤其是将例如聚乙二醇(PEG)型的单分子凝胶层移植在底层上，例如氧化物上硅烷化的PEG或金属上硫醇化的PEG或与聚合电解质结合的PEG，以赋予其通过静电相互作用长久持续方式吸附在底层上的能力，在这种情况下移植聚赖氨酸-peg(pll-peg)。 [0058]优选地，非粘合材料是氟聚合物或通过化学处理成为非粘合性的材料，例如移植分子例如聚乙二醇(PEG)。
[0059]织纹表面
[0060]根据本发明装置的织纹表面具有由倾斜突起物的网络组成的各向异性三维结构。
[0061]对于本申请的目的，术语倾斜突起物的“网络”用于指倾斜突起物周期性地排列在织纹表面上以便产生规则的重复图案。
[0062]突起物的倾斜方向尤其可以施加较低摩擦力的方向，从而确定细胞移动的优先方向。根据一个【具体实施方式】，为了增加摩擦力，突起物的网络具有间距，定义为两个突起物之间的距离，其尺寸小于细胞的尺寸，这样所述细胞总是与至少两个突起物接触，尺寸优选小于20 μ m,以阻止细胞在突起物之间任意循环。
[0063]在本发明上下文中，织纹表面的尺寸大于细胞的尺寸。
[0064]优选地，突起物的网络的间距为0.1-15 μ m,更优选为5-10 μ m,更优选为约5 μ m。
[0065]在本发明上下文中，构成织纹表面的各向异性三维结构的网络的突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
[0066]尤其是，优选这些突起物相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面的倾斜角小于或等于45°，更优选为10° -45°。
[0067]优选突起物为纳米尺寸，即，从织纹表面的底层测量的其高度为约一纳米，尤其是100nm-20 μ m，以限制缺口并且避免在突起物压力下刺穿细胞。
[0068]尤其是，优选突起物的高宽比(对应于突起物的高度与直径的比例)为0.5-20，优选2-10。有利地，所述高宽比可用于调节通过细胞通过使用以下事实察觉的底层的硬度:支柱的高宽比越高，突起物的硬度越小，且因此它们在通过细胞施加的力的影响下越容易变形。[0069]例如，在标准PDMS底层中模铸的硬度为2MPa的微米支柱或纳米支柱对于
6.25的高宽比可以获得61kPa到1.9的高宽比为1.7kPa的硬度(S.Ghassemi的论JC, Columbia University, 2011，38 页(http: //academiccommons.Columbia, edu/catalog/ac:131397))。
[0070]当发生时，突起物的硬度可以诱导与底层接触的细胞的某种表型、某种分化或增殖，而同时保留根据本申请的所需细胞引导性质。事实上，已经表明，当某些细胞在较硬的底层上发育时，它们具有分化成骨细胞的倾向，而当这些相同细胞在更柔性的底层上发育时，它们具有分化成神经元细胞的倾向。
[0071]因此，在本申请上下文中，调节根据本发明的织纹表面的突起物的高宽比可能是有利的(特别是在该表面上输送细胞时)，以改变所述细胞的表型、分化和增殖。
[0072]倾斜突起物可以是任何几何形状，特别为圆柱形、锥形、金字塔形、薄层形或基本上为三角形、半椭圆形或半圆形的薄片形。
[0073]当突起物为薄层形时，它们的横截面可以是长方形或平行四边形，所述横截面定义为正交于所述薄层的轴的平面。
[0074]根据一个优选的实施方式，所述倾斜突起物是圆柱形，其尤其可以具有球形或卵形横截面，所述横截面定义为正交于所述圆柱形的轴的平面。
[0075]对于本申请的 目的，不管其形状如何，突起物的横截面落入预定直径的圆内，所述预定直径定义为所述突起物的直径。
[0076]当突起物的直径不恒定(例如当突起物是圆锥形)时，所述直径测量为位于突起物中间以上的横截面。
[0077]优选倾斜突起物的直径为1nm-1O μ m,优选0.5-3 μ m。
[0078]根据一个【具体实施方式】，由周期性地排列在织纹表面上的倾斜突起物所占据的面积为织纹表面的5-50%，优选为织纹表面的约5%。
