增加植物中病毒样颗粒的产率的制作方法

增加植物中病毒样颗粒的产率的制作方法
【专利摘要】提供一种在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。该方法包括将第一核酸和第二核酸引入该植物或该植物的部分。该第一核酸包含在植物中具有活性并且有效连接到编码病毒结构蛋白之核苷酸序列的第一调节区。第二核酸包含在植物中具有活性并且有效连接到编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之核苷酸序列的第二调节区。将该植物或该植物的部分在容许该核酸表达的条件下培养，从而生产VLP。
【专利说明】增加植物中病毒样颗粒的产率
【技术领域】
[0001]本发明涉及在植物中生产病毒蛋白。更特别地，本发明涉及在植物中生产并且增加病毒样颗粒生产。
【背景技术】
[0002]流行性感冒是由正粘病毒科(orthomyxoviridae)的RNA病毒引起。这些病毒有三种类型并且它们引起三个不同类型的流行性感冒:甲型、乙型与丙型。甲型流感病毒感染哺乳动物(人、猪、雪紹、马)以及鸟类。由于此类型病毒是已造成全世界流行病，因此对于人类是非常重要的。乙型流感病毒(又简称为乙型流感)仅感染人类。它偶尔引发流感的地方性爆发。丙型流感病毒亦仅感染人类。它们感染大多数年轻的人类并且鲜少造成严重的疾病。
[0003]疫苗接种通过在感染前诱导对象建立防御而提供对由类似物质引起之疾病的保护。通常，通过使用活的减毒形式或完整的失活形式的感染性物质作为免疫原而实现这一目的。为了避免使用全病毒(例如杀死的或减弱的病毒)作为疫苗的危险，已将重组病毒蛋白例如亚单位(subunit)实行为疫苗。肽与亚单位疫苗两者皆受到一些潜在的限制。由于不正确的折叠或差的抗原呈递，亚单位疫苗可能表现差的免疫原性。主要问题为确保工程蛋白质的构型模拟抗原在其自然环境中之构象的困难。必须使用适合的佐剂以及对于肽来说使用载体蛋白来加强免疫应答。此外，这些疫苗主要引起体液应答，并因此可能无法引起有效的免疫。亚单位疫苗对于可证实以完整的失活病毒提供保护的疾病经常是无效的。
[0004]病毒样颗粒(VLP)为纳入免疫原性组合物的潜在候选。VLP十分近似于成熟的病毒粒子，但它们不包含病毒的基因组物质。因此，VLP本质上为不可复制的，使得将它们作为疫苗施用是安全的。此外，可将VLP改造为在VLP的表面上表达病毒糖蛋白，这是其最天然的生理构型。此外，因为VLP类似完整的病毒粒子并且为多价颗粒结构，所以比起可溶的包膜蛋白抗原，VLP在引发对糖蛋白的中和抗体上可能是更有效。
[0005]已在植物中(W02009/009876 ；W02009/076778 ；W02010/003225 ；W02010/003235 ；W0201I/03522 ；W02010/148511 ;将其通过参考并入本文)，以及在昆虫和哺乳动物系统中(Noad, R.and Roy, P.,2003, Trends Microbiol11:438-44 ；Neumann et al.,2000，J.Virol.，74，547-551)生产 VLP。Latham 与 Galarza (2001，J.Virol.，75，6154-6165)报道了在以共表达血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中流感VLP的形成。此研究证实了于真核细胞中共表达后流感病毒粒子蛋白的自组装，以及需要 Ml 基质蛋白供 VLP 产生。然而，Gomez-Puertas et al.(1999, J.Gen.Virol,80，1635-1645)亦显示M2的过表达完全阻断CAT RNA传输至MDCK培养物。
[0006] M2作用为离子通道蛋白并且已显示当过表达此蛋白质时，共表达的HA之胞内运输被抑制，以及血细胞凝集素(HA)在细胞膜的累积减少75-80% (Sakaguchi et al.，1996 ;Henkel&WeiSZ，1998)。此外，通过过表达M2，病毒膜蛋白在细胞膜的累积降低，因而产生的功能性VLP数目急剧降低。[0007]M2蛋白于甲型流感感染的细胞之细胞表面丰富地表达(Lamb et al.(1985)Cell，40,627至633)。亦在病毒颗粒本身的膜发现此蛋白质，但量少得多，每病毒粒子14至68分子的 M2 (Zebedee and Lamb (1988) J.Virol.62, 2762 至 72)。通过在位置 50 之半胱氨酸上添加棕榈酸，M2蛋白被翻译后修饰(Sugrue et al.(1990) Virologyl79, 51至56)。
[0008]M2蛋白为由两个二硫键连接的二聚体构成的同型四聚体，其通过非共价相互作用保持在一起(Sugrue 与Hay (1991) Virologyl80,617至624)。通过定点诱变(site-directedmutagenesis), Holsinger 与 Lamb, (1991) Virologyl83, 32 至 43,证实于第 17 以及第 19 位的半胱氨酸残基涉及二硫键桥形成。仅有位于第17位的半胱氨酸存在于所有分析的病毒中。在半胱氨酸19亦存在的病毒株中，不清楚第二个二硫键桥是否在相同二聚体(已通过Cysl7-Cysl7连接)中形成还是伴随其它二聚体形成。
[0009]Smith 等人(美国专利申请书 2010/0143393)以及 Song 等人(Plos0NE20116 (I):el4538)描述含有流感M2蛋白的疫苗与VLP。VLP包含至少病毒核心蛋白，例如Ml。所述核心蛋白驱动出芽以及颗粒从昆虫宿主细胞中释放。
[0010]Szecsi et al.(Virology Journal, 2006, 3:70)在衍生自鼠类白血病病毒(MLV)的复制缺陷型核心颗粒上组装VLP。此经改造的流感VLP系衍生自:瞬时共表达细胞表面(HA、NA、M2)以及内部病毒组分(Gag、GFP标记基因组)并且锚定于其表面HA、HA和NA或M2、或者所有三种衍生自H7N1或H5N1病毒的蛋白质。根据Szecsi et al.，在FIu-VLP生产期间M2的表达不影 响HA或NA合并至病毒颗粒上(Szecsi et al.中的第2页，右栏，第二段)。

【发明内容】

[0011]本发明涉及在植物中生产病毒蛋白。更特别地，本发明涉及在植物中生产以及增加病毒样颗粒生产。
[0012]本发明的一个目标为提供增加植物中病毒样颗粒生产的改良方法。
[0013]根据本发明，提供了在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法(A)，其包括
[0014]a)将第一核酸引入至植物或植物的部分，所述第一核酸包含在植物中具有活性且有效连接至编码结构病毒蛋白之核苷酸序列的第一调节区，
[0015]b)将第二核酸引入，所述第二核酸包含在植物中具有活性且有效连接至编码通道蛋白之核苷酸序列的第二调节区，
[0016]c)在容许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物的部分，从而生产VLP。
[0017]在植物中具有活性的第一调节区和在植物中具有活性的第二调节区可以是相同或不同的。
[0018]上述方法㈧中的通道蛋白可为质子通道蛋白。该质子通道蛋白可选自M2或BM2。此外，质子通道蛋白可包含质子通道特征序列HXXXW。M2蛋白可为从流感A/波多黎各(Puerto Rico) /8/1934 (SEQ ID NO:14)或从流感A/新喀里多尼亚(NewCaledonia)/20/1999 (SEQ ID NO:11)获得之 M2 蛋白。
[0019]本发明亦提供如上所述的方法(A)，其中所述病毒结构蛋白包含三聚化结构域。此外，编码该病毒结构蛋白的核苷酸序列包含嵌合核苷酸序列，其依序编码抗原性病毒蛋白或其片段、流感跨膜结构域以及胞质尾。该病毒结构蛋白可包含流感HA蛋白质。此外流感HA蛋白中的一个或更多个蛋白水解环可被缺失。
