利用乙酰乙酰辅酶a合酶产生异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的制作方法

利用乙酰乙酰辅酶a合酶产生异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的制作方法
【专利摘要】本发明涉及能够产生异戊二烯的重组微生物以及利用这种重组微生物以较高效率产生异戊二烯。在本发明中，将编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶的乙酰乙酰辅酶A合酶基因和一种或多种涉及使得能由乙酰乙酰辅酶A合成异戊二烯的异戊二烯生物合成的基因引入宿主微生物中。
【专利说明】利用乙酰乙酰辅酶A合酶产生异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯
[0001]相关专利申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年8月4日提交的美国临时申请N0.61/515，300的权益，将该临时申请的公开内容以引用的方式全文并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明总体涉及用于由培养的细胞和包含这些培养细胞的组合物产生异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的方法。
[0004]发明背景
[0005]甲羟戊酸依赖性途径的产物是异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是异戊二烯以及类异戊二烯的前体。
[0006]异戊二烯(2-甲基-1，3- 丁二烯)是多种合成聚合物(最值得注意的是合成橡胶)的关键原料。异戊二烯由多种微生物、植物和动物物种自然产生。具体地讲，已鉴定了两条进行异戊二烯生物合成的途径:甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径。然而，天然存在的生物体的异戊二烯产率没有商业吸引力。也可以通过分馏石油获得异戊二烯，但该材料的纯化昂贵而且耗时。C5烃流的石油裂解仅生成约15%的异戊二烯。每年大约有800, 000吨顺式聚异戊二烯由异戊二烯的聚合反应产生；这种聚异戊二烯大部分用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯还通过共聚反应用作其他产品中的合成弹性体，这些产品例如为鞋类、机械产品、医疗产品 、体育用品和胶乳。
[0007]类异戊二烯是衍生自类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP的化合物。已鉴定了超过29，000种类异戊二烯化合物并且每年都发现新的类异戊二烯。类异戊二烯可分离自天然产物，例如将类异戊二烯前体分子用作基础构造块以形成类异戊二烯的相对复杂结构的微生物和植物物种。类异戊二烯对大多数活生物体和细胞是至关重要的，为维持细胞膜流动性和电子传递提供了手段。在自然界，类异戊二烯发挥的作用多种多样，从作为植物中的天然杀虫剂到促成与肉桂、丁香和生姜相关的香味。此外，制药和化学界将类异戊二烯用作药品、保健营养品、调味剂和农业害虫防治剂。鉴于它们在生物系统中的重要性以及在广泛应用中的有用性，类异戊二烯已成为倍受科学家重视的焦点。
[0008]因此，需要更多经济的方法来生产异戊二烯和/或类异戊二烯。具体地讲，所希望的是以足以满足稳健商业化工艺要求的速率、滴度和纯度来由廉价的可再生原料生产异戊二烯和/或类异戊二烯的方法。
[0009]本文通过对重组微生物及其在生产异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯方法中的用途的公开来提供这些改进。
[0010]在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物(如杂志文章)。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所有目的。
【发明内容】

[0011 ] 本发明特别是提供重组微生物的组合物、制备这些重组微生物的方法以及使用这些重组微生物生产异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的方法。所述重组微生物包含能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶，该乙酰乙酰辅酶A然后可用于制备异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。这些重组微生物包含能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A以产生乙酰乙酰辅酶A的酶，而不是能够由两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的乙酰乙酰辅酶A硫解酶。
[0012]因此，在一个方面，本发明提供能够产生异戊二烯的重组微生物，该重组微生物包含一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸以及一种或多种编码如下多肽的核酸:(a)异戊二烯合酶多肽，其中该异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和(b) 一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽，其中在合适的培养基中培养所述重组微生物可提供所述多肽的产生以及异戊二烯的合成。在一个方面，该一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸为乙酰乙酰辅酶A合酶基因。在另一个方面，该乙酰乙酰辅酶A合酶基因为来自放线菌的基因。在另一个方面,该乙酰乙酰辅酶A合酶基因来自链霉菌属(Streptomyces)。在另一个方面,该乙酰乙酰辅酶A合酶基因编码具有如下氨基酸序列的蛋白质:
[0013]MTDVRFRIIGTGAYVPER IVSNDEVGAPAGVDDDWITRKTGIRQRRWAADDQATSDLATAAGRAALKAAGITPEQLTVIAVATSTPDRPQPPTAAYVQHHLGATGTAAFDVNAVCSGTVFALSSVAGTLVYRGGYALVIGADLYSRILNPADRKTVVLFGDGAGAMVLGPTSTGTGPIVRRVALHTFGGLTDLIRVPAGGSRQPLDTDGLDAGLQYFAMDGREVRRFVTEHLPQLIKGFLHEAGVDAADISHFVPHQANGVMLDEVFGELHLPRATMHRTVETYGNTGAASIPITMDAAVRAGSFRPGELVLLAGFGGGMAASFALIEff(SEQ ID NO:1)?
[0014]在另一个方面，乙酰乙酰辅酶A合酶基因编码这样的蛋白质，该蛋白质具有的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80%或更高同一性且具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能。
[0015]在本文的任何方面，该异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽。在本文的任何方面，该异戍二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula)的多肽。在本文的任何方面,异戍二烯合酶多妝选自山葛(Pueraria montana)或野葛(Pueraria 1bata)、美洲山杨(Populustremuloides)、银白杨、黑杨(Populus nigra)和毛果杨(Populus trichocarpa) ? 在另一方面，植物异戊二烯合酶多肽为葛(kudzu)异戊二烯合酶多肽。
[0016]在本文的任何方面，编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在本文的任何方面，编码多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为内源核酸拷贝。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽选自(a)使乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成HMG辅酶A的酶(如HMG合酶)；(b)将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。
[0017]在本文的任何方面，将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶可选自马氏甲烧八叠球菌(M.mazei)甲轻戍酸激酶、乳杆菌(Lactobacillus)甲轻戍酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)甲轻戍酸激酶多肽、酵母甲轻戍酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甲轻戍酸激酶多妝、链球菌(Streptococcus)甲轻戍酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲轻戍酸激酶多肽以及链霉菌(Streptomyces)甲轻戍酸激酶多肽或链霉菌CL190 (Streptomyces CL190)甲轻戍酸激酶多肽。在本文的任何方面，使甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。
[0018]在本文的任何方面，该重组微生物可还包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。在一个方面，编码一种或多种DXP途径多肽的一个或多个核酸为异源核酸。在另一方面，编码一种或多种DXP途径多肽的一种或多种核酸为内源核酸拷贝。在另一方面，一种或多种DXP途径多肽选自(a) 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b) 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、(c) 4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶(MCT)、(d) 4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)、(e)2C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(MCS)、(f) 1-羟基-2-甲基-2-(E)- 丁烯基-4- 二磷酸合酶(HDS)和(g) 1-羟基-2-甲基-2- (E) - 丁烯基-4- 二磷酸还原酶(HDR)。在另一方面，DXP途径多肽为DXS。
[0019]在本文的任何方面，将该一种或多种异源核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在本文的任何方面，将该一种或多种异源核酸克隆进一种或多种多拷贝质粒中。在本文的任何方面，将该一种或多种异源核酸整合进细胞的染色体中。
[0020]在本文的任何方面，微生物为细菌、藻类、真菌、酵母或蓝细菌细胞。在一个方面，微生物为细菌细胞。在另一方面，细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在另一方面，细菌细胞选自埃希氏杆菌属(Escherichia)物种(例如大肠杆菌)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、朽1檬泛菌(P.citrea)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.1entus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophiIus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.1autus)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、棒杆菌属物种(Corynebacterium spp.)(例如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum))、多糖降解菌 2-40 (S.degradans2_40)、Alginovibr1 aqualiticus、交替单胞菌属(Alteromonas)标准参考菌株 KLIA、Asteromyces cruciatus、海贝内克菌(Beneckea pelagia)、棒杆菌属物种、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、海洋盐单胞菌(Halmonas marina)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、发光杆菌属(Photobacterium)物种(ATCC433367)、叶氏假交替单胞菌(Pseudoalteromonas elyakovii)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(例如，Pseudomonas alginovora、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)、鲍鱼肠弧菌(Vibr1 hal1ticol)、哈维氏弧菌(Vibr1 harveyi)、白色链霉菌(S.albus)、变铅青链霉菌(S.1ividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、灰色链霉菌(S.griseus)以及产碱假单胞菌(P.alcaligenes)细胞。在另一个方面，细菌细胞为大肠杆菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。在一个方面，微生物为藻类细胞 。在另一个方面，藻类细胞选自绿藻、红藻、灰胞藻门、绿蜘藻、眼虫、色藻界或腰鞭毛虫。在一个方面，微生物为真菌细胞。在另一方面，真菌细胞为丝状真菌。在另一个方面，微生物为酵母细胞。在另一个方面，酵母细胞选自酵母菌属(Saccharomyces)物种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种、毕赤酵母属(Pichia)物种或假丝酵母属(Candida)物种。在另一方面，酵母细胞为酿酒酵母细胞。