[0079]这种由倾斜突起物的网络组成的各向异性结构例如可以通过照相平版印刷法或通过纳米打印平版印刷法获得，任选继之以各向异性干蚀刻例如反应性离子蚀刻(RIE)包括等离子炬体系(感应耦合等离子体，ICP)或DRIE (深反应性离子蚀刻)的步骤，通过在照相平版印刷法期间或在蚀刻期间倾斜样品以获得结构的倾斜。
[0080]织纹表面的产牛
[0081]具有由倾斜突起物的网络组成的各向异性三维结构的根据本发明装置的织纹表面可以通过任何本领域技术人员已知的方法来制备。
[0082]然而，开发用于制备这种类型的表面的新方法是 申请人:的荣幸。
[0083]倾斜突起物事实上可以通过浇铸聚硅氧烷聚合物(PDMS)或通过在聚硅氧烷(PDMS)模子上模铸聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)共聚物来生成。
[0084]在本发明上下文中，当倾斜突起物用于通过限制引导细胞时，优选它们可由聚硅氧烷聚合物(PDMS)制成，其表面成为非粘合性的。
[0085]根据本发明另一个具体方面，当倾斜突起物用于通过不限制而引导细胞时，优选它们可通过在如图4所示的聚硅氧烷(PDMS)模子上模铸聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)共聚物来生成。
[0086]因此，根据一个具体方面，本发明的主题是用于制备织纹表面的方法，所述织纹表面具有由突起物的网络组成的各向异性的三维结构，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜，所述方法包括:
[0087]1.尤其通过自对准光刻制备构成所述三维结构的阴性拷贝的聚硅氧烷模子，
[0088]i1.模铸构成所述三维结构的材料，
[0089]ii1.除去所述聚硅氧烷模子。
[0090]特别是，聚硅氧烷(PDMS)模子可以通过自对准光刻来制备，特别包括以下步骤:
[0091]1.将光敏树脂层淀积在光掩模上，
[0092]i1.使用具有入射角(对应于由入射光线和由掩模形成的平面的正交面形成的角度)的光源照射所述树脂层穿过所述光掩模，所述入射角影响各向异性三维结构的柱的倾斜角，
[0093]ii1.任选地，用抗污材料覆盖所述树脂的三维表面，
[0094]iv.在所述树脂的三维表面上浇铸PDMS层，以获得所述聚硅氧烷(PDMS)模子，
[0095]V.聚合后，除去所形成的PDMS模子(图4 (H))。
[0096]用于步骤1.的光掩模可以是通常用于光掩模的透明基板，例如玻璃板，在其上形成构成由吸收光的金属材料例如铬制成的掩模的图案。这些掩模通常用于光刻且是可商购或可通过本领域技术人员已知的方法制备。
[0097]例如，本领域技术人员可以通过将吸收光的金属层(特别是铬)淀积在透明基板，例如玻璃板上并通过在所述金属层上形成图案(例如孔的基质)，例如通过用铬蚀刻溶液如由MicroChem销售的ChromeEtch蚀刻来制备光学掩模。
[0098]为此，通过扫描聚焦在淀积于透明基板(玻璃板)上的光敏树脂层上的激光束来产生图案，所述透明基板预先用铬层覆盖。使树脂显影后，通过将玻璃基板浸在Ch1meEtch浴中将这些图案转移到铬层。最后，使用适当的溶剂移除用作掩模的树脂的图案。
[0099]由MicroChem销售的未使用的PR_AZ1518Cr型掩模(用铬薄层和树脂层覆盖的玻璃板)例如可以用于生产光掩模。
[0100]在步骤i中，所涂覆的树脂层的厚度尤其根据所需的柱高度来选择。例如，所述树脂是MicroChem公司销售的SU-83000环氧树脂。
[0101]一旦树脂在步骤ii中交联，优选可以使用适当的溶剂去除树脂的未被照射部分。
[0102]步骤ii中照射所选的角度限定了突起物相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面的倾斜角(图4(E))。由于光在所使用的透明基板中折射，柱的角度并不精确地总是光的角度；这取决于构成基板的材料的性质。因此本领域技术人员将根据所使用的基板调节入射角以获得所需的柱的倾斜角。