[0020]本发明提供如上所述之方法(A)，其中编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可选自BHA、C，HA、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、Hll、H12、H13、H14、H15 与 H16。例如，编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可为乙型HA或H3。编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可为例如来自流感 B/ 布里斯班(Brisbane)/60/2008> B/ 马来西亚(Malaysia)/2506/2004 或 B/ 威斯康辛(Wisconsin)/1/2010的HA，或来自流感A/珀斯(Perth)/16/2009或A/维多利亚(Victoria)/361/2011的H3。此外，编码病毒结构蛋白的核苷酸序列具有与SEQ ID NO:23、
28、43、46、51、57或61的至少70%序列同一性。病毒结构蛋白的序列亦可包含SEQ ID NO:25、30、41、48、54、58 或 64 的序列。
[0021]本发明亦包括如上所述之方法(A)，其中所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒属(comovirus)增强子、编码病毒结构蛋白的核苷酸序列以及一个或多于一个的双生病毒(geminivirus)扩增元件有效连接的第一调节区，以及将编码双生病毒复制酶的第三核酸引入所述植物或所述植物的部分。所述一个或多于一个的豇豆花叶病毒属增强子可为豇豆花叶病毒属UTR，例如，豇豆花叶病毒超翻译(CPMV-HT)UTR，(例如CPMV-HT5’和/或3’UTR)。所述一个或多于一个的双生病毒扩增元件可选自豆黄矮病毒(Bean Yellow Dwarf ViruS)长基因间区域(BeanYellow Dwarf Virus longintergenic region, BeYDV LI R)以及 BeYDV 短基因间区域(Bean Yellow Dwarf Virusshort intergenic region, BeYDVSIR)。此外,编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可为乙型HA或H3，例如，编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可具有与SEQ ID NO:23、28、43、46、51、57或61至少70%的序列同一性。病毒结构蛋白的序列亦可包含SEQ ID NO:25、30、41、48、54、58或64的序列。
[0022]如上所述的方法(方法A)亦可涉及引入例如HcPio或pl9的编码沉默性阻遏蛋白(suppressor ofsilencing)的另一核酸序列。
[0023]本发明亦包括如上所述的方法(A)，其中在引入步骤中(步骤a)，核酸在植物中瞬时表达。作为替代地，在引入步骤中(步骤a)，核酸于植物中稳定地表达。
[0024]如上所述的方法(A)可进一步包括步骤:
[0025]d)收获所述植物并纯化VLP。
[0026]本发明亦包括如上所述的方法(A)，其中所述VLP不包含病毒基质或核心蛋白。
[0027]本发明提供由如上所述之方法(A)生产的VLP。所述VLP可进一步包含一种或多于一种的衍生自植物的脂质。该VLP亦可以不包含通道蛋白为特征。此外，VLP的病毒结构蛋白可为HAO蛋白。包含VLP的一种或更多种病毒蛋白可包含植物特异性的N-聚糖或经修饰的N-聚糖。本发明亦提供使用该VLP制备的多克隆抗体。
[0028]本发明包括用于诱导免疫应答的含有有效剂量的如上所述的VLP以及药学上可接受之载体的组合物。
[0029] 本发明亦包括在对象中对流感病毒感染诱导免疫的方法，其包含将如上所述之VLP施用于对象。可将VLP经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于对象。
[0030]本发明亦提供包含由上述之方法(A)所生产的VLP的植物物质。所述植物物质可用于在对象中诱导对流感病毒感染的免疫。该植物物质亦可被混合作为食物增补剂(foodsupplement)。[0031]本发明亦提供生产病毒样颗粒(VLP)之方法(B)，其包括
[0032]a)提供植物或植物的部分，其包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含在植物中具有活性且有效连接到编码病毒结构蛋白之核苷酸序列的第一调节区，至所述植物或植物的部分中，所述第二核酸包含在植物中具有活性且有效连接到编码通道蛋白之核苷酸序列的第二调节区。
[0033]b)在容许核酸表达的条件下培养所述植物或所述植物的部分，从而生产VLP。
[0034]在植物中具有活性的第一调节区和在植物中具有活性的第二调节区可以是相同或不同的。
[0035]上述方法(B)中的通道蛋白可为质子通道蛋白。所述质子通道蛋白可选自M2或BM2。此外，质子通道蛋白可包含质子通道特征序列HXXXW。
[0036]本发明亦提供如上所述的方法(B)，其中所述病毒结构蛋白包含三聚化结构域(trimerization domain)。此外,编码该病毒结构蛋白的核苷酸序列包含嵌合核苷酸序列，其依序编码抗原性病毒蛋白或其片段、流感跨膜结构域以及胞质尾。该病毒结构蛋白可包含流感HA蛋白。此外流感HA蛋白中的一个或更多个蛋白水解环可被缺失。
[0037]本发明提供如上所述之方法(B)，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可选自 B HA、C，HA、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 与 H16。例如，编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可为乙型HA或H3。编码病毒结构蛋白的核苷酸序列可为例如来自流感B/布里斯班/60/2008、B/马来西亚/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010的HA，或来自流感A/珀斯/16/ 2009或A/维多利亚/361/2011的H3。
[0038]本发明亦包括如上所述之方法(B)，其中所述第一核酸序列包含与一个或多于一个的豇豆花叶病毒属(comovirus)增强子、编码病毒结构蛋白的核苷酸序列以及一个或多于一个的双生病毒(geminivirus)扩增元件有效连接的第一调节区，以及将编码双生病毒复制酶的第三核酸引入所述植物或所述植物的部分。一个或多于一个的豇豆花叶病毒属增强子可为豇豆花叶病毒属UTR，例如，豇豆花叶病毒超翻译(CPMV-HT) UTR (如CPMV-HT5’和/或3’UTR)。此外，一个或多于一个的双生病毒扩增元件可选自豆黄矮病毒(Bean YellowDwarf ViruS)长基因间区域(BeYDVLIR)以及BeYDV短基因间区域(BeYDV SIR)。
[0039]如上所述的方法(方法B)亦可涉及引入编码沉默性阻遏蛋白(例如HcPiX)或pl9)的另一核酸序列。
[0040]本发明亦包括如上所述的方法(B)，其中在引入步骤中(步骤a)，核酸为在植物中瞬时表达。作为替代地，在引入步骤中(步骤a)，核酸于植物中稳定地表达。
[0041]如上所述的方法(B)可进一步包括步骤:
[0042]d)收获所述植物并纯化VLP。
[0043]本发明亦包括如上所述的方法(B)，其中所述VLP不包含病毒基质或核心蛋白。