[0021]在另一方面，本发明提供能够产生类异戊二烯的重组微生物，该重组微生物包含一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸以及一种或多种编码如下多肽的核酸:(a)编码聚异戊二烯焦磷酸合酶的一种或多种核酸；和(b)编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的一种或多种核酸，其中在合适的培养基中培养所述重组微生物可提供所述多肽的产生以及一种或多种类异戊二烯的合成。在一个方面，(b)的编码一种或多种MVA途径多肽的一种或多种核酸为异源核酸。在本文的任何方面，一种或多种MVA途径多肽选自(a)将乙酰乙酰辅酶-辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成HMG-Co-A的酶；(b)将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。
[0022]在本文的任何方面，将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶选自马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽和链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。在一个方面，将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。
[0023]在本文的任何方面，将该一种或多种异源核酸置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在本文的任何方面，将该一种或多种异源核酸克隆进一种或多种多拷贝质粒中。在本文的任何方面，将该 一种或多种异源核酸整合进细胞的染色体中。
[0024]在一个方面，微生物为细菌、藻类、真菌、酵母或蓝细菌细胞。在一个方面，微生物为细菌细胞。在另一方面，细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在另一方面,细菌细胞选自埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、嗜酸乳杆菌、朽1檬泛菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、棒杆菌属物种(例如谷氨酸棒杆菌)、多糖降解菌2-40、Alginovibr1 aqualiticus、交替单胞菌属标准参考菌株 KLIA、Asteromyces cruciatus、海贝内克菌、棒杆菌属物种、阴沟肠杆菌、海洋盐单胞菌、肺炎克雷伯菌、发光杆菌属物种(ATCC433367)、叶氏假交替单胞菌、假单胞菌属物种(例如，Pseudomonas alginovora、铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、恶臭假单胞菌)、溶藻弧菌、鲍鱼肠弧菌、哈维氏弧菌、白色链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及产碱假单胞菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为大肠杆菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。在一个方面，微生物为藻类细胞。在另一个方面，藻类细胞选自绿藻、红藻、灰胞藻门、绿蜘藻、眼虫、色藻界或腰鞭毛虫。在一个方面，微生物为真菌细胞。在另一方面，真菌细胞为丝状真菌。在另一个方面，微生物为酵母细胞。在另一个方面，酵母细胞选自酵母菌属、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属物种或假丝酵母属物种。在另一方面，酵母细胞为酿酒酵母细胞。
[0025]在本文的任何方面，类异戊二烯选自单萜类化合物、二萜类化合物、三萜类化合物、四萜类化合物、倍半萜类化合物和多萜类化合物。在一个方面，类异戊二烯为倍半萜类化合物。在另一方面，类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、金合欢烯、α-金合欢烯、β -金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β_菔烯、桧烯、Y-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
[0026]在另一方面，本发明提供产生异戊二烯的方法，所述方法包括:(a)培养重组微生物，该重组微生物包含(i) 一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸，和一种或多种编码如下多肽的核酸:(ii)异戊二烯合酶多肽，其中该异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和(iii) 一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽，以及(b)产生异戊二烯。在一个方面，所述方法还包括回收该重组微生物所产生的异戊二烯。
[0027]在另一个方面，该一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸为乙酰乙酰辅酶A合酶基因。在另一方面，该异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽。在另一方面，该一种或多种MVA途径多肽选自(a)将乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成HMG-Co-A的酶；(b)将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；以及(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。在另一方面，重组微生物还包含编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的一种或多种核酸。
[0028]在另一个方面，微生物为细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在另一个方面，微生物为细菌细胞。在另一方面，细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为大肠杆菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。在另一个方面，微生物为酵母细胞。在另一方面，酵母细胞为酿酒酵母细胞。
[0029]在另一方面，本 文提供一种产生类异戊二烯的方法，该方法包括:培养重组微生物，该重组微生物包含(i) 一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸，和一种或多种编码如下多肽的核酸:(ii)聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽，其中该聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽由异源核酸编码；和(iii) 一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽，以及产生所述类异戊二烯。
【专利附图】

【附图说明】
[0030]图1 为 Strep CL190Upper 的质粒图谱。
[0031]图2为pMCM1187的质粒图谱。
[0032]图3 为分离自菌株 MCM1320 和 MCM1321 的 pCL-Ptrc-mvaR-mvaS_nphT7 的质粒图
-1'TfeP曰。
[0033]图4为经工程改造以编码乙酰乙酰辅酶A(NphT7)的菌株所产生的异戊二烯的水平的图。使用气相色谱-火焰电离检测器检测异戊二烯水平。与经由DXP途径产生异戊二烯的MCM1686菌株相比，经由乙酰乙酰辅酶A产生MVA的菌株MCM1684和MCM1685产生了显著更高水平的异戊二烯。
[0034]图5为构建体pMCM1221的载体图谱。
[0035]图6为构建体nphT7with S suis HMGRS/pCL的载体图谱。在该图中突出显示了编码MVA上游途径酶的基因以及控制3基因操纵子的表达的IPTG诱导型Trc启动子。HMG辅酶A还原酶(HMGR)和HMG辅酶A合酶(HMGS)由源自猪链球菌(Streptococcus suis)的基因编码，并且NphT7乙酰乙酰辅酶A合酶由源自链霉菌属菌株CL190的nphT7基因编码。为PCL1920载体骨架所共有的壮观霉素抗性基因(aadAl)和编码质粒复制所需要的R印A蛋白的基因(repA)包括在构建体中，但在图中未示出。
[0036]图7为绘出了所测试的每种培养物的，由黑色条棒和灰色条棒表示的异戊二烯比生产率(单位:ug/L0Dhr.)以及表示为黑色菱形的光学密度(0D600nm)的图。携带由猪链球菌HMGR和HMGS连同NphT7乙酰乙酰辅酶A合酶组成的MVA上游途径酶的菌株的异戊二烯数据由黑色条棒描绘(在图中标记为NphT7a-c，分别表示REM C8_25、REM C9_25和REMDl_25);携带由源自链霉菌属菌株CL190的nphT5、nphT6和nphT7基因所编码的MVA上游途径酶的菌株的异戊二烯数据由灰色条棒描绘(标记为MCM1684和MCM1685);缺少外源MVA上游途径酶的对照菌株的异戊二烯数据也以灰色显示(标记为IspS alone)。异戊二烯比生产率表示在左边I轴上。OD测量值在相关基因表达的IPTG诱导后3.5小时取得并且表示在右边y轴上。
[0037]图8为显示来自偶联的NphT7、HMG辅酶A合酶和HMG辅酶A还原酶的催化活性测定法的NADP+/时间/OD的图。菌株nphT7测试菌株1_3分别对应于REM C8_25、REM C9_25和 REM Dl_25。Control-Parental-1spS alone 菌株为 REM F3_25。这些结果与 NphT7 活性对乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的存在的依赖一致。
[0038]图9为显示 来自使用菌株nphT7测试菌株1_3的催化测定法的异戊二烯/时间/OD的图，所述测试菌株1-3分别对应于REM C8_25、REM C9_25和REM Dl_25。Contro1-Parental-1spS alone 菌株为 REM F3_25。
【具体实施方式】
[0039]本发明尤其提供了用于增加重组微生物中异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量的组合物和方法，所述重组微生物已经经工程改造来表达能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶，作为将碳通量导向异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯生产的第一步骤。
[0040]诵用抟术
[0041]除非另外指明，否则对本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，这些技术均为本领域的现有技术。这些技术在以下文献中有完整解释:“Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:实验室手册》)”，第三版(Sambrook等人，2001) ,Oligonucleotide Synthesis (《寡核苷酸合成》)，，(M.J.Gait 编辑，1984) ;“Animal Cell Culture:A practical approach (《动物细胞培养:实用方法》)”，第三版(J.R.Masters编辑,2000) ,Methods in Enzymology (《酶学方法》)，，(美国学术出版社(Academic Press, Inc.) ) ；uCurrent Protocols in MolecularB1logy (《分子生物学实验室指南》)”(F.M.Ausubel等人编辑，1987，以及定期更新版本)；iiPCR:The Polymerase Chain React1n(((PCR:聚合酶链反应》)”，(Mullis 等人编辑，1994)。Singleton 等人，Dict1nary of Microb1logy and Molecular B1logy3rd revised ed.,(《微生物学和分子生物学词典第三修订版》)，约翰威立父子出版公司(J.Wiley&Sons)(纽约州纽约市，2006 年)以及 March，s Advanced Organic Chemistry React1ns, Mechanismsand Structure6th ed.(《马奇高级有机化学反应、机理和结构,第六版》),约翰威立父子出版公司(纽约州纽约市，2007年)，为本领域技术人员提供了关于本申请中所用的许多术语的一般性指导。
[0042]定义
[0043]术语“异戍二稀”是指2-甲基-1，3~ 丁二稀(CAS#78-79-5)。其可以是由3，3- _.甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)消除焦磷酸所得的直接和最终的挥发性C5烃产物。其可能不涉及IPP分子与DMAPP分子的连接或聚合。除非本文中另外指明，否则术语“异戊二烯”通常不旨在受其产生方法的限制。
[0044]如本文所用，术语“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。
[0045]如本文所用，“分离的多肽”不是多肽文库(如2种、5种、10种、20种、50种或更多种不同多肽的文库)的一部分，并且与和其一起存在于自然界中的至少一种组分分离。分离的多肽可例如通过编码该多肽的重组核酸的表达来获得。
[0046]所谓“异源多肽”意指由衍生自其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞的核酸序列编码的多肽。在一些实施例中，异源多肽不同于存在于自然界中相同宿主细胞内的野生型多肽。
[0047]如本文所使用，“核酸”是指单股或双股形式的共价连接在一起的两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0048]所谓“重组核酸 ”意指这样的所关注核酸，其缺少在该所关注核酸旁侧的、所关注核酸所源自的有机体的天然存在的基因组中的一种或多种核酸(例如基因)。因此，该术语包括(例如)掺入载体中、掺入自主复制型质粒或病毒中或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA中，或者独立于其他序列作为单独的分子(例如，cDNA、基因组DNA片段或通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA片段)存在的重组DNA。
[0049]所谓“异源核酸”意指衍生自其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞的核酸序列。在一些实施例中，异源核酸不同于存在于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型核酸。