[0103]步骤ii中照射所选的角度尤其可以小于90°，优选小于45°，更优选为
10。-45。。
[0104]任选添加于步骤iii中的抗污材料例如可以是三甲基氯硅烷(TMCS)。
[0105]最后，基于所形成的PDMS模子，本发明所要求保护的各向异性三维表面通过模铸构成根据本发明所述三维结构的材料(PDMS或PLGA)，例如通过将聚硅氧烷聚合物浇铸在预先置于真空下的聚硅氧烷模子上，或在聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)共聚物的情况下通过热模铸来制备。
[0106]构成三维表面的材料固化后，将PDMS模子与三维表面样品分离，由此其具有所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜的突起物的网络(图 4(J))。
[0107]当根据本发明的各向异性三维表面通过热模铸PLGA共聚物来制备时，所述模铸在80-100°C (优选60-90°C，更优选约90°C )的温度和60_120bar (优选100_120bar，更优选约120bar)的压力下进行大约10分钟(图4(1))。冷却并将所述压力降低至大气压力后，将PDMS模子与三维表面样品分离。
[0108]因此，突起物的高度、直径和倾斜角可以由本领域技术人员通过调节所述工艺的各种参数来调节。
[0109]支持表面
[0110]在根据本发明装置的上下文中，将其中迁移被控制的细胞在称为“支持表面”的底层上输送。
[0111]放置细胞的支持表面可以是之前描述的织纹表面，或人造表面例如细胞培养表面(例如凝胶)、盖玻片、微流动通道内、或所述细胞的天然环境的表面，例如活组织表面或伤口表面。
[0112]根据本发明一个【具体实施方式】，所述细胞可以通过将它们限制于其支持表面和所述织纹表面之间来被引导。
[0113]事实上，所述细胞的限制可以增强细胞的引导，特别是当在其上输送细胞的底层是非粘合剂时。 [0114]在该实施方式中，所述支持表面和所述织纹表面之间的距离为0-10 μ m，优选3-6 μ m,这样限制后的细胞厚度为至少3_6 μ m,以允许其迁移。
[0115]当其上输送细胞的支持物是“软的”，即硬度小于约20kPa，尤其是100Pa_20kPa，优选500Pa_10kPa时，其不需要具有额外的隆起物，因为所述表面足够“软”以允许细胞不被纳米织纹底层压碎，所述细胞通过使支持表面变形来限定其限制空间。
[0116]这些“软”支持物为低硬度凝胶或细胞层型。所使用的凝胶可以是人造来源的凝胶，例如聚丙烯酰胺(PAM)或聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)，或天然来源的凝胶，例如胶原蛋白、基质凝胶或透明质酸(HA)。这些凝胶的硬度可以通过其组成和通过用于交联它们的条件来调节。
[0117]相反，当其上输送细胞的支持物的硬度大于约20kPa时，在本发明上下文中，对于所述支持物需要具有额外的隆起物以不损害所述细胞。
[0118]所述支持表面和/或所述织纹表面可以包含一个或多个额外的隆起物，其可以控制所述两个表面之间的距离。测量相对于放置这些隆起物的表面这些隆起物的高度。
[0119]所述额外的隆起物特别可以是直径为100-500μπι，且高度为l-lOym，优选3-6 μ m的柱形式，且在任何情况下具有这样一种高度，以使当支持物的硬度大于约20kPa时，限制后细胞的厚度为至少3-6 μ m。
[0120]引导细胞迁移的方法
[0121]本发明的主题还在于引导细胞迁移的方法，包括使所述细胞与具有织纹表面的底层接触，所述织纹表面具有各向异性的三维结构，所述结构由突起物组成，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