[0044]本发明提供由如上所述之方法(B)生产的VLP。所述VLP可进一步包含一种或多于一种衍生自植物的脂质。该VLP亦可以不包含通道蛋白为特征。此外，VLP的病毒结构蛋白可为HAO蛋白。包含VLP的一种或更多种病毒蛋白可包含植物特异性的N-聚糖或经修饰的N-聚糖。本发明亦提供使用该VLP制备的多克隆抗体。
[0045]本发明包括用于诱导免疫应答的含有有效剂量的如上所述VLP以及药学上可接受之载体的组合物。[0046]本发明亦包括在对象中诱导对流感病毒感染之免疫的方法，其包含将如刚才所描述之VLP施用于对象。可将VLP以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于对象。
[0047]本发明亦提供含有由上述之方法(B)所生产的VLP之植物物质。所述植物物质可用于在对象中诱导对流感病毒感染的免疫。该植物物质亦可被混合作为食物增补剂。
[0048]本发明提供包含SEQ ID NO:41 (来自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失之蛋白水解环的roiSP/HA)之氨基酸序列的多肽，以及编码SEQ ID NO:41的多肽之核酸序列。该核酸序列可包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列。本发明提供包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列之多肽的VLP。此VLP可进一步包含衍生自植物的一种或多于一种的脂质。此VLP亦可以不包含通道蛋白为特征。此VLP可包含植物特异性N-聚糖或经修饰的N-聚糖。本发明提供包含有效剂量之包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列、用于诱导免疫应答的VLP以及药学上可接受的载体之组合物。本发明亦包括诱导对象中对流感病毒感染之免疫的方法，其包含将含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列之VLP施用于对象。可将VLP以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。本发明亦提供包含含有SEQ ID N0:41的氨基酸序列之VLP的植物物质。可将植物物质用于诱导对象中对流感病毒感染的免疫。该植物物质亦可被混合作为食物增补剂。
[0049]通过共表达病毒结构蛋白和通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)，观察到病毒结构蛋白以及VLP的产率增加。已知HA经历pH依赖性构象变化。不希望被理论所约束地，于成熟与迁移作用期间，HA生产细胞之高尔基体(Golgi apparatus)内的pH可能影响HA折叠，影响HA的稳定性以及增加降解，或其组合。通过共表达通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)和HA，高尔基体内的pH可增加，并且造成稳定增加、降解减少或其组合，而增加HA产率。
[0050]本发明的上述概要不一定描述了本发明的所有特征。
【专利附图】

【附图说明】
[0051]本发明的这些与其它特征将参考附图由下列描述而变得更明显，其中:
[0052]图1A 显示引物 IF-H5A-1-05.sl+3c(SEQ ID NO:2)。图1B 显示引物 IF_H5dTm.r(SEQ ID NO:3)。图1C显示构建体1191的示意图。图1D显示构建体1191 (SEQ ID N04)。图1E显示表达盒(expression cassette)编号489 (SEQ ID N05)。图1F显示来自流感A/印度尼西亚(Indoneisa)/5/2005 (HSNl)的H5氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。图1G显示编码来自流感A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1)的H5之核酸苷酸序列(SEQ ID NO:42)。
[0053]图 2A显示引物 IF-S1-M1+M2ANC.c(SEQ ID NO:7)。图 2B 显示引物 IF-S1-4-M2ANC.r(SEQ ID NO:8) ?图2C显示合成M2基因的核苷酸序列(与来自GenBank登录号DQ508860连接至715-982之ntl-26相对应)(SEQ ID NO:9)。图2D显示由2X35S启动子至NOS终止子之表达盒编号1261。将来自流感A/新喀里多尼亚/20/1999的M2 (HlNl)加下划线(SEQID NO: 10)。图2E显示来自流感A/新喀里多尼亚/20/1999 (HlNl)的M2氨基酸序列(SEQID NO:11)。
[0054] 图3A显示合成的M2基因的核苷酸序列(与来自GenBank登录号EF467824的nt26-51连接nt740-1007相对应)(SEQ ID N0:12)。图3B显示由2X35S启动子至NOS终止子之表达盒编号859。将来自流感A/波多黎各/8/1934 (HlNl)之M2加下划线(SEQ IDN0:13)。图3C显示来自流感A/波多黎各/8/1934 (HlNl)之M2的氨基酸序列(SEQ ID NO:
14)。
[0055]图 4A 显示引物 IF-H1A-C-09.s2+4c (SEQ ID NO:15)。图 4B 显示引物 IF-H1A-C-09.sl-4r(SEQ ID NO: 16)。图4C显示合成的Hl基因的核苷酸序列(GenBank登录号FJ966974)(SEQ ID NO:17)。图4D显示构建体1192的示意图。示意图上注有用于质粒线性化的SacII与StuI限制性内切酶位点。图4E显示构建体1192，由左至右t-DNA边界(加下划线)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默性抑制子表达盒之2X35S/CPMV-HT/roiSP/N0S(SEQ ID NO:18)。图4F显示由2X35S启动子至NOS终止子之表达盒编号484。将来自流感A/加利福尼亚(California)/7/2009 (HlNl)的 TOISP/H1 加下划线(SEQ ID NO:19) ? 图 4G 显示来自流感A/加利福尼亚/7/2009 (HlNl)的HHSP-Hl的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)。
[0056]图5A 显示引物 IF-S2+S4-H3Per.c (SEQ ID NO:21)。图 5B 显示引物IF-Sla4-H3Per.r(SEQ ID NO:22)。图5C显示合成的H3基因的核苷酸序列(与来自GenBank 登录号 GQ293081 的 nt26_1726 相对应)(SEQ ID NO:23)。图显示由 2X35S 启动子至NOS终止子之表达盒编号1019。将来自流感A/珀斯/16/2009 (H3N2)的HHSP/H3加下划线(SEQ ID NO:24) ?图5E显示来自流感A/珀斯/16/2009 (H3N2)的HHSP/H3氨基酸序列(SEQ ID NO:25)。