[0050]如本文所用，“表达控制序列”意指引导所关注核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以为启动子(例如组成型或诱导型启动子)或增强子。表达控制序列可以是“天然的”或异源的。天然的表达控制序列衍生自与所表达基因相同的生物体、物种或株系。异源表达控制序列衍生自与所表达基因不同的生物体、物种或株系。“诱导型启动子”是在环境或发育调节下具有活性的启动子。
[0051]所谓“有效连接的”意指核酸表达控制序列(例如启动子)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中该表达控制序列引导对应于该第二序列的核酸的转录。
[0052]如本文所用，术语“基础培养基”是指含有细胞有可能生长所需的最少营养物，通常不存在氨基酸的培养基。基本培养基通常含有:(I)用于细胞生长的碳源；(2)各种盐，其可因宿主物种和生长条件而变动；和(3)水。从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的较复杂水解产物如酵母提取物，碳源可以有很大变化，如下文更详细论述的。盐通常提供必需元素如镁、氮、磷和硫以允许细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充有选择剂，例如抗生素，以针对某些质粒的维持等进行选择。例如，如果微生物对某一抗生素例如氨苄青霉素或四环素具有抗性，则可将该抗生素添加至培养基以便防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可在必要时补充有其他化合物以选择所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。[0053]如本文所用，术语“类异戊二烯”是指数量大且多样的一类天然存在的一类有机化合物，其由两个或更多个烃单元构成，每个单元由以特定模式排列的五个碳原子组成。如本文所用，明确地将“异戊二烯”从“类异戊二烯”的定义中排除。
[0054]如本文所用，术语“萜类化合物”是指数量大且多样的一类有机分子，该分子衍生自以多种方式组装和修饰并且根据组成员中所用的类异戊二烯单元的数目分组的五碳类异戊二烯单元。半萜类化合物具有一个类异戊二烯单元。单萜类化合物具有两个类异戊二烯单元。倍半萜类化合物具有三个类异戊二烯单元。二萜类化合物具有四个异戊二烯单元。二倍半萜类具有五个异戊二烯单元。三萜类化合物具有六个类异戊二烯单元。四萜类化合物具有八个类异戊二烯单元。多萜类化合物具有超过八个类异戊二烯单元。
[0055]如本文所用，“类异戊二烯前体”是指生物体用于萜类化合物或类异戊二烯的生物合成的任何分子。类异戊二烯前体分子的非限制性例子包括例如异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
[0056]如本文所用，术语“质量产率”是指宿主细胞所产生的产物的质量除以宿主细胞所消耗的葡萄糖的质量乘以100。
[0057]所谓“比生产率”，其意指宿主细胞所产生的产物的质量除以产生产物的时间、宿主细胞密度和培养物体积。
[0058]所谓“滴度”，其意指宿主细胞所产生的产物的质量除以培养物的体积。
[0059]如本文所用，术语“细胞生产力指数(CPI) ”是指宿主细胞所产生的产物的质量除以培养物中产生的宿主细胞的质量。
[0060]除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所一般理解的含义相同的含义。
[0061]如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。
[0062]在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，就如同此类较低数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
[0063]能够产生异戊二烯、类异戊二烯前体或类异戊二烯的重组微生物
[0064]甲羟戊酸依赖性生物合成途径(MVA途径)是所有高等真核生物和某些细菌中存在的关键代谢途径。除了对蛋白质异戊二烯化、细胞膜维持、蛋白质锚定和N-糖基化等各种各样的过程中所用的分子的产生是重要的外，甲羟戊酸途径还提供类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的主要来源，这些分子充当萜烯、萜类化合物、类异戊二烯和异戊二烯的生物合成的基础。
[0065]如本文所用，MVA途径的上游部分利用细胞代谢期间产生的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A作为 初始底物，用于通过具有乙酰乙酰辅酶A合酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶酶活性的多肽的作用产生甲羟戊酸。首先，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A通过乙酰乙酰辅酶A合酶的作用转化为乙酰乙酰辅酶A。接着，乙酰乙酰辅酶A通过HMG辅酶A合酶的酶促作用转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (HMG辅酶A)。该辅酶A衍生物通过HMG辅酶A还原酶还原成甲羟戊酸，这是产生类异戊二烯的甲羟戊酸途径的限速步骤。甲羟戊酸然后经由甲羟戊酸激酶的作用转化为甲羟戊酸-5-磷酸，其随后通过磷酸甲羟戊酸激酶的酶活性转化为甲羟戊酸-5-焦磷酸。最后，通过酶甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧酶的活性由甲羟戊酸-5-焦磷酸形成IPP。
[0066]因此，本发明的重组微生物是具有产生异戊二烯、类异戊二烯前体或类异戊二烯能力的重组微生物，其中所述重组微生物包含编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的酶的基因(例如，乙酰乙酰辅酶A合酶基因或nphT7)以及涉及使得能在宿主微生物中由乙酰乙酰辅酶A合成异戊二烯或类异戊二烯的异戊二烯生物合成或类异戊二烯生物合成的一组基因中的一者或多者。
[0067]乙酰乙酰辅酶A合酶基因
[0068]乙酰乙酰辅酶A合酶基因(亦称nphT7)为编码具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的活性以及具有极低的从两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的活性(如无该活性)的酶的基因。参见例如Okamura等人，PNAS (《美国科学院院刊》)第107卷，第25期，第11265-11270页(2010)，将其关于nphT7的教导内容明确地并入本文。来自链霉菌属CL190菌株的放线菌的乙酰乙酰辅酶A合酶基因在日本专利公布(特开平)N0.2008-61506A和US2010/0285549中有所描述。乙酰乙酰辅酶A合酶还可被称为乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶。可以使用的代表性的乙酰乙酰辅酶A合酶(或乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶)为Genbank AB540131.1。
[0069]在一个实施例中，本发明的乙酰乙酰辅酶A合酶经由不可逆反应从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。利用乙酰乙酰辅酶A合酶来生成乙酰辅酶A具有额外的优点，因为该反应是不可逆的而乙酰乙酰辅酶A硫解酶从两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的作用是可逆 的。因此，利用乙酰乙酰辅酶A合酶来从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A与利用硫解酶来生成相同终产物相比，可导致异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的生产率有显著改善。
[0070]此外，利用乙酰乙酰辅酶A合酶来产生异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯提供了另一优点，因为乙酰乙酰辅酶A合酶可经由丙二酰辅酶A的脱羧反应将丙二酰辅酶A转化为乙酰辅酶A。因而，起始底物的储存不受乙酰辅酶A的起始量限制。当起始底物仅为丙二酰辅酶A时，仍可发生由乙酰乙酰辅酶A合酶合成乙酰乙酰辅酶A。在一个实施例中，通过使用具有更多丙二酰辅酶A的宿主菌株来增加起始丙二酰辅酶A的库存量。这种增加的库存量可天然存在或通过分子操纵进行工程改造。参见例如，Fowler等人,Applied andEnvironmental Microb1logy (《应用和环境微生物学》)，第75卷，第18期，第5831-5839页(2009), Zha 等人，Metabolic Engineering (《代谢工程》)，11:192-198 (2009), Xu 等人，Metabolic Engineering (《代谢工程》)，(2011) do1: 10.1016/j.ymben.2011.06.008,Okamura 等人，PNAS (《美国科学院院刊》)107:11265-11270 (2010)，以及 US2010/0285549,将这些参考文献的内容明确地以引用的方式全文并入本文。
[0071 ] 在本文所述任何方面或实施例中，可以使用具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的能力的酶。本文描述了这种酶的非限制性例子。在本文所述的某些实施例中，可以使用来源于链霉菌属的放线菌、具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的活性的乙酰乙酰辅酶A合酶基因。[0072]这种乙酰乙酰辅酶A合酶基因的一个例子是编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的基因。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的这种蛋白质对应于具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的活性以及不具有从两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的活性的乙酰乙酰辅酶A合酶。
[0073]在一个实施例中，编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的基因可通过核酸扩增方法(如PCR)将从链霉属物种CL190菌株的放线菌获得的基因组DNA用作模板和使用可参照日本专利公开(特开平)N0.2008-61506A设计的一对引物而获得。
[0074]如本文所述，用于本发明的乙酰乙酰辅酶A合酶基因不限于来自链霉属物种CL190菌株的放线菌的编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质的基因。编码具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的能力并且不从两个乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的蛋白质的任何基因可用于本发明所述的方法。在某些实施例中，乙酰乙酰辅酶A合酶基因可以是编码这样的蛋白质的基因，该蛋白质具有的氨基酸序列与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有高相似性或与之实质上相同，并且具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能。表述“高相似性”或“实质上相同”是指例如，至少约80%同一性、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%和至少约99%同一性。如上文所用，同一性值对应于一不同氨基酸序列和SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的氨基酸残基之间的同一性百分比，其通过使用用于搜索序列相似性的程序进行SEQ ID NO:1的氨基酸序列与该不同氨基酸序列的比对来计算。
[0075]在其他实施例中，乙酰乙酰辅酶A合酶基因可以是编码这样的蛋白质的基因，该蛋白质具有通过置换、缺失、添加或插入I个或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列并 且具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能。在本文中，表述“多个氨基酸”是指例如，2至30个氨基酸，优选2至20个氨基酸，更优选2至10个氨基酸，并且最优选2至5个氨基酸。
[0076]在其他实施例中，乙酰乙酰辅酶A合酶基因可由能够在严格条件下与具有与编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸的一部分或全部杂交并且能够编码具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能的蛋白质的多核苷酸组成。在本文中，在严格条件下杂交对应于在60摄氏度、2 X SSC下洗涤的条件下保持结合。杂交可通过常规上已知的方法例如在如下文献中描述的方法进行J.Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (《分子克隆,实验室手册》),第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory) (2001)。
[0077]如本文所述，编码具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的乙酰乙酰辅酶A合酶的基因可分离自可能任何生物体，例如不获自链霉物种CL190菌株的放线菌。另外，用于本文的乙酰乙酰辅酶A合酶基因可通过以本领域已知的方法修饰编码SEQ IDNO:1的氨基酸序列的多核苷酸来获得。可通过已知的方法如Kunkel方法或缺口双链体方法(gapped duplex method)或者通过类似于它们任一者的方法进行对核苷酸序列的诱变。例如，可使用诱变试剂盒(如产品名=Mutant-K和Mutant-G (宝生物工程株式会社(TAKARAB1)),用于定点诱变；产品名:LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(宝生物工程株式会社)等等)来进行诱变。[0078]可如下所述评价具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列的乙酰乙酰辅酶A合酶的活性。具体而言，首先将编码待评价的蛋白质的基因引入宿主细胞使得该基因可在其中表达，然后通过诸如色谱之类的技术纯化该蛋白质。将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A作为底物添加至含有所获得的待评价蛋白质的缓冲液，然后例如在所需的温度(如10°C至60°C)下温育。在反应完成后，测定底物损失和/或所产生的产物(乙酰乙酰辅酶A)的量。因而，评价所测蛋白质是否具有从丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能以及评价合成的程度是可能的。在这种情形中，通过将单独的乙酰辅酶A作为底物添加至含有所获得的待评价蛋白质的缓冲液中并以类似方式测定底物损失的量和/或所产生的产物的量来检验蛋白质是否具有从乙酰辅酶A分子合成乙酰乙酰辅酶A的能力是可能的。