[0122]在这种方法中，织纹表面如之前所描述。[0123]也将所述细胞如之前描述的在支持表面上输送，这样可以将所述细胞限制于所述织纹表面和所述支持表面之间。
[0124]本发明的主题还在于一种装置，例如，用于引导细胞迁移的方法，其包括具有用于与细胞接触的织纹表面的底层，所述织纹表面具有由突起物的网络组成的各向异性的三维结构，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
[0125]应思
[0126]根据本发明的装置可以特别地在体内或体外引导细胞迁移中具有许多应用。
[0127]术语“体外引导”用于指在完全人造的培养基中引导细胞迁移。
[0128]例如，所述细胞可以在人造支持表面例如细胞培养表面(例如凝胶)上培养，然后将织纹表面施加在支持表面上以限制所述细胞。
[0129]在另一个实施方式中，可以将所述织纹表面集成在微流控通道的一个表面上，以引导所述微流控通道中细胞的迁移。
[0130]根据本发明的装置的织纹表面可用于研究培养细胞的迁移和增殖的生物和物理机制，或用于通过根据其迁移特征分离细胞来进行细胞分选。
[0131]或者，根据 本发明的装置可以在至少部分地用织纹引导表面覆盖的二维或三维支持物上引导细胞，以产生人造器官(组织工程)。
[0132]根据本发明的装置可以应用于需要人工和独立于其趋化性能地引导细胞的任何领域。
[0133]术语“体内引导”用于指在生物例如人类中引导细胞增殖和迁移。
[0134]在这种情况下，所述支持表面由其上施加有织纹表面的细胞的天然生理学支持物组成。
[0135]根据体内引导的一个优选的实施方式，所述织纹表面可用于引导存在于伤口表面的细胞，以促进细胞在伤口上的分布。然后所述装置是其表面具有微米结构或纳米结构的敷料。
[0136]根据体内引导的另一个实施方式，所述织纹表面可用于引导围绕假体的细胞，以促进假体周围细胞的分布。根据体内引导的又一个实施方式，所述织纹表面可用于引导围绕置于生物机体内部的内膜或敷料的细胞，以促进器官中或器官周围细胞的分布。
[0137]根据本发明的装置尤其可以是敷料、植入物、假体、人造组织支持物、微流控通道或集成通道的芯片上实验室装置的形式，优选所述装置是敷料。
【具体实施方式】
[0138]根据本发明装置的细胞迁移引导效果建立在实验室中正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的细胞培养物上。
[0139]用覆盖有倾斜圆柱体的矩形网络的聚硅氧烷(聚二甲基硅氧烷PDMS)表面覆盖NHDF细胞培养物。倾斜圆柱体的网络具有以下性质:间距4 μ m、直径1.5 μ m、高度5 μ m，并具有相对于由所述表面形成的平面的正交面40°的倾斜角(参见图2)。
[0140]倾斜圆柱体的网络通过将PDMS聚硅氧烷聚合物浇铸在聚硅氧烷(PDMS)模子上来制备，如图4所示。[0141]所述聚硅氧烷(PDMS)模子使用通过自对准光刻产生的模子来制备。
[0142]为此，由覆盖有铬薄层和AZ1518树脂层的玻璃板(由MicroChem销售，称为PR-AZ1518Cr)组成的光掩模用作基础基板。
[0143]在这种孔基质的情况下，通过扫描聚焦在所述光敏层上的激光束(图4(B))继之以树脂显影步骤在所述光敏树脂层上制备图案。
[0144]然后将这些图案通过湿法蚀刻(Ch1meEtch)转移到吸收光的铬层上，并用异丙醇移除树脂图案(图4(C))。
[0145]然后将由MicroChem公司销售的约5 μ m厚的SU-83005环氧树脂的厚层淀积在包含之前定义的图案的玻璃板上(图4(D))。
[0146]然后翻转包含所述树脂层的玻璃板，以使紫外线以大约70°的入射角照射在玻璃板侧，这样所述圆柱体相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面的倾斜角是40° (图4(E))。
[0147]将倾斜圆柱体显影在树脂表面上之后，用抗污材料(三甲基氯硅烷或TMCS)覆盖由此形成的所述树脂的三维表面。