[0057]图 6A 显示引物 IF-S2+S4-B Bris.c (SEQ ID NO:26)。图 6B 显示引物 IF_Sla4_BBris.r (SEQ ID NO:27)。图6C显示合成的HA B布里斯班基因的核苷酸序列(与来自GenBank登录号FJ7668 40的nt34_1791相对应)(SEQ ID NO:28)。图6D显示表达盒编号1029由2X35S启动子至NOS终止子之核苷酸序列。将来自流感B/布里斯班/60/2008的roiSP/HA加下划线。(SEQ ID NO:29)。图6E显示来自流感B/布里斯班/60/2008的I3DISP/HA的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)。图6F显示构建体1194的示意图。示意图上注有用于质粒线性化的SacII与StuI限制性内切酶位点。图6G显示构建体1194，从左至右t_DNA边界(加下划线)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默性抑制子表达盒的2X35S/CPMV-HT/PDISP/N0S 至 BeYDV+复制酶扩增系统(SEQ ID NO:31)。图 6H显示由 BeYDv 左 LIR至 BeYDv右LIR的表达盒编号1008。将来自流感B/布里斯班/60/2008的TOISP/HA加下划线(SEQID NO:32)。
[0058]图 7A显示引物 dTmH51-B Bris.r (SEQ ID NO:33)。图 7B 显示引物B Bris-dTmH51.c (SEQ ID NO:34)。图 7C 显示引物 IF-SlaS4_dTmH5L r (SEQ ID NO:35)。图 7D 显示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表达盒编号1009。将PDISP/HA B布里斯班/H5Indo TMCT加下划线(SEQ ID N0:36)。图7E显示TOISP/HA B布里斯班/H5Indo TMCT的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)。
[0059]图 8A 显示引物 1039+1059.r (SEQ ID NO:38)。图 8B 显示引物 1039+1059.c (SEQID N0:39)。图8C显示由BeYDV左LIR至BeYDV右LIR的表达盒编号1059。将来自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解环的roiSP/HA加下划线(SEQ ID NO:40)。图8D显示来自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解环的TOISP/HA之氨基酸序列(SEQ ID NO:41)。图8E显示来自流感B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解环的TOISP/HA之核苷酸序列(SEQ ID NO:43)。[0060]图9显示构建体编号1008的质粒图谱。构建体编号1008引导来自流感株B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表达。此构建体包含用于DNA扩增的BeYDV衍生元件。
[0061]图10显示构建体编号1009的质粒图谱。构建体编号1009引导来自流感株B/布里斯班/60/2008的嵌合HA之表达，其中跨膜结构域以及胞质尾以来自流感A/印度尼西亚/05/2005之H5的那些所取代。此构建体包含用于DNA扩增的BeYDV衍生元件。
[0062]图11显示构建体编号1029的质粒图谱。构建体编号1029引导来自流感株B/布里斯班/60/2008的野生型HA的表达。
[0063]图12显示构建体编号1059的质粒图谱。构建体编号1059引导来自流感株B/布里斯班/60/2008的具有缺失的蛋白水解环之突变型HA的表达。此构建体包含用于DNA扩增的BeYDV衍生元件。
[0064]图13显示构建体编号1019的质粒图谱。构建体编号1019引导来自流感株A/珀斯/16/2009 (H3N2)的野生型H3的表达。
[0065]图14显示构建体编号484的质粒图谱。构建体编号484引导来自流感株A/加利福尼亚/07/2009 (HlNl)的野生型Hl的表达。
[0066]图15显示构建 体编号489的质粒图谱。构建体编号489引导来自流感株A/印度尼西亚/05/2005 (H5N1)的野生型H5的表达。
[0067]图16显示构建体编号1261的质粒图谱。构建体编号1261引导来自流感株A/新喀里多尼亚/20/99 (HlNl)的野生型M2的表达。
[0068]图17显示构建体编号859的质粒图谱。构建体编号859引导来自流感株A/波多黎各/8/34 (HlNl)的野生型M2的表达。
[0069]图18显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。将来自B/布里斯班/60/2008的HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99的M2共表达。“C+”:阳性对照，来自澳大利亚药物管理局(Therapeutic GoodsAdministration)之半纯化的B/布里斯班/60/2008病毒；“c 一”:阴性对照,模拟渗透植物；“ 1008”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表达；“1008+1261”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/布里斯班/60/2008的野生型HA与M2的共表达；“ 1009+1261”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/布里斯班/60/2008的嵌合HA与M2的共表达；“ 1029”:在扩增元件(BeYDV)不存在下，来自B/布里斯班/60/2008的野生型HA之表达；“1029+1261”:在扩增元件(BeYDV)不存在下，来自B/布里斯班/60/2008的野生型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99的M2之共表达。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agrobacterium)培养物的比。
[0070]图19显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。道“C+”:阳性对照，来自澳大利亚药物管理局之半纯化A/威斯康辛/15/2009 (H3N2)病毒；“C_”，阴性对照，模拟渗透植物；“1019”:来自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型 HA 的表达1019+1261”:来自 A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agrobacterium)培养物的比。
[0071]图20显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。道“C+”:阳性对照，来自NIBSC病毒之半纯化A/加利福尼亚/7/2009 (HlNl) NYMC X_179A(NIBSC 码 09/146) ;“C_”，阴性对照，模拟渗透的植物;“484”:来自A/加利福尼亚/7/2009 (HlNl)之野生型HA的表达；“484+1261”:来自A/加利福尼亚/7/2009 (HlNl)之野生型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agrobacterium)培养物的比。