[0079]MVA涂径核酸和多狀
[0080]可与乙酰乙酰辅酶A合酶结合使用的示例性MVA途径多肽包括但不限于:3_羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG辅酶A合酶)多肽(例如，mvaS编码的酶)、3_羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG辅酶A还原酶)多肽(例如，mvaR编码的酶或mvaE编码的经修饰为硫解酶缺陷型、但仍保留其还原酶活性的酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽 、IPP异构酶多肽、IDI多肽，以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(例如融合多肽)。具体地讲，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的天然多肽和核酸。另外，也可使用能够获得更好的异戊二烯产量的MVA途径多肽变体。
[0081]可使用的MVA途径多肽的非限制性例子在国际专利申请公开N0.W02009/076676、W02010/003007和W02010/148150中描述，将这些专利公开的内容明确地以引用的方式并入本文。
[0082]示例件3-羟某-3-甲某戊二酰辅酶A还原酶(HMG辅酶A还原酶)多fit和核酸
[0083]可使用催化将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸多肽的反应的酶，例如3_羟基_3_甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG辅酶A还原酶)。另一例子为mvaE编码的经修饰为硫解酶缺陷型、但仍保留其还原酶活性的酶。据报道mvaE基因编码既具有硫解酶又具有HMG辅酶A还原酶活性的多肽。由mvaE基因编码的多肽的硫解酶活性将乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A，而该多肽的HMG辅酶A还原酶酶活性将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸。可用于本发明的示例性mvaE多肽和核酸包括来自本文所述任何来源生物体的不具有硫解酶活性但具有HMG辅酶A还原酶酶活性的天然存在的或经修饰的多肽和核酸。
[0084]经修饰的mvaE多肽包括其中一个或多个氨基酸残基经历氨基酸置换但保留HMG辅酶A还原酶活性而同时具有极小或没有硫解酶活性的那些。氨基酸置换可以是保守的或非保守的，并且此类置换的氨基酸残基可以为或可以不为由遗传密码编码的残基。标准的二十种氨基酸的“字母表”已经根据其侧链的相似性而划分成为化学家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有化学上相似的侧链的氨基酸残基替换(即，将具有碱性侧链的氨基酸替换为具有碱性侧链的另一种氨基酸)的置换。“非保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有化学上不同的侧链的氨基酸残基替换(即，将具有碱性侧链的氨基酸替换为具有芳族侧链的另一种氨基酸)的置换。
[0085]可在mvaE多肽中引入氨基酸置换以改善该分子的功能性。例如，可在硫解酶缺陷型mvaE多肽中引入改善其将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A转化为甲羟戊酸的能力的氨基酸置换。在一些方面，硫解酶缺陷型mvaE多肽含有一个或多个保守氨基酸置换。
[0086]在一个方面，不被降解或较不易降解的硫解酶缺陷型mvaE蛋白可用于产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。可使用的不被降解或较不易降解的mvaE的基因产物的例子包括但不限于来自生物体屎肠球菌(E.faecium)、鹁鸡肠球菌(E.gal I inarum)、铅黄肠球菌(E.casseliflavus)、幾肠球菌(E.faecalis)和格氏李斯特菌(Lgrayi)的那些。本领域技术人员可通过任何标准分子生物学技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达mvaE蛋白并寻找片段的缺失。例如，可使用本文所述的检测方法在Hig标签介导的纯化后或当在产甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的大肠杆菌BL21中表达时在Safestain染色的SDS-PAGE凝胶上鉴定片段的不存在。
[0087]可使用例如Hedl等人(J Bacter1l.(《细菌学杂志》)2002年4月；184⑶:2116-2122)描述的那些标准方法，通过测量乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性的不存在和/或HMG辅酶A还原酶活性的存在来确定一种多肽是否具有硫解酶缺陷型、HMG CoA还原酶健全型mvaE活性。在示例性的测定法中，通过分光光度计监测302nm下的吸光度变化来测量乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性，该吸光度变化伴随着乙酰乙酰辅酶A的形成或硫解。测定乙酰乙酰辅酶A的合成的每个反应的标准测定法条件是ImM乙酰辅酶A、10mM MgCl2、50mMTris, ρΗΙΟ.5，并且通过添加酶引发反应。测定法可采用200 μ I的终体积。对于该测定法，I个酶单位(eu)代表1分钟内合成或硫解I μ mol的乙酰乙酰辅酶A。在另一示例性测定法中，HMG辅酶A还原酶活性可在340nm下通过分光光度计根据NADP (H)的出现和消失来监测。对于测量以显示HMG辅酶A还原脱酰基为甲羟戊酸的每个反应的标准测定条件为0.4mMNADPH、1.0mM (R, S) -HMG 辅酶 A、10mM KCl 和 10mM KxPO4, ρΗ6.5。测定法采用 200 μ I 的终体积。通过添加酶引发反应。对于该测定法，Ieu代表1分钟内周转I μ mol的NADP(H)。这对应于0.5 μ mol的HMG辅酶A或甲羟戊酸的周转。
[0088] 或者，甲羟戊酸在宿主细胞中的产量可通过(不限于)气相色谱法(参见美国专利申请公开N0.:US2005/0287655A1)或HPLC (参见美国专利申请N0.: 12/978，324)来测量。作为示例性测定法，可将培养物接种于容纳有补充有一种或多种抗生素的LB肉汤中的摇管中并在34°C下以250rpm温育14小时。接着，可将培养物稀释进容纳有TM3培养基的孔板中至最终OD为0.2，该培养基补充有1%葡萄糖、0.1%酵母提取物和200 μ M IPTG。然后用Breath Easier膜(Diversified B1tech公司)密封该板并在摇动器/温育箱中以600rpm在34°C下温育24小时。然后将ImL的每份培养物以3，OOOXg离心5分种。然后将上清液添加至20%硫酸并在冰上温育5分钟。然后将混合物以3000Xg离心5分钟，收集上清液用于HPLC分析。通过与甲羟戊酸(西格玛公司(Sigma))的标准曲线进行比较来测定样品中甲羟戊酸的浓度。另外可通过根据本领域已知的任何方法进行葡萄糖氧化酶测定法测量葡萄糖浓度。利用HPLC，可通过将每份样品的折射率响应与通过运行已知浓度的多种含甲羟戊酸溶液所产生的校准曲线相比较来定量甲羟戊酸的水平。
[0089]HMG辅酶A还原酶可在宿主细胞中在多拷贝质粒上表达。质粒可以是高拷贝质粒、低拷贝质粒或中等拷贝质粒。或者，可将HMG辅酶A还原酶整合进宿主细胞的染色体中。对于HMG辅酶A还原酶在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言，可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱动核酸的表达。启动子可以是HMG辅酶A还原酶的表达的强驱动子，可以是表达的弱驱动子，或可以是表达的中等驱动子。
[0090]示例性HMG辅酶A合酶多肽和核酸
[0091]可使用催化将乙酰乙酰辅酶A转化为HMG辅酶A的酶(例如，HMG辅酶A合酶或HMGS )。在一个实施例中，可使用mvaS基因编码的多肽。mvaS基因编码具有HMG辅酶A合酶活性的多肽。该多肽可将 乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG辅酶A)。示例性的mvaS多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及衍生自任何本文所述来源生物体的具有mvaS多肽的至少一种活性的突变多肽和核酸。
[0092]突变mvaS多肽包括其中一个或多个氨基酸残基已经历氨基酸置换而仍保持mvaS多肽活性(即将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的能力)的那些。可在mvaS多肽中引入氨基酸置换以改善该分子的功能性。例如，可将可增加mvaS多肽对其底物的结合亲和力或可改善其将乙酰乙酰辅酶A转化为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的能力的氨基酸置换引入mvaS多肽中。在一些方面，突变mvaS多肽含有一个或多个保守氨基酸置换。
[0093]可使用标准方法例如Quant等人(B1chem J.,(《生物化学杂志》)，1989，262:159-164)中所述的那些，通过测量HMG辅酶A合酶活性，来确定多肽是否具有mvaS活性。在示例性的测定法中，HMG辅酶A合酶活性可通过监测在303nm下的吸光度改变以分光光度法测量乙酰乙酰辅酶A的烯醇形式的消失来测定。可添加标准的Iml测定体系，该测定体系含有 50mm-Tris/HCl, pH8.0、10mM_MgC12 和 0.2mM- 二巯基丁二醇，30°C ；5mM-乙酰磷酸、10，M-乙酰乙酰辅酶A和5ul提取物样品，然后同时添加乙酰辅酶A (10uM)和10单位PTA。然后将HMG辅酶A合酶活性测量为在添加乙酰辅酶之前和之后的速率差值。乙酰乙酰辅酶A在所用的条件(pH8.0, 10mM-MgC12)下的吸收系数为12.2 X 10 3 M-1 cm-1通过定义，I单位酶活性引起每分钟转化Iumol乙酰乙酰辅酶Α。
[0094]或者，甲羟戊酸在宿主细胞中的产量可通过(不限于)气相色谱法(参见美国专利申请公开N0.:US2005/0287655A1)或HPLC (参见美国专利申请N0.: 12/978，324)来测量。作为示例性测定法，可将培养物接种于容纳有补充有一种或多种抗生素的LB肉汤中的摇管中并在34°C下以250rpm温育14小时。接着，可将培养物稀释进容纳有TM3培养基的孔板中至最终OD为0.2，该培养基补充有1%葡萄糖、0.1%酵母提取物和200 μ M IPTG。然后用Breath Easier膜(Diversified B1tech公司)密封该板并在摇动器/温育箱中以600rpm在34°C下温育24小时。然后将ImL的每份培养物以3，OOOXg离心5分种。然后将上清液添加至20%硫酸并在冰上温育5分钟。然后将混合物以3000Xg离心5分钟，收集上清液用于HPLC分析。通过与甲羟戊酸(西格玛公司)的标准曲线进行比较来测定样品中甲羟戊酸的浓度。另外可通过根据本领域已知的任何方法进行葡萄糖氧化酶测定法测量葡萄糖浓度。利用HPLC，可通过将每份样品的折射率响应与通过运行已知浓度的多种含甲羟戊酸溶液所产生的校准曲线相比较来定量甲羟戊酸的水平。
[0095]mvaS核酸可在宿主细胞中在多拷贝质粒上表达。质粒可以是高拷贝质粒、低拷贝质粒或中等拷贝质粒。或者，mvaS核酸可整合进宿主细胞的染色体中。对于mvaS核酸在质粒上或作为宿主细胞染色体的整合部分的两种异源表达而言，可以用诱导型启动子或组成型表达启动子驱动核酸的表达。启动子可以是mvaS核酸的表达的强驱动子，可以是表达的弱驱动子，或可以是表达的中等驱动子。
[0096]编码MVA下游途径的多肽的核酸
[0097]在本发明的一些方面，任何本文所述组合物或方法中描述的细胞还一种或多种编码甲羟戊酸(MVA)下游途径多肽的核酸。在一些方面，MVA下游途径多肽为内源多肽。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至强启动子。在一特定方面，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源MVA下游途径多肽。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的内源核酸有效连接至弱启动子。
[0098]甲羟戊酸下游生物合成途径包含甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)。在一些方面，MVA下游途径可还包含异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。本文提供的细胞可包含至少一种编码异戊二烯合酶、一种或多种MVA上游途径多肽和/或一种或多种MVA下游途径多肽的核酸。MVA下游途径的多肽可以是(a)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊 酸；(b)将5-磷酸甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸；和(c)将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯焦磷酸的任何酶。更具体而言，将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶可来自马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽和布氏拟甲烷球菌(M.Burtonii)甲羟戊酸激酶多肽。在另一方面，将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。
[0099]在一些方面，MVA下游途径多肽为异源多肽。在一些方面，该细胞包含不止一个拷贝的编码MVA下游途径多肽的异源核酸。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，编码MVA下游途径多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。在一些方面，异源MVA下游途径多肽为来自酿酒酵母、粪肠球菌或马氏甲烷八叠球菌的多肽。