[0148]然后所形成的三维表面用于制备聚硅氧烷(PDMS) “反模”以产生所述模子的阴性拷贝。为此，将PDMS/交联剂(RTV615A，General Electric在70°下交联Ih)的混合物倾倒在抗污处理的树脂表面上(图4 (G))。一旦交联，将PDMS层与三维表面分离，从而形成所述表面的阴模(图4(H) )。
[0149]最后，根据本发明的倾斜圆柱体的网络通过将PDMS/交联剂(RTV615A，GeneralElectric在70°下交联Ih)的混合物浇铸在置于真空下I小时后的模子上来获得(图5)。
[0150]此外，聚硅氧烷表面通过宽的柱(高5 μ m和直径400 μ m)来支持，每毫米放置并在PDMS中模铸。
[0151]因此将培养中的细胞与倾斜圆柱体接触，不完全被它们压碎，在两个表面之间的间距为5 μ m，从而以受限制的方式迁移(图2)。
[0152]覆盖有倾斜圆柱体的网络的聚硅氧烷表面通过移植聚(L-赖氨酸)和聚乙二醇(PLL-g-PEG)的化学处理而成为非粘合性的。
[0153]细胞(NHDF)培养底层的部分也由用纤维连接蛋白(50 μ g/ml)处理的PDMS组成。
[0154]意外地,观察到在覆盖有倾斜圆柱体的表面下，NHDF优先以圆柱体的倾斜方向迁移。图6代表细胞迁移24小时的平均方向的柱状图。所表示的设置的各要素表明在限制后的24小时期间内细胞的平均方向。这里描绘了 75个细胞。
[0155]在具有直径1.5μπι和以下高度h、突起物之间的距离d和相对于正交面的倾斜角度α的多种突起物网络中也观察到这种效果:
[0156](h, d, a) = (7 μ m, 4 μ m, 80° ),
[0157](h，d，a) = (7.5 μ m，7 μ m，60° ),
[0158](h, d, a) = (5 μ m, 5 μ m, 45° ),
[0159](h, d, a) = (7 μ m, 4 μ m, 80° ),
[0160](h，d，a) = (4 μ m，4 μ m，60° ),
[0161](h, d, a) = (4 μ m, 6.5 μ m, 60° ),
[0162](h, d, a) = (4 μ m, 9 μ m, 60° )和[0163](h，d，a) = (4 μ m，11.5 μ m，60° )，
[0164]所述突起物由多 种材料(PDMS，聚(乳酸-共-羟基乙酸)PLGA)制成。
【权利要求】
1.用于引导细胞迁移的装置，包括具有用于与细胞接触的织纹表面的底层，所述织纹表面具有由突起物的网络构成的各向异性的三维结构，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
2.权利要求1所述的引导装置，其特征在于突起物的所述网络的间距小于细胞尺寸，优选小于20 μ m,更优选为0.1-15 μ m,更优选为5-10 μ m,和甚至更优选为约5 μ m。
3.权利要求1或2所述的引导装置，其特征在于所述倾斜的突起物相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面的倾斜角小于或等于45°，更优选为10° -45°。
4.权利要求1至3任一项所述的引导装置，其特征在于对应于所述突起物的高度与直径的比例的所述倾斜的突起物的高宽比为0.5-20，优选2-10。
5.权利要求1至4任一项所述的引导装置，其特征在于所述倾斜的突起物为圆柱形，尤其具有球形或卵形横截面、锥形、金字塔形、薄层形，尤其具有长方形或平行四边形横截面、或薄片形，基本上为三角形、半椭圆形或半圆形。
6.权利要求1至5任一项所述的引导装置，其特征在于所述倾斜的突起物是直径为1nm-1O μ m,优选0.5-3 μ m的圆柱形。
7.权利要求1至6任一项所述的引导装置，其特征在于所述具有织纹表面的底层是粘合剂的。
8.权利要求1至6任一项所述的引导装置，其特征在于所述具有织纹表面的底层是非粘合剂的。