[0072]图21显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。道“C+”:阳性对照,来自Immune Technology Corporation(产品编号IT-003-052p)之A/印度尼西亚/05/2005的纯化重组H5 ;“C_”，阴性对照，模拟渗透的植物；“489”，来自A/印度尼西亚/5/05(Η5Ν1)之野生型HA之表达；“489+1261 ”:来自A/印度尼西亚/5/05 (H5N1)之野生型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达。
[0073]图22A显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。“1008”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/布里斯班/60/2008的野生型HA的表达；“ 1008+1261”:在扩增元件(BeYDV)存在下来自B/布里斯班/60/2008的野生型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达；“ 1059”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/布里斯班/60/2008的突变型HA的表达；“ 1059+1261 ”:在扩增元件(BeYDV)存在下来自B/布里斯班/60/2008的突变型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达。分析来自三个不同渗透之植物(A、B与C)。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agrobacterium)培养物的比。图22B显示提取自HA生产植物的粗蛋白质的血细胞凝集能力之比较。
[0074]图23显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。图23A:“1059”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/布里斯班/60/2008的突变 型HA的表达；“ 1059+1261”:在扩增元件(BeYDV)存在下来自B/布里斯班/60/2008的突变型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达。“ 1059+859”:在扩增元件(BeYDV)存在下来自B/布里斯班/60/2008的突变型HA与来自A/波多黎各/8/34之M2的共表达。分析来自三不同渗透之植物(A、B与C)。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agrobacterium)培养物的比。图23B 1019”:来自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA的表达；“ 1019+1261”:来自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99之M2的共表达；“1019+859”:来自A/珀斯/16/2009 (H3N2)之野生型HA与来自A/波多黎各/8/34之M2的共表达。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agribacterium)培养物的比。
[0075]图24显示来自几株流感的HA的序列比对。以箭头指出前体HAO的切割位点。
[0076]图25A 显示引物 IF-H3V36111.S2+4c (SEQ ID NO:44)。图 25B 显示引物IF-H3V36111.sl-4r(SEQ ID NO:45)。图25C显示合成的H3基因之核苷酸序列(与来自GISAID 分离号 EPI ISL101506 之 HA 序列的 nt25 至 1725 相对应)(SEQ ID NO:46)。图 25D显示由2X35S启动子至NOS终止子的表达盒编号1391之核苷酸序列。将来自流感A/维多利亚/361/2011 (H3N2)的PDISP/H3加下划线(SEQ ID NO:47)。图25E显示来自流感A/维多利亚/361/2011 (H3N2)的PDISP-H3的氨基酸序列(SEQ ID NO:48)。图25F显示构建体1391的不意图。
[0077]图 26A 显示引物 IF-HAB110.Sl+3c(SEQ ID NO:49)。图 26B 显示引物 IF-HABl 10.sl-4r (SEQ ID NO:50)。图26C显示合成的HA B威斯康辛(GenBank登录号JN993010)之核苷酸序列(SEQ ID NO:51)。图26D显示构建体193的示意图。图26E显示构建体193，由左至右t-DNA边界(加下划线)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默性抑制子表达盒的2X35S/CPMV-HT/N0S至BeYDV(m) +复制酶扩增系统(SEQ ID NO:52)。图26F显示表达盒编号1462由2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序列。将来自流感B/威斯康辛/1/2010的HA加下划线(SEQ ID N0:53)。图26G显示来自流感B/威斯康辛/1/2010的HA之氨基酸序列(SEQID NO:54)。图26H显示构建体1462的示意图。
[0078]图 27A显示引物HABl 10 (PrL-).r (SEQ ID NO:55)。图 27B显示引物HABllO (PrL-).c (SEQ ID NO:56)。图27C显示表达盒编号1467由2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序列。将具有缺失的蛋白水解环的来自流感B/威斯康辛/1/2010之HA加下划线(SEQ ID NO:57)。图27D显示具有缺失的蛋白水解环的流感B/威斯康辛/1/2010之氨基酸序列(SEQID NO:58)。图27E显示构建体1467的示意图。
[0079]图 28A 显示引物 IF-HB-M-04.s2+4c (SEQ ID NO:59)。图 28B 显示引物 IF-HB-M-04.sl-4r(SEQ ID NO:60)。图28C显示合成的HA B马来西亚的核苷酸序列(与来自GenBank登录号EU124275的nt31_1743相对应)，其具有被加下划线的T759C与C888G突变(SEQ IDNO:61)。图28D显示构建体194的示意图，示意图上注有用于质粒线性化的SacII与StuI限制性内切酶位点。图28E显示构建体194由左至右t-DNA边界(加下划线)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默性抑制子表达盒的2X35S/CPMV-HT/N0S至BeYDV (m) +复制酶扩增系统(SEQ ID NO:62)。图28F显示表达盒编号1631由2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序列。将来自流感B/马来西亚/2506/2004的roiSP-HA加下划线(SEQ ID NO:63)。图28G显示来自流感B/马来西亚/2506/2004的I3DISP-HA氨基酸序列(SEQ ID NO:64)。图28H显示构建体1631的示意图。