[0100]编码MVA下游途径多肽的核酸可整合进细胞的基因组中或可在细胞中稳定表达。编码MVA下游途径多肽的核酸另外可位于载体上。
[0101]还在下面提供了示例性的MVA下游途径多肽:⑴甲羟戊酸激酶(MVK) ； (ii)磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD);以及(iv)异戊烯二磷酸异构酶(IDI)。具体地讲,下游MVK多肽可以来自甲烧八叠球菌属(Methanosarcina),并且更具体地讲，下游MVK多肽可以来自马氏甲烷八叠球菌。MVA下游途径多肽的另外的例子可见于美国专利申请公开2010/0086978，将上述专利公开关于MVK下游途径多肽和MVK下游途径多肽变体的内容以引用的方式全文并入本文。
[0102]本文所述的细胞中的任一者可包含IDI核酸(如编码IDI的内源或异源核酸)。异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯基-二磷酸S-异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)与二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化(如将IPP转化为DMAPP和/或将DMAPP转化为IPP)。示例性的IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准方法(例如本文所述的那些)通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内使IPP与DMAPP相互转化的能力来确定多肽是否具有IDI多肽活性。示例性的IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的IDI多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然多肽和核酸以及衍生自任何本文所述来源生物体的突变多肽和核酸。
[0103]MVA下游途径多肽包括具有MVA下游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的MVA下游途径核酸包括编码具有MVA下游途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的MVA下游途径多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然存在的多肽和核酸。此外，也还可使用能获得更好异戊二烯产量的MVA下游途径多肽的变体。
[0104]在一些方面，MVA下游途径多肽是来自酿酒酵母、粪肠球菌或马氏甲烷八叠球菌的多肽。在一些方面，该MVK多肽选自乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽和马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶多肽。本文所述启动子中的任一者(如本文所述的以及在本公开的实例中所鉴 定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)均可用于驱动任何本文所述MVA多肽的表达。
[0105]异戊二烯合酶-核酸和多肽
[0106]在本发明的一些方面，在任何本文所述的组合物或方法中所述的重组细胞还包含编码异戊二烯合酶多肽或具有异戊二烯合酶活性的多肽的一种或多种核酸。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为内源多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，使用不止一种编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸(如，2个、3个、4个或更多个拷贝的编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸)。在特定方面，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源异戊二烯合酶途径多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至弱启动子。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂种例如银白杨X欧洲山杨的多肽。
[0107]在一些方面，异戊二烯合酶多肽为异源多肽。在一些方面，细胞包含不止一个拷贝的编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。
[0108]编码异戊二烯合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中，或者可在细胞中稳定表达。编码异戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于载体上。
[0109]示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然多肽和核酸。此外，异戊二烯合酶的变体可具有改善的活性例如改善的酶活性。在一些方面，异戊二烯合酶变体具有其他改善的特性，例如改善的稳定性(如热稳定性)和/或改善的溶解性。
[0110]可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转化为异戊二烯的能力，来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。细胞提取物中的异戍二烯合酶多肽活性可例如按如下文献中所描述的进行测量:Silver等人，J.B1l.Chem.(《生物化学杂志》)270:13010-13016，1995。在一个示例性的测定法中，可在氮气流下将DMAPP(西格玛公司)蒸发至干燥并在10mM磷酸钾缓冲液(pH8.2)中将其再水化至10mM的浓度，并保存于_20°C下。为了进行该测定法，可将5mLlMMgCl2、lmM(250mg/ml)DMAPP、65mL植物提取物缓冲液(Plant Extract Buffer, PEB) (50mM Tris-HCl, pH8.0、20mM MgCl2,5% 甘油和2mMDTT)的溶液添加至20ml顶空小瓶(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))中的25 μ L细胞提取物中并在振动下于37°C培养15分钟，其中该小瓶具有金属旋盖和涂有特氟龙的硅隔膜。反应 可通过加入200 μ L的250mM EDTA进行淬灭并通过GC/MS进行定量。
[0111]在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自杨属的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为杨异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为葛异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂种银白杨X欧洲山杨的多肽或其变体。
[0112]在一些方面，异戍二烯合酶多肽或核酸来自豆科(Fabaceae),例如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸为来自如下的多肽或核酸或其变体:山葛(葛)(Sharkey 等人,Plant Phys1logy (《植物生理学》)137:700-712，2005)、野葛、杨(例如银白杨、黑杨、毛果杨或银白杨X欧洲山杨(CAC35696) (Miller等人，Planta (《植物学》)213:483-487，2001 )、山杨(例如美洲山杨)(Silver等人，JBC270 (22): 13010-1316，1995)、英国橡树(夏栎(Quercusrobur)) (Zimmer 等人，W098/02550 )。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自山葛、野葛、美洲山杨、银白杨、黑杨或毛果杨的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自银白杨的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，编码异戊二烯合酶(如来自银白杨的异戊二烯合酶或其变体)的核酸经密码子优化。
[0113]在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽为天然存在的多肽或核酸(例如，来自杨属的天然存在的多肽或核酸)。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型的或天然存在的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核酸的变体(例如，来自杨属的野生型或天然存在的多肽或核酸的变体)。
[0114]在一些方面，异戊二烯合酶多肽为变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的活性，例如改善的催化活性。活性(如催化活性)的增加可为至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一者。在一些方面，诸如催化活性之类的活性的增加为至少约I倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，诸如催化活性之类的活性的增加为约10%至约100倍(如，约20%至约100倍、约50%至约50倍、约I倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍)。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的溶解性。溶解性的增加可为至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%中的任一者。溶解性的增加可为至少约I倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍或100倍中的任一者。在一些方面，溶解性的增加为约10%至约100倍(如，约20%至约100倍、约50%至约50倍、约I倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽为天然存在的异戊二烯合酶的变体，并与天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的稳定性(如热稳定性)。
[0115]在一些方面，变体具有野生型或天然存在的异戊二烯合酶的活性的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约110%、至少约120%、至少约130%、至少约140%、至少约150%、至少约160%、至少约170%、至少约180%、至少约190%、至少约200%。变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有序列相似性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有至少约40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或 99.9% 中的任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在的异戊二烯合酶的变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有约70%至约99.9%、约 75%至约99%、约80%至约98%、约85%至约97%或约90%至约95%中的任一者的氨基酸序列同一性。
[0116]在一些方面，变体在野生型或天然存在的异戊二烯合酶中包含突变。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些方面，变体具有至少一个氨基酸置换。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶之间的不同氨基酸残基的数量可为一个或多个，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。天然存在的异戊二烯合酶可包括来自植物的任何异戊二烯合酶，例如葛异戊二烯合酶、杨异戊二烯合酶、英国栎异戊二烯合酶和柳树异戊二烯合酶。在一些方面，变体为来自银白杨的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，来自银白杨的异戊二烯合酶的变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些方面，变体为截短的银白杨异戊二烯合酶。在一些方面，编码变体(如来自银白杨的异戊二烯合酶的变体)的核酸为密码子优化的(例如，基于在其中表达异源异戊二烯合酶的宿主细胞而进行密码子优化的)。
[0117]本文提供的异戊二烯合酶多肽可以是W02009/132220、W02010/124146、W02012/058494和美国专利申请公开N0.:2010/0086978中所述的任何异戊二烯合酶或异戊二烯合酶变体，将这些专利关于异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体的内容明确地以引用的方式全文并入本文。
[0118]本文所述启动子中的任一种(例如，本文所述的以及在本公开的实例中所鉴定的启动子，包括诱导型启动子和组成型启动子)均可用于驱动任何本文所述的异戊二烯合酶的表达。
[0119]合适的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登录号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所标示的那些。可用于本文所述组合物或方法(包括产生编码异戊二烯合酶的微生物的方法)中的任一者的异戊二烯合酶类型也在国际专利申请公开 N0.W02009/076676、W02010/003007、W02009/132220、W02010/031062、W02010/031068、W02010/031076, W02010/013077, W02010/031079, W02010/148150, W02010/124146,W02010/078457、W02010/148256和W02012/058494中描述，将这些专利公开关于异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体的内容明确地以引用的方式全文并入本文。