9.权利要求8所述的引导装置，其特征在于所述非粘合剂底层由非粘合剂材料例如氟聚合物或通过化学处理例如移植聚乙二醇(PEG)分子成为非粘合性的材料组成。
10.权利要求1至9任一项所述的引导装置，其特征在于所述装置是敷料、植入物、假体、人造组织支持物、微流控通道或集成通道的芯片上实验室装置的形式，优选所述装置是敷料。
11.用于引导细胞迁移的方法，包括使细胞与具有织纹表面的底层接触，所述织纹表面具有各向异性的三维结构，所述结构由权利要求1至9定义的倾斜突起物构成。
12.权利要求11所述的引导方法，其特征在于将所述细胞在支持表面上输送。
13.权利要求12所述的引导方法，其特征在于所述支持表面是人造表面，例如细胞培养表面(例如凝胶)、玻璃盖玻片、微流控通道内、或所述细胞的天然环境的表面，例如活组织表面或伤口表面。
14.权利要求12或13所述的引导方法，其特征在于将所述细胞限制于所述支持表面和所述织纹表面之间。
15.权利要求12至14任一项所述的引导方法，其特征在于所述支持表面和所述织纹表面之间的距离为0-10 μ m,优选3-6 μ m。
16.权利要求12至15任一项所述的引导方法，其特征在于所述支持表面和/或所述织纹表面包含一个或多个额外的隆起物，其可以控制所述两个表面之间的距离。
17.权利要求16所述的引导方法，其特征在于所述额外的隆起物是直径为100-500 μ m,且高度小于10 μ m,优选3-6 μ m的柱形式。
18.用于制备织纹表面的方法，所述织纹表面具有由权利要求1至9任一项所述的倾斜突起物的网络构成的各向异性三维结构，所述方法包括:. i.制备构成所述三维结构的阴性拷贝的聚硅氧烷模子，特别是通过自对准光刻， i1.模铸构成所述三维结构的材料， ii1.除去所述聚硅氧烷模子。
19.前述权利要求所述的制备方法，其特征在于制备聚硅氧烷(PDMS)模子的步骤i通过自对准光刻来进行，其特别是包括以下步骤: .1.使光敏树脂层淀积在光掩模上， ?.使用具有入射角(对应于由入射光线和由掩模形成的平面的正交面形成的角度)的光源经过所述光掩模照射所述树脂层，所述入射角调节各向异性三维结构的柱的倾斜角， ii1.任选地，用抗污材料覆盖所述树脂的三维表面， IV.在所述树脂的三维表面上浇铸PDMS层，以获得所述聚硅氧烷(PDMS)模子， V.聚合后，除去所形成的PDMS模子(图4(H))。
20.前述权利要求所述的制备方法，其特征在于树脂在步骤ii中交联后，使用适当的溶剂去除树脂的未照射部分。
21.权利要求19 或20所述的制备方法，其特征在于任选添加于步骤iii中的抗污材料是三甲基氯硅烷(TMCS)。
22.权利要求18至21任一项所述的制备方法，其特征在于所述各向异性三维表面通过模铸构成本发明的三维结构的材料(PDMS或PLGA)，例如通过使聚硅氧烷聚合物在预先置于真空下的聚硅氧烷模子上浇铸，或在聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)共聚物的情况下通过热模铸来制备。
23.前述权利要求所述的制备方法，其特征在于所述各向异性三维表面通过热模铸PLGA共聚物来制备，所述模铸在80-10(TC (优选60-90°C，更优选约90°C )的温度和60-120bar (优选100_120bar，更优选约120bar)的压力下进行大约10分钟。
24.前述权利要求 所述的制备方法，其特征在于冷却并将所述压力降低至大气压力后，使所述PDMS模子与三维表面样品分离，所述三维表面因此具有突起物的网络，所述突起物的由所述各向异性结构赋予的方向相对于由所述织纹表面形成的平面的正交面倾斜。
【文档编号】C12N5/00GK104039951SQ201280045314
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年9月17日 优先权日:2011年9月19日
【发明者】M·勒贝尔, M·皮埃尔, 陈勇, 刘妍君 申请人:居里研究所, 国家科学研究中心, 发展与工业研究公司