[0080]图29显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。将来自B/马来西亚/2506/2004的HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99的M2共表达。于每道加二十微克的蛋白质提取物。“C+”:阳性对照，来自英国国家生物标准品暨控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)的半纯化B/马来西亚/2506/2004病毒；“1631”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/马来西亚/2506/2004的野生型HA之表达；“ 1631+1261 ”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/马来西亚/2506/2004的野生型HA与M2之共表达。比例表示用于共表达实验之农杆菌(Agrobacterium)培养物的比。
[0081] 图30A显不在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。将来自B/威斯康辛/1/2010的HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99的M2共表达。于每道加十微克的蛋白质提取物。“C+”:阳性对照，来自英国国家生物标准品暨控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)的半纯化B/威斯康辛/1/2010病毒；“ 1462”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/威斯康辛/1/2010的野生型HA之表达；“1467”:在扩增元件(BeYDV)存在下，来自B/威斯康辛/1/2010的突变型HA之表达；“ 1462+1261”:在扩增元件(BeYDV)存在下，将来自B/威斯康辛/1/2010的野生型HA与M2共表达；“ 1467+1261”:在扩增元件(BeYDV)存在下，将来自B/威斯康辛/1/2010的突变型HA与M2共表达。比例表示用于表达与共表达实验之每一农杆菌(Agrobacterium)培养物的光密度。图30B显示提取自转化有AGL1/1462、AGL1/1467、AGL1/1462+AGL1/1261以及AGL1/1467+AGL1/1261的植物之粗蛋白的血细胞凝集能力的比较。
[0082]图31显示在以农杆菌浸润之本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的HA蛋白表达之蛋白质印迹分析。将来自H3/维多利-亚/361/2011的HA与来自A/新喀里多尼亚/20/99的M2共表达。于每道加二十微克的蛋白质提取物。“C+”:阳性对照，来自澳大利亚药物管理局之半纯化H3/威斯康辛/15/2009病毒；“1391”:来自H3/维多利亚/361/2011的野生型HA之表达；“1391+1261”:来自H3/维多利亚/361/2011的野生型HA与M2之共表达。比例表示用于表达与共表达实验之每一农杆菌(Agrobacterium)培养物的光密度。
【具体实施方式】
[0083]以下描述为优选的实施方案。
[0084]本发明涉及病毒样颗粒(VLP)以及在植物中生产和增加VLP产率与生产的方法。
[0085]本发明部分地提供在植物中或植物的部分中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。该方法涉及引入第一核酸和第二核酸至植物。第一核酸包含在植物或植物的部分中具有活性且有效连接到编码病毒结构蛋白之核苷酸序列的第一调节区。第二核酸包含在植物中具有活性且有效连接到编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之核苷酸序列的第二调节区。第一调节区和第二调节区可以是相同或不同的。将植物或植物的部分在容许核酸表达的条件下培养，从而生产VLP。如有需要，可将植物或植物的部分收获并且纯化VLP。优选地，VLP不包含Ml、病毒基质或核心蛋白。本发明亦提供以此方法生产的VLP。VLP可包含衍生自植物的一种或多于 一种的脂质。可将VLP用于制备用于诱导免疫应答的包含有效剂量之VLP以及药学上可接受之载体的组合物。
[0086]本发明亦提供包含通过表达以上所述第一和第二核酸而生产的VLP之植物物质。可将植物物质用以诱导对象中对流感病毒感染的免疫。该植物物质亦可被混合作为食物增补剂。
[0087]本发明之VLP亦可通过如下方式而生产:提供包含如上定义之第一核酸和第二核酸的植物以及植物的部分，并且将植物或植物的部分于容许所述第一和第二核酸表达的条件下培养，从而生产VLP。VLP可包含衍生自植物的一种或多于一种的脂质。可将VLP用以制备用于诱导免疫应答的包含有效剂量之VLP以及药学上可接受之载体的组合物。本发明亦提供包含通过表达第一和第二核酸而生产的VLP之植物物质。可将植物物质用以诱导对象对流感病毒感染之免疫。该植物物质亦可被混合作为食物增补剂。
[0088]本发明之VLP包含一种或更多种的病毒蛋白质。例如但不视为限制性的，所述一种或更多种病毒蛋白质可以是病毒结构蛋白(例如流感血细胞凝集素(HA))或通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白，像是例如M2)。所述HA可是任何HA，例如H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 或如 W02009/009876 ；W02009/076778 ；W02010/003225 ；W02010/003235 ；W02011/03522中所描述的乙型HA，将其通过参考并入本文)。
[0089]如以下更详细地描述，可通过将编码病毒蛋白质的第一核酸与编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)的第二核酸共表达而在植物中生产VLP。可将第一与第二核酸在相同步骤引入至植物，或它们可相继地引入至植物。第一与第二核酸可以瞬时的方式或以稳定的方式引入植物。此外，可用例如但不限于质子通道蛋白的通道蛋白质(第二核酸)转化表达编码病毒蛋白质之第一核酸的植物，以使第一和第二核酸两者在植物中共表达。作为替代地，可用编码病毒蛋白质的第一核酸转化表达通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)(第二核酸)的植物，以使第一和第二核酸两者在植物中共表达。此外，可将表达编码病毒蛋白质的第一核酸的第一植物与表现编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之第二核酸的第二植物杂交，以生产共表达分别编码病毒蛋白质与通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)的第一和第二核酸的子代植物。
[0090]本发明亦提供增加在植物中的病毒蛋白质表达和产率的方法，其通过共表达编码病毒蛋白质的第一核酸和编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)的第二核酸。可将第一与第二核酸在相同步骤引入植物中，或可将它们相继地引入植物中。第一与第二核酸可以瞬时的方式或以稳定的方式引入植物中。此外，可用例如但不限于质子通道蛋白的通道蛋白(第二核酸)转化表达编码病毒蛋白质的第一核酸的植物，以使第一和第二核酸两者在植物中共表达。作为替代地，可用编码病毒蛋白质的第一核酸转化表达通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)(第二核酸)的植物，以使第一和第二核酸两者在植物中共表达。此外，可将表达编码病毒蛋白质的第一核酸之第一植物与表达编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之第二核酸的第二植物杂交，以生产共表达分别编码病毒蛋白质与通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之第一与第二核酸的子代植物。