[0120]编码DXP途径多肽的核酸
[0121]在本发明的一些方面，在任何本文所述的组合物或方法中描述的重组细胞还包含一种或多种编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的异源核酸。在一些方面，细胞还包含编码DXS多肽或其他DXP途径多肽的内源核酸的染色体拷贝。在一些方面，大肠杆菌细胞还包含一种或多种编码IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽的核酸。在一些方面，一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面，一个质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽。在一些方面，多个质粒编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽或其他DXP途径多肽。
[0122]示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标 准方法(如本文所述的那些)通过测量多肽在体外、在细胞提取物内或体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法在国际专利公开N0.W02009/076676、美国专利申请N0.12/335,071 (美国公开N0.2009/0203102)、TO2010/003007、美国公开 N0.2010/0048964、W02009/132220 以及美国公开N0.2010/0003716中进行了更详细的描述。
[0123]示例性的DXP途径多肽包括但不限于如下多肽中的任一者:DXS多肽、DXR多肽、MCT多肽、CMK多肽、MCS多肽、HDS多肽、HDR多肽和具有DXP途径多肽中的一种、两种或更多种的活性的多肽(如融合多肽)。具体地讲，DXP途径多肽包括具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的DXP途径核酸包括编码具有DXP途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXP途径多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及衍生自任何本文所述来源生物体的突变多肽和核酸。示例性的DXP途径多肽和核酸以及测量DXP途径多肽活性的方法在国际公开N0.:W02010/148150中进行了更详细的描述。
[0124]示例性的DXS多肽包括具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。可使用标准方法(如本文所述的那些)通过测量多肽在体外、在细胞提取物内或体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力来确定多肽是否具有DXS多肽活性。示例性的DXS多肽和核酸以及测量DXS活性的方法在国际专利公开N0.W02009/076676、美国专利申请N0.12/335,071 (美国公开N0.2009/0203102)、TO2010/003007、美国公开 N0.2010/0048964、TO2009/132220 以及美国公开N0.2010/0003716中进行了更详细的描述。
[0125]具体地讲，DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转化为1_脱氧-d_木酮糖-5-磷酸(DXP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸的能力，确定多肽是否具有DXS多肽活性。
[0126]DXR多肽将1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)转化为2_C_甲基-D-赤藓醇_4_磷酸(MEP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化DXP的能力来确定多肽是否具有DXR多肽活性。
[0127]MCT多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇_4_磷酸(MEP)转化为4_ (胞苷_5’ - 二磷酸)-2-甲基-D-赤藓醇(CDP-ME)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化MEP的能力来确定多肽是否具有MCT多肽活性。
[0128]CMK多肽将4-(胞苷-5’ - 二磷酸)~2~C~甲基-D-赤藓醇(OTP-ME)转化为2_磷酸-4-(胞苷-5’ - 二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓醇(⑶P-MEP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化CDP-ME的能力来确定多肽是否具有CMK多肽活性。
[0129]MCS多肽将2-磷酸-4-(胞苷_5’ - 二磷酸)~2~C~甲基-D-赤藓醇(CDP-MEP)转化为2-C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化CDP-MEP的能力来确定多肽是否具有MCS多肽活性。
[0130]HDS多肽将2-C-甲基-D-赤藓醇_2，4_环二磷酸转化为(E) _4_羟基_3_甲基丁 -2-烯-1-基二磷酸 (HMBPP或HDMAPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体、在细胞提取物内或体内转化ME-CPP的能力来确定多肽是否具有HDS多肽活性。
[0131]HDR多妝将(E)_4_羟基_3_甲基丁 _2_烯-1-基二憐酸转化为异戍烯二憐酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。可使用标准方法通过测定多肽在体外、在细胞提取物内或体内转化HMBPP的能力来确定多肽是否具有HDR多肽活性。
[0132]MVA涂径、异戊二烯合酶、IDI和DXP涂径多狀的来源牛物体
[0133]异戊二烯合酶、ID1、DXP途径和/或MVA途径核酸(不包括将两个乙酰乙酰辅酶A分子缩合为乙酰辅酶A的酶，例如乙酰乙酰辅酶A硫解酶或AACT)、MVA途径多肽(不包括将两个乙酰乙酰辅酶A分子缩合为乙酰辅酶A的酶，例如AACT河从天然含有异戊二烯合酶、IDI,DXP途径和/或MVA途径核酸的任何生物体获得。异戊二烯由多种生物体(例如细菌、酵母、植物和动物)天然地形成。一些生物含有产生异戊二烯的MVA途径。异戊二烯合酶核酸可例如从任何含有异戊二烯合酶的生物体获得。MVA途径核酸可例如从任何含有MVA途径的生物体获得。IDI和DXP途径核酸可例如从含有IDI和DXP途径的任何生物体获得。
[0134]异戊二烯合酶、DXP途径、IDI和/或MVA途径核酸的核酸序列可分离自细菌、真菌、植物、藻类或蓝细菌。示例性的来源生物体包括例如:酵母如酵母菌属的物种(如酿酒酵母)、细菌如埃希氏杆菌属的物种(如大肠杆菌)或甲烷八叠球菌属的物种(如马氏甲烷八叠球菌)、植物如葛或杨(如银白杨或银白杨X欧洲山杨CAC35696 )或山杨(如美洲山杨)。可使用的异戊二烯合酶、IDI和/或MVA途径多肽的示例性来源也在国际专利公开 N0.W02009/076676、N0.W02010/003007、N0.W02009/132220、N0.W02010/031062、N0.W02010/031068, N0.W02010/031076, N0.W02010/013077, N0.W02010/031079,N0.W02010/148150、N0.W02010/078457 和 N0.W02010/148256 中描述。
[0135]在某些方面，来源生物体是酵母，如酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属物种或假丝酵母属物种。
[0136]在一些方面，来源生物体为细菌，例如芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株如地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、泛菌属(Pantoea)的菌株如朽1檬泛菌、假单胞菌属的菌株如产碱假单胞菌、链霉菌属的菌株如变铅青链霉菌或锈赤链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、埃希氏杆菌属的菌株如大肠杆菌、肠杆菌属(^Enterobacter)的菌株、链球菌属(Streptococcus)的菌株或古细菌(Archaea)的菌株如马氏甲烧八叠球菌。
[0137]如本文所用，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。已经认识到，芽孢杆菌属还在继续进行分类学整理。因此，意在使该属包括已经重新分类的种，包括(但不限于)诸如现在命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”(Geobacillus stearothermophiIus)的嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物体。在存在氧气的情况下产生抗性内生孢子被视为芽孢杆菌属的定义性特征，但该特性还适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽抱杆菌属(Brevibacillus)、线芽抱杆菌属(Filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、嗜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽抱杆菌属(Salibacillus)、热芽抱杆菌属(Thermobacillus)、服芽抱杆菌属(Ureibacillus)和枝芽抱杆菌属(Virgibacillus)。
[0138]在某些方面，源 生物体是革兰氏阳性菌。非限制性例子包括链霉菌属的菌株(例如变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌或灰色链霉菌)和芽孢杆菌。在一些方面，来源生物体为革兰氏阴性细菌如大肠杆菌或假单胞菌属物种。在一些方面，来源生物体为嗜酸乳杆菌。
[0139]在一些方面，来源生物体为植物，例如来自豆科如蝶形花亚科的植物。在一些方面，来源生物体为葛、杨(例如银白杨X欧洲山杨CAC35696)、山杨(例如美洲山杨)或夏栎。
[0140]在某些方面，源生物体是藻类，例如绿藻、红藻、灰胞藻门、绿蜘藻、眼虫、色藻界或腰鞭毛虫。
[0141]在一些方面，来源生物体为蓝细菌，例如基于形态分类成如下任何组的蓝细菌:色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、_藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)0
[0142]示例性的宿主细胞
[0143]本领域的技术人员将认识到，可对表达载体进行设计，以包含优化某些宿主菌株的基因表达的某些元件。此类优化元件包括但不限于复制起始区、启动子和增强子。本文提及的载体和元件仅出于示例性目的进行描述，且不旨在缩小本发明的范围。
[0144]任何微生物或其子代可用于表达本文所述的任何基因(异源或内源)。包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌在内的细菌细胞可用于表达本文所述的任何基因。具体地讲，本文描述的基因可在由如下组成的组中的任一者中表达:埃希氏杆菌属(例如大肠杆菌)、嗜酸乳杆菌、柠檬泛菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、棒杆菌属物种(例如谷氨酸棒杆菌)、多糖降解菌2-40、Alginovibr1 aqualiticus、交替单胞菌属标准参考菌株KLIA、Asteromyces cruciatus、海贝内克菌、阴沟肠杆菌、海洋盐单胞菌、肺炎克雷伯菌、发光杆菌属物种(ATCC433367)、叶氏假交替单胞菌、假单胞菌属物种(例如，Pseudomonasalginovora、铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、恶臭假单胞菌)、溶藻弧菌、鲍鱼肠弧菌、哈维氏弧菌、白色链霉菌、变铅青链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌以及产碱假单胞菌细胞。在一个方面，细菌细胞为大肠杆菌细胞。在另一个方面，细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。存在许多类型的可在本发明的组合物和方法中用作宿主细胞的厌氧细胞。在本发明的一个方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述的细胞为专性厌氧细胞及其子代。专性厌氧菌在存在氧的条件下通常生长不良，或根本不生长。应当理解，可以存在少量的氧，也就是说，存在专性厌氧菌对低水平氧的一定耐受度。在一个方面，经工程改造以产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的专性厌氧菌可作为本文所述的任何方法和/或组合物的宿主细胞，并在实质上无氧的条件下生长，其中氧的存在量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害。
[0145]在本发明的另一方面，在本文所述的任何组合物或方法中所述和/或所用的宿主细胞为兼性厌氧细胞及其子代。兼性厌氧菌可在存在氧时通过有氧呼吸(例如利用TCA循环)生成细胞ATP。然而，兼性厌氧菌也可在不存在氧的情况下生长。这与在存在较高氧含量下死亡或生长不良的专性厌氧菌形成对照。在一个方面，因此，兼性厌氧菌可作为本文提供的任何组合物和/或方法的宿主细胞，并可经工程改造以产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊 二烯。兼性厌氧宿主细胞可在实质上无氧的条件下生长，其中氧的存在量对厌氧菌的生长、维持和/或发酵无害，或者作为另外一种选择可在存在较高氧含量的情况下生长。