[0091]通道蛋白
[0092]“通道蛋白” 是指能够形成跨越磷脂膜之通道的蛋白质，其容许离子和/或小分子通过膜。通道蛋白对于离子和/或小分子的尺寸和/或电荷可具选择性。通道蛋白的非限制性实例为改变膜对低分子量化合物之通透性的非特异性通道蛋白，以及像是例如氯通道、钾通道、钠通道、钙通道以及质子通道的离子通道蛋白。
[0093]“质子通道蛋白”是指能够形成跨越磷脂双层之质子选择性通道的蛋白质。质子通道蛋白可以为具有疏水结构域在侧面之跨膜(TM)结构域的单通膜蛋白(single passmembrane protein)。质子通道的TM结构域可包含序列HXXXW(SEQ ID N0.1)。
[0094]在HAO的切割之后，HA于内体(endosome)的pH( < pH6.0)经历不可逆的构象改变变得对PH敏感，。前体HAO的构象于低pH时为稳定的，但经切割的HA1-HA2形式为亚稳定的(Bullough PA et.al., 1994, Nature.Vol371:37-43)。对于在不同 HA 中诱导构象改变之pH阈值的研究中，显示对于B株此阈值约为pH5.8-5.9，然而对于甲型HA为更酸(pH5.1M 5.3) (Beyer WEP et al，1986，Archives Virol，vol90:173)。在植物生物量提取期间(介于PH5-6)，HA1-HA2的构象改变亦可能伴随乙型HA发生。
[0095]不希望被理论所约束地，包含HA的细胞区室(包括高尔基体)之pH因而可能对HA的折叠、稳定性和/或蛋白水解是重要的。质子通道蛋白，像是例如流感M2以及BM2蛋白可调节细胞区室中的pH。例如，M2通过缓冲在流感病毒复制的晚期与早期两者细胞内区室以调节膜融合的电位。在新细胞的感染早期、于病毒颗粒的胞吞摄取之后，M2质子通道活性的活化导致脱壳过程期间病毒粒子内部的酸化。在感染晚期的病毒产生期间，M2在转运通过反式高尔基网(trans-Golgi network)期间作用以升高pH,并且避免低pH诱导之共同运输蛋白质(例如在流感情况中的HA)的去活化作用。通过共表达病毒结构蛋白和例如但不限于质子通道蛋白的通道蛋白，观察到病毒结构蛋白与VLP的增加产率。已知HA经历pH依赖性的构象改变。不希望被理论所约束地，HA生产细胞之高尔基体内的pH于成熟与迁移期间可能影响HA折叠、影响HA的稳定性与增加HA降解或其组合。通过共表达例如但不限于质子通道蛋白的通道蛋白和HA，可提高高尔基体内的pH，并且造成HA和/或VLP稳定性的增加，降解的减少或其组合，并且增加其表达水平与产率。
[0096]当与表达病毒结构蛋白而没有共表达通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之植物相比较时，观察到通过在植物中共表达病毒结构蛋白和通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)使得病毒结构蛋白和/或VLP的产率增加产率。
[0097]此外，当与未共表达通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)的HA蛋白相比较时，通过在植物中共表达病毒结构蛋白(例如HA)和通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)，HA蛋白可能表现如由更强的血细胞凝集作用能力所显示的增加的活性。关于活性的增加，指的是当与在通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)不存在下产生的相同HA蛋白之活性相比较，使用本领域标准技术所确定的血细胞凝集作用能力增加约2%至约100%，或任何介于其间之量，例如，由大约10%至大约50%或介于其间的任何值，例如大约2、5、
8、10、12、15、18、20、22、24、25、26、28、30、32、34、35、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、
55、56、58、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%。
[0098]如本文中所使用的，术语“M2”、“M2蛋白”、“M2序列”以及“M2结构域”意指由根据或存在于任何天然发生或人工产生的流感病毒株或分离株所分离之M2蛋白序列的全部或部分。因此，术语M2等等包括通过病毒生命周期期间的突变产生或对选择性压力(例如，药物治疗、宿主细胞向性或感染性的扩增等等)反应而产生的天然M2序列变体，以及重组地或合成地产生之M2序列。可使用的通道蛋白之实例包括但不限于列举于表1的那些质子通道蛋白。可与本发明使用的序列之非限制性的实例包括来自A/波多黎各/8/1934的M2以及来自A/新喀里多尼亚/20/1999的M2。示范性的M2蛋白由SEQ ID N0:11或14中显示之氨基酸序列所组成。
[0099]如本文中所使用的，术语“BM2”、“BM2蛋白”、“BM2序列”以及“BM2结构域”意指由
根据或存在于任何自然发生或人工产生的流感病毒株或分离株分离之BM2蛋白序列的所有或部分。因此，术语BM2等等包括在病毒生命周期期间由突变产生或对选择性压力(例如，药物治疗、宿主细胞向性或感染性的扩增等等)反应而产生的天然BM2序列变体，以及重组地或合成地产生之BM2序列。可被使用的通道蛋白之实例包括但不限于那些列举于表2之质子通道蛋白。
[0100]额外的示范性质子通道蛋白序列由表1与表2所显示之保藏于GenBank登录号下的序列组成。
[0101] 表1:M2质子通道蛋白氨基酸序列的登录号
【权利要求】
1.一种在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括 a)将第一核酸引入所述植物或所述植物的部分，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性且有效连接到编码病毒结构蛋白之核苷酸序列的第一调节区， b)将第二核酸引入，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性且有效连接到编码通道蛋白之核苷酸序列的第二调节区， c)将所述植物或所述植物的部分于容许所述核酸表达的条件下培养，从而生产VLP。
2.权利要求1的方法，其中所述通道蛋白为质子通道蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述质子通道蛋白选自M2或BM2。
4.权利要求2的方法，其中所述质子通道蛋白包含质子通道特征序列HXXXW。
5.权利要求1的方法，其中所述病毒结构蛋白包含三聚化结构域。
6.权利要求1的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列编码流感HA蛋白。
7.权利要求6的方法，其中所述流感HA蛋白的一个或更多个蛋白水解环已被缺失。
8.权利要求1的方法，其中所述核苷酸序列编码的病毒结构蛋白为选自下列的流感结构蛋白:B HA、C、H2、H3、H4、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16。
9.权利要求1的方法，其中所述核苷酸序列编码的病毒结构蛋白为流感BHA或流感H3。
10.权利要求9的方法，其中所述流感BHA来自流感B/布里斯班/60/2008、B/马来西亚/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010。
11.权利要求10的方法，其中所述流感BHA蛋白的一个或更多个蛋白水解环已被缺失。
12.权利要求9的方法，其中所述流感H3来自流感A/珀斯/16/2009或来自流感A/维多利亚/361/2011。
13.权利要求1的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列与选自SEQID NO:28、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:61的序列具有至少70%序列同一性。
14.权利要求1的方法，其中所述病毒结构蛋白之序列为如SEQID NO: 30, SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:64中至少之一所示的。
15.权利要求1的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列与选自SEQID NO:43和SEQ ID NO:57下划线部分的序列具有至少70%序列同一性。
16.权利要求1的方法，其中所述病毒结构蛋白之序列为如SEQID N0:41和SEQ IDNO:58中至少之一所示的。
17.权利要求1的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列与选自SEQIDNO:23和SEQ ID NO:46的序列具有至少70%序列同一1丨生。
18.权利要求1的方法，其中所述病毒结构蛋白之序列为如SEQIDNO:25和SEQ ID NO:48中至少之一所示的。
19.权利要求1的方法，其中所述第一核酸序列包含有效连接一个或多于一个豇豆花叶病毒属增强子的第一调节区、编码病毒结构蛋白质的核苷酸序列以及一个或多于一个双生病毒扩增元件，并且将编码双生病毒复制酶的第三核酸引入所述植物或所述植物的部分。
20.权利要求19的方法，其中所述一个或多于一个豇豆花叶病毒属增强子为豇豆花叶病毒属UTR。
21.权利要求20的方法，其中所述豇豆花叶病毒属UTR为豇豆花叶病毒(CPMV)UTR。
22.权利要求19的方法，其中所述一个或多于一个双生病毒扩增元件选自豆黄矮病毒长基因间区域(BeYDV LIR)和BeYDV短基因间区域(BeYDV SIR)。
23.权利要求19的方法，其中所述核苷酸序列编码的病毒结构蛋白为流感BHA或流感H3。
24.权利要求23的方法， 其中所述流感BHA来自流感B/布里斯班/60/2008、B/马来西亚/2506/2004或B/威斯康辛/1/2010。
25.权利要求24的方法，其中所述流感BHA蛋白中的一个或更多个蛋白水解环已被缺失。
26.权利要求23的方法，其中所述流感H3来自流感A/珀斯/16/2009或来自A/维多利亚 /361/2011。
27.权利要求19的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列与选自SEQID NO:28、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:61的序列具有至少70%序列同一性。
28.权利要求19的方法，其中所述病毒结构蛋白的序列为如SEQID NO: 30、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:64中至少之一所示的。
29.权利要求19的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列与选自SEQID NO:43和SEQ ID NO:57下划线部分的序列具有至少70%序列同一性。
30.权利要求19的方法，其中所述病毒结构蛋白的序列为如SEQID NO:41和SEQ IDNO:58中至少之一所示的。
31.权利要求19的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列与选自SEQID NO:23和SEQ ID NO:46的序列具有至少70%序列同一性。
32.权利要求19的方法，其中所述病毒结构蛋白的序列为如SEQID NO:25和SEQ IDNO:48中至少之一所示的。
33.权利要求1的方法，其中所述编码病毒结构蛋白的核苷酸序列包含依序编码病毒结构蛋白或其片段、流感跨膜结构域以及胞质尾的嵌合核苷酸序列。
34.权利要求1的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，所述核酸于植物中瞬时表达。
35.权利要求1的方法，其中在所述引入步骤(步骤a)中，所述核酸于植物中稳定表达。
36.权利要求1的方法，还包括下述步骤 d)收获所述植物以及纯化所述VLP。
37.权利要求1的方法，其中所述VLP不包含病毒基质或核心蛋白。
38.一种生产病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括 a)提供植物或植物的部分，其包含第一核酸和第二核酸，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性且有效连接到编码病毒结构蛋白之核苷酸序列的第一调节区，至所述植物或所述植物的部分，以及所述第二核酸包含在所述植物中具有活性且有效连接到编码通道蛋白之核苷酸序列的第二调节区， b)将所述植物或所述植物的部分于容许所述核酸表达的条件下培养，从而生产VLP。
39.权利要求38的方法，其中所述通道蛋白为质子通道蛋白。
40.权利要求39的方法，其中所述质子通道蛋白选自M2或BM2。
41.通过权利要求1的方法生产的VLP。
42.通过权利要求38的方法生产的VLP。
43.权利要求41或42的VLP，其还包含衍生自植物的一种或多于一种脂质。
44.权利要求41或42的VLP，其中所述一种或更多种病毒蛋白质包含植物特异性N-聚糖或经修饰的N-聚糖。
45.一种组合物，其包含用于诱导免疫应答的有效剂量的权利要求41或42所述的VLP以及药学上可接受之载体。
46.一种在对象中诱导对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用权利要求41或42的VLP。
47.权利要求46的方法，其中所述VLP以经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用于对象。
48.使用权利要求41或42所述VLP制备的多克隆抗体。
49.植物物质，其包含通过权利要求1或38的方法生产的VLP。
50.权利要求49的植物物质，其用于在对象中诱导对流感病毒感染的免疫。
51.一种食物增补剂，其包含权利要求50的植物物质。
52.权利要求1的方法，其还包括引入第三核酸序列，所述第三核酸序列编码沉默性阻遏蛋白。
53.权利要求19的方法，其还包括引入第四核酸序列，所述第四核酸序列编码沉默性阻遏蛋白。
54.权利要求52或53的方法，其中所述沉默性阻遏蛋白选自HcPro和pl9。
55.权利要求1或38的方法，其中所述VLP不包含通道蛋白。
56.权利要求1或38的方法，其中所述病毒结构蛋白为HAO蛋白。
57.权利要求3的方法，其中所述M2蛋白选自包含流感A/波多黎各/8/1934和流感A/新喀里多尼亚/20/1999的组。
58.一种多肽，其包含选自SEQ ID N0:41和SEQ ID NO:58序列的氨基酸序列。
59.一种核酸序列，其编码权利要求58的多肽。
60.权利要求59的核酸序列，其中所述核酸序列包含选自SEQID N0:43和SEQ ID NO:57下划线部分之序列的核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/44GK103930435SQ201280047819
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】马克-安德烈·德奥斯特, 马农·科图雷, 路易斯-菲利普·韦齐纳 申请人:麦迪卡格公司