[0146]宿主细胞另外可以为丝状真菌细胞及其子代。(参见例如Berka和Barnett,B1technology Advances,(《生物技术进展》)，(1989)，7 (2): 127-154)。在一些方面，丝状真菌细胞可以为如下任一者:长梗木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、青霉属(Penicillium)物种、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola Ianuginose)、灰腐质霉(Humicola grisea)、金抱子菌属(Chrysosporium)物种、Chrysosporium lucknowense、粘帚霉属(Gl1cladium)物种、曲霉属(Aspergillus)物种(例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)或泡盛曲霉(Aspergillus awamori))、镰刀霉属(Fusarium)物种(例如粉红键刀菌(Fusarium roseum)、禾赤键刀菌(Fusarium graminum)、谷类键刀菌(Fusariumcerealis)、尖抱键刀菌(Fusariumoxysporuim)或壤片键刀菌(Fusarium venenatum))、脉孢菌属(Neurospora)物种(例如粗糙链孢霉(Neurospora crassa))、肉座菌属(Hypocrea)物种、毛霉属(Mucor)物种(例如米黑毛霉(Mucor miehei))、根霉属(Rhizopus)物种或翅孢霉属(Emericella)物种。在一些方面，真菌为构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖孢镰刀菌或爺腐皮镰孢霉(Fusarium solani)。在某些实施例中，供本发明使用的质粒或质粒元件包括美国专利公开N0.US2011/0045563中所述的那些。
[0147]宿主细胞也可以为酵母，例如酵母属物种、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属物种或假丝酵母属物种。在一些方面，酵母菌属物种为酿酒酵母(参见例如Romanos等人,Yeast(《酵母》)，(1992),8(6):423-488)ο在某些实施例中，用于本文的质粒或质粒组分包括在美国专利No, 7，659，097和美国专利公开N0.US2011/0045563中描述的那些。
[0148]宿主细胞还可以为藻类物种，例如绿藻、红藻、灰胞藻门、绿蜘藻、眼虫、色藻界或腰鞭毛虫。(参见例如 Saunders 和 Warmbrodt, “Gene Express1n in Algae andFungi, Including Yeast (《藻类和真菌(包括酵母冲的基因表达》)”(1993)，马里兰州贝尔茨维尔的美国国家农业图书馆(Nat1nalAgricultural Library, Beltsville, MD))。在某些实施例中，供本发明使用的质粒或质粒元件包括美国专利公开N0.US2011/0045563中所述的那些。在一些方面，宿主细胞为蓝细菌，例如基于形态学分类成以下任何组的蓝细菌:绿球藻目、宽球藻目、颤藻目、念珠藻目或真枝藻目(参见例如Lindberg等人，Metab.Eng.(《代谢工程》)，(2010) 12(1): 70-79 )0在某些实施例中，供本发明使用的质粒或质粒元件包括如下专利文献中描述的那些:美国专利公开N0.US2010/0297749 ；US2009/0282545和国际专利申请 N0.W02011/034863 ο
[0149]在某些实施例中，大肠杆菌宿主细胞可用于表达本文所述的任何基因。在一个方面，宿主细胞为能够产生甲羟戊酸的大肠杆菌菌株的重组细胞或其子代，其表达编码乙酰乙酰辅酶A合酶的一种或多种核酸。所述大肠杆菌宿主细胞可产生异戊二烯、类异戊二烯前体(例如甲羟戊酸)和/或类异戊二烯，所产生的异戊二烯、类异戊二烯前体(例如甲羟戊酸)和/或类异戊二烯的量、峰值滴度和细胞生产率高于缺少一种或多种异源表达的编码乙酰乙酰辅酶A合酶的核酸的相同细胞的该量、峰滴度和细胞生产率。此外，大肠杆菌中的该一种或多种异源表达的编码乙酰乙酰辅酶A合酶的核酸可以是染色体拷贝(例如，整合进大肠杆菌染色体中)。在其他方面，该大肠杆菌细胞是在培养物中。
[0150]转化方法
[0151]编码乙酰乙酰辅酶A合酶(一种由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A产生乙酰乙酰辅酶A合酶的酶)、非硫解酶MVA途径多肽、DXP途径多肽、异戊二烯合酶、ID1、聚异戊二烯焦磷酸合酶以及产生异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯所需要的任何其他酶的核酸可通过所属领域技术人员已知的任何技术引入宿主细胞(如植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)中。
[0152]可使用用于将DNA构建体或载体引入宿主细胞中的标准技术，例如转化、电穿孔、细胞核显 微注射、转导、转染(如，脂质体介导的转染或DEAE葡聚糖介导的转染，或者使用重组噬菌体病毒的转染)、使用磷酸钙-DNA沉淀进行温育、用DNA包被的微粒进行高速轰击以及原生质体融合。通用的转化技术是本领域已知的(参见例如Current Protocols inMolecular B1logy (《现代分子生物学实验手册》)(F.M.Ausubel等人(编辑)第9章，1987 ；Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克隆:实验手册》)，第 3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor), 2001 ;以及 Campbell 等人，Curr.Genet.(《当代遗传学》)16:53-56, 1989)。所引入的核酸可整合进染色体DNA中或作为染色体外复制型序列维持。可以通过本领域中已知的任何方法选择转化体。适于选择转化体的方法在国际公开 N0.TO2009/076676、美国专利申请 N0.12/335，071 (美国公开 N0.2009/0203102)、W02010/003007、美国专利公开 N0.2010/0048964、W02009/132220 以及美国专利公开N0.2010/0003716 中进行了描述。
[0153]在一个实施例中，使用诸如大肠杆菌之类的细菌作为宿主。在此实施例中，可对表达载体进行选择和/或工程改造以能够在这种细菌中自主复制。除本文所列出的基因外，表达载体中还可以包括启动子、核糖体结合序列、转录终止序列。任选地，表达载体可含有控制启动子活性的基因。
[0154]可使用任何启动子，只要它能在如大肠杆菌的宿主中表达即可。可使用的这种启动子例子包括来自大肠杆菌的trp启动子、Iac启动子、PL启动子、PR启动子等以及来自噬菌体的T7启动子。另外，可使用人工设计的或经修饰的启动子，如tac启动子。
[0155]用于引入表达载体的方法没有特别的限制，只要由此将DNA引入细菌中即可。其例子包括使用钙离子的方法(Cohen, S.N.等人:Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA (《美国科学院院刊》)，69:2110-2114 (1972))和电穿孔法。
[0156]当酵母用作宿主时，可使用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等。在此情况下，启动子没有特别的限制，只要它能在酵母中表达即可。其例子包括gall启动子、gallO启动子、热休克蛋白启动子、MFa I启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子和AOXl启动子。
[0157]用于将重组载体引入酵母中的方法没有特别的限制，只要由此将DNA引入酵母中即可。其例子包括电穿孔法(Becker, D.M.等人Methods.Enzymol.(《酶学方法》)，194:182-187(1990))、原生质球法(Hinnen，A.等人:Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA (《美国科学院院刊》)，75:19 29-1933 (1978))和乙酸锂法(Itoh，H.: J.Bacter1l.(《细菌学杂志》)，153:163-168(1983))。
[0158]具体地讲，可能优选的是使用具有相对高的丙二酰辅酶A含量的微生物作为宿主微生物。丙二酰辅酶A是用于脂肪酸生物合成的物质并且存在于所有微生物中。前述的乙酰乙酰辅酶A合酶由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A。因此，可以通过使用具有高的丙二酰辅酶A含量的宿主微生物来改善异戊二烯/类异戊二烯生产率。
[0159]
[0160]可将合适的载体用于任何本文所述组合物和方法。例如，合适的载体可用于优化一个或多个拷贝的编码HMG辅酶A还原酶、异戊二烯合酶、聚异戊二烯焦磷酸合酶和/或一种或多种非硫解酶MVA途径多肽的基因的表达。在某些方面，载体包含选择标记。可选标记的例子包括(但不限于)抗生素抗性核酸(如，卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博莱霉素、新霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势(如营养优势)的核酸。在一些方面，一个或多个拷贝的HMG辅酶A还原酶、异戊二烯合酶、聚异戊二烯焦磷酸合酶和/或一种或多种非硫解酶MVA途径多肽核酸整合进没有选择标记的宿主细胞基因组中。可使用本公开的实例中表征或使用的载体中的任一者。
[0161]宿主细胞突变
[0162]本发明进一步涉及具有增加起始丙二酰辅酶A的细胞内池的突变的宿主微生物的用途。这些经修饰的宿主菌株为乙酰乙酰辅酶A合酶提供了增加的底物可利用性(如丙二酰辅酶A)，这可导致乙酰乙酰辅酶及其下游产物如异戊二烯和/或类异戊二烯的产量增加。在某些实施例中，宿主微生物可包含减弱或缺失柠檬酸循环基因sdhCDAB和citE、氨基酸转运蛋白brnQ和丙酮酸消耗者adhE的活性的基因操纵。在其他实施例中，宿主微生物可包含导致一种或多种基因过表达从而引起细胞内丙二酰辅酶A水平增加的基因操纵，所述一种或多种基因包括但不限于:乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPD)和/或丙酮酸脱氢酶复合物(I3DH)。参见例如，Fowler 等人，Applied and Environmental Microb1logy (《应用和环境微生物学》)，第 75卷，第 18 期，第 5831-5839 页(2009), Zha 等人，Metabolic Engineering (《代谢工程》)，11:192-198 (2009)，Xu 等人，Metabolic Engineering (《代谢工程》)，(2011) do1: 10.1016/j.ymben.2011.06.008，Okamura 等人，PNAS (《美国科学院院刊》)107:11265-11270 (2010)，以及US2010/0285549，将这些参考文献的内容明确地以引用的方式全文并入本文。
[0163]本发明还设想可增加通过MVA途径的碳通量的另外的宿主细胞突变。通过增加碳流量，可产生更多的异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。还可对如本文所述的包含乙酰乙酰辅酶A合酶的重组细胞进行工程改造来获得增加的流向甲羟戊酸产生的碳通量，其中对一种或多种来自如下的酶的活性进行调节:(a)柠檬酸合酶；(b)磷酸转乙酰酶；(C)乙酸激酶；(d)乳酸脱氢酶；(e)NADP依赖性苹果酸酶；和(f)丙酮酸脱氢酶。
[0164]柠檬酸合酶途径
[0165]柠檬酸合酶催化草酰乙酸和乙酰辅酶A的缩合以形成柠檬酸，其为三羧酸(TCA)循环的代谢物(Ner, S.等人，1983.B1chemistry (《生物化学》)22:5243-5249 ；Bhayana, V.和 Duckworth, H.1984.B1chemistry (《生物化学》)23:2900-2905)(图 5)。在大肠杆菌中，这种由gltA编码的酶在表现上与二聚亚基的三聚体相似。该六聚体形式允许该酶由NADH 别构调节。该酶已得到了广泛研究(Wiegand, G.和 Remington, S.1986.Annual Rev.B1physics B1phys.Chem.(《生物物理和生物物理化学年鉴》)15:97-117 ;Duckworth等人，1987.B1chem Soc Sy mp.(《生物化学协会文集》)54:83-92 ；Stockell, D.等人，2003.J.B1l.Chem.(《生物化学杂志》)278:35435-43 ；Maurus, R.等人，2003.B1chemistry (《生物化学》).42:5555-5565)。为了避免NADH的别构抑制，已考虑用枯草芽孢杆菌NADH非敏感型朽1樣酸合酶进行替换或补充(Underwood等人,2002.Appl.Environ.Microb1l.(《应用和环境微生物学》)68:1071-1081 ； Sanchez 等人，2005.Met.Eng.(《代谢工程》)7:229-239)。
[0166]由柠檬酸合酶催化的反应直接与催化甲羟戊酸途径的第一个步骤的硫解酶竞争，因为它们都以乙酰辅酶A作为底物(Hedl等人，2002.J.Bact.(《细菌学杂志》)184:2116-2122)。因此，本领域的技术人员可调节柠檬酸合酶的表达(如，降低酶活性)以允许更多的碳通量进入甲羟戊酸途径，从而增加甲羟戊酸、异戊二烯和类异戊二烯的最终产量。柠檬酸合酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%。在一些方面，通过降低内源柠檬酸合酶基因的活性来调节柠檬酸合酶的活性。这可通过用编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因对内源柠檬酸合酶基因进行染色体置换或通过使用衍生自枯草芽孢杆菌的编码NADH非敏感型柠檬酸合酶的转基因来实现。还可通过将内源柠檬酸合酶基因启动子替换为合成的组成型低表达启动子来调节(如降低)柠檬酸合酶的活性。柠檬酸合酶活性的降低可导致与柠檬酸合酶的表达不降低的微生物相比，更多的碳流入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0167]涉及磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶的途径
[0168]憐酸转乙酸酶(pta)(Shimizu 等人，1969.B1chim.B1phys.Acta (《生物化学与生物物理学学报》)191:550-558)催化乙酰辅酶A与乙酰磷酸(乙酰基-P)之间的可逆转化，而乙酸激酶(ackA) (Kakuda, H.等人，1994.J.B1chem.(《生物化学杂志》)，11:916-922)使用乙酰基-P来形成乙酸。这些基因可在大肠杆菌中作为操纵子而转录。它们一起催化乙酸的异化，同时释放ATP。因此，本领域的技术人员可通过降低磷酸转乙酰酶基因(如内源磷酸转乙酰酶基因)和/或乙酸激酶基因(如内源乙酸激酶基因)的活性而增加可用乙酰辅酶A的量。一种实现降低的方式是通过缺失磷酸转乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)。这可通过如下方式实现:将一个或两个基因替换为氯霉素表达盒，然后将该盒环出(loopingout)。乙酸由大肠杆菌因多种原因而产生(Wolfe, A.2005.Microb.Mol.B1l.Rev.(《微生物学与分子生物学评论》)69:12-50)。不受理论的约束，由于ackA-pta利用乙酰辅酶A，因此缺失那些基因可能使碳不转向乙酸并从而增加甲羟戊酸、异戊二烯或类异戊二烯的产率。
[0169]在一些方面，重组微生物与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乙酸。所产生的乙酸的量的降低可通过本领域技术人员已知的常规测定法进行测量。乙酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0170]磷酸转乙酰酶(pta)和/或乙酸激酶(ackA)的活性还可通过对酶进行其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性 的降低为降低至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或99%。
[0171]在一些情况下，降低内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的活性导致与内源磷酸转乙酰酶基因和/或内源乙酸激酶基因的表达不减弱的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0172]涉及乳酸脱氢酶的途径
[0173]在大肠杆菌中,D-乳酸通过酶乳酸脱氢酶(IdhA -图5)由丙酮酸产生(Bunch, P.等人，1997.Microb1l.(《微生物学》)143:187-195)。乳酸的产生伴随NADH的氧化，因此，当氧被限制并且无法适应所有还原当量时，将产生乳酸。因此，乳酸的产生可能是碳消耗源。这样，为了改善通向甲羟戊酸生产(以及异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯生产，如果需要的话)的碳流量，本领域技术人员可调节乳酸脱氢酶的活性，例如通过降低该酶的活性来调节。
[0174]因此，在一个方面，可通过减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性来调节乳酸脱氢酶的活性。这种降低可通过缺失内源乳酸脱氢酶基因来实现。也可以使用本领域技术人员已知的减弱乳酸脱氢酶基因活性的其他方式。通过操纵涉及乳酸脱氢酶的途径，重组微生物与内源乳酸脱氢酶基因的表达不减弱的微生物相比产生降低量的乳酸。所产生乳酸的量的降低可通过本领域技术人员已知的常规测定法测量。乳酸减少的量与未进行分子操纵时相比为至少约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0175]乳酸脱氢酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵来降低。酶活性降低可以是与未进行操纵时相比，比活性或总活性降低任何量。在一些情况下，酶活性的降低为降低至少约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0176]因此，在一些情况下，减弱内源乳酸脱氢酶基因的活性导致与内源乳酸脱氢酶基因表达不减弱的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0177]涉及苹果酸酶的途径
[0178]苹果酸酶(在大肠杆菌中，为SfcA和maeB)是通过以下方程式催化苹果酸转化为丙酮酸(使用NAD+或NADP+)的回补酶:
[0179]
(S)-苹果酸 + NAD(P)+一丙酮酸+ CO2 + NAD(P)H
[0180]因此，该酶的 两种底物为(S)-苹果酸和NAD (P)+，而其三种产物为丙酮酸、CO2和NADPH0
[0181]NADP依赖性苹果酸酶(maeB -图5)的表达(Iwikura等人，1979.J.B1chem.(《生物化学杂志》)85:1355-1365)可通过如下方式有助于增加甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯产率:1)将碳从TCA循环带回至甲羟戊酸途径的丙酮酸即乙酰辅酶A的直接前体(乙酰辅酶A自己为甲羟戊酸的直接前体)，以及2)产生可用于HMG辅酶A还原酶反应的额外 NADPHCOh, MK 等人，(2002) J.B1l.Chem.(《生物化学杂志》)277:13175-13183);Bologna, F.等人(2007) J.Bact.(《细菌学杂志》)189:5937-5946)。
[0182]这样，可通过调节(例如增加)苹果酸酶的活性和/或表达来实现更多的用于下游产生甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的起始底物(丙酮酸和乙酰辅酶A)。NADP依赖性苹果酸酶基因可以是内源基因。实现此目的的一种非限制性方式是将内源NADP依赖性苹果酸酶基因启动子替换为合成的组成型表达启动子。另一种增加酶活性的非限制性方式是通过使用一种或多种编码NADP依赖性苹果酸酶多肽的异源核酸。本领域的技术人员可使用易得的分子生物学技术在发酵或培养过程中监测maeBRNA的表达。
[0183]因此，在一些实施例中，重组微生物与NADP依赖性苹果酸酶基因的表达不增加的微生物相比产生增加量的丙酮酸。在一些方面，增加NADP依赖性苹果酸酶基因的活性导致与NADP依赖性苹果酸酶基因表达不增加的微生物相比更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0184]所产生丙酮酸的量的增加可通过本领域技术人员已知的常规测定法测量。丙酮酸增加的量与未进行分子操纵时相比可为至少约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0185]苹果酸酶的活性还可以通过对酶进行其他分子操纵来增加。酶活性增加可以是与尚未进行操纵时相比，比活性或总活性增加任何量。在一些情况下，酶活性的增加为至少约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。
[0186]涉及丙酮酸脱氢酶复合物的途径[0187]催化丙酮酸脱羧成乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合物由基因aceE、aceF和IpdA编码的蛋白质构成。那些基因的转录由数种调节因子调节。因此，本领域的技术人员可通过调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性来增加乙酰辅酶A。调节可以是增加丙酮酸脱氢酶复合物的活性和/或表达(例如，恒定表达)。这可通过不同的方式实现，例如通过在操纵子前设置强组成型启动子如 PL.6(aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg- λ 启动子，GenBank NC_001416 (SEQ ID NO: 2)),或使用一种或多种合成的组成型表达启动子。
[0188]因此，在一个方面，丙酮酸脱氢酶的活性通过增加丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因的活性来调节，所述丙酮酸脱氢酶复合物由如下组成:(a)丙酮酸脱氢酶(E1)，(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(c) 二氢硫辛酸脱氢酶。应当理解，可操纵这些基因中的任何一种、两种或三种以增加丙酮酸脱氢酶的活性。在另一方面，可通过减弱内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因的活性来调节丙酮酸脱氢酶复合物的活性，下文进一步进行了详细描述。内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白的活性可通过缺失内源丙酮酸脱氢酶复合物阻遏蛋白基因来减弱。
[0189]在一些情况下，丙酮酸脱氢酶复合物的一种或多种基因为内源基因。增加丙酮酸脱氢酶复合物活性的另一种方式是通过向微生物引入一种或多种编码一种或多种来自由如下酶组成的组的多肽的异源核酸:(a)丙酮酸脱氢酶(El)，(b) 二氢硫辛酸转乙酰酶和(C) 二氢硫辛酸脱氢酶。
[0190]通过使用任何这些方法，重组微生物与其中丙酮酸脱氢酶活性未受调节的微生物相比可产生增加量的乙酰辅酶A。调节丙酮酸脱氢酶活性可导致与丙酮酸脱氢酶表达未受调节的微生物相比，更多的碳通量进入甲羟戊酸依赖性生物合成途径。
[0191]突变的组合
[0192]应当理解，对于本文所述的任何酶和/或酶途径，明确地设想调节本文所述的酶和/或酶途径(如其中两者、三者、四者、五者或六者)的任何组合的分子操纵。为了便于对组合进行表述，将柠檬酸合酶(gltA)定为A，将磷酸转乙酰酶(ptaB)定为B，将乙酸激酶(ackA)定为C,将乳酸脱氢酶(IdhA)定为D,将苹果酸酶(sfcA或maeB)定为E,并且将丙酮酸脱羧酶(aceE、aceF和/或IpdA)定为F。如上所述,丙酮酸脱羧酶复合物的aceE、aceF和/或IpdA酶可单个地使用、或三种酶中的两种或三种酶中的三种一起使用，以增加丙酮酸脱羧酶活性。
[0193]因此，对于酶A-F的任何两种的组合，可以使用的非限制性组合为:AB、AC、AD、AE、AF、BC、BD、BE、BF、CD、CE、CF、DE、DF和EF。对于酶A-F的任何三种的组合，可以使用的非限制性组合为:ABC、ABD、ABE、ABF、BCD、BCE、BCF、CDE、CDF、DEF、ACD、ACE、ACF、ADE、ADF、AEF、BDE, BDF, BEF和CEF。对于酶A-F的任何四种的组合，可以使用的非限制性组合为:ABCD、ABCE、ABCF、ABDE、ABDF、ABEF、BCDE、BCDF、CDEF、ACDE、ACDF、ACEF、BCEF、BDEF 和 ADEF。对于酶A-F的任何五种的组合，可以使用的非限制性组合为:ABCDE、ABCDF、ABDEF、BCDEF、ACDEF和ABCEF。在另一方面，使用所有六种酶的组合:AB⑶EF。
[0194]因此，与不在三羧酸(TCA)循环活性条件下培养的微生物相比本文所述的重组微生物可实现增加的甲羟戊酸产量，其中重组微生物中的代谢碳通量通过调节一种或多种来自由如下酶组成的组的酶的活性而被导向甲羟戊酸生产:(a)柠檬酸合酶，(b)磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶，(C)乳酸脱氢酶，(d)苹果酸酶和(e)丙酮酸脱羧酶复合物。
[0195]用于增加产暈的其他调节因子和因素
[0196]可将其他分子操纵用于增加流向甲羟戊酸生产的碳流量。一种方法是减少、降低或消除供料进甲羟戊酸途径的途径的负调节因子的影响。例如，在一些情况下，基因aceEF-lpdA与第四个上游基因pdhR处于操纵子中。pdhR是其操纵子的转录负调节因子。在不存在丙酮酸的情况下，它结合其靶启动子并抑制转录。其还以相同的方式调节ndh和cyoABCD (Ogasawara, H.等人，2007.J.Bact.(《细菌学杂志》)189:5534-5541 )。在一个方面，缺失pdhR调节因子可提高甲羟戊酸的供应，并因而提高甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。
[0197]在其他方面，将6-磷酸葡糖酸内酯酶(PGL)引入缺少PGL的微生物(例如多种大肠杆菌菌株)可用于提高甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和类异戊二烯的产量。PGL可使用染色体整合或染色体外载体(如质粒)而引入。在某些实施例中，PGL可从表达内源性PGL的微生物(例如多种大肠杆菌菌株)基因组中缺失，以提高甲羟戊酸和/或异戊二烯
的产量。
[0198]在本发明的一些方面，在任何本文所述组合物或方法中描述的重组细胞可还包含一种或多种编码磷酸酮醇酶多肽或具有磷酸酮醇酶活性的多肽的核酸。在一些方面，磷酸酮醇酶多肽为内源多肽。在一些方面，编码磷酸酮醇酶多肽的内源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码磷酸酮醇酶多肽的内源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码磷酸酮醇酶多肽的内源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，使用不止一种编码磷酸酮醇酶多肽的内源核酸(如2、3、4或更多个拷贝的编码磷酸酮醇酶多肽的异源核酸)。在一特定方面，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源磷酸酮醇酶多肽。在一些方面，编码磷酸酮醇酶多肽的内源核酸有效连接至弱启动子。
[0199]磷酸酮醇酶酶可催化5-磷酸木酮糖转化为甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸和/或6-磷酸果糖转化为赤藓糖4-磷酸和乙酰磷酸。在某些实施例中，磷酸酮醇酶酶能够催化5-磷酸木酮糖转化为甘油醛3-磷酸和乙酰磷酸。在其他实施例中，磷酸酮醇酶酶能催化6-磷酸果糖转化为赤藓糖4-磷酸和乙酰磷酸。因而，不受理论的约束，本文所示的磷酸酮醇酶的表达可导致从碳水化合物源产生的乙酰磷酸的量增加。该乙酰磷酸可转化成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A然后可被MVA途径的酶活性利用来产生甲羟戊酸、类异戊二烯前体分子、异戊二烯和/或类异戊二烯。因而可以增加从碳水化合物底物产生的这些化合物的量。或者，乙酰磷酸和乙酰辅酶A的产量可以增加而该增加不反映在较高的细胞内浓度方面。在某些实施例中，细胞内乙酰磷酸或乙酰辅酶A浓度将保持不变或甚至降低，尽管磷酸酮醇酶反应正在进行。
[0200]示例性的磷酸酮醇酶核酸包括编码具有磷酸酮醇酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性的磷酸酮醇酶多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然存在的多肽和核酸以及衍生自任何本文所述来源生物体的突变多肽和核酸。在一些方面，磷酸酮醇酶核酸为编码磷酸酮醇酶多肽的异源核酸。
[0201 ] 可以用标准方法通过测量肽将D-6-磷酸果糖或D-5-磷酸木酮糖转化为乙酰磷酸的能力来确定多肽是否具有磷酸酮醇酶肽活性。可然后将乙酰磷酸转化成二茂铁乙酰基异轻月亏酸(ferryl acetyl hydroxamate),可以用分光光度法对二茂铁乙酰基异轻I亏酸进行检测(Meile等人，J.Bact.(《细菌学杂志》)183:2929-2936，2001 )。如本文所述的鉴定为具有磷酸酮醇酶肽活性的任何多肽均适合用于本发明。
[0202]在其他方面，示例性的磷酸酮醇酶核酸包括例如分离自罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、巴利阿里铁单胞菌(Ferrimonas balearica)、Pedobactor saltans、灰色链霉菌和/或达松维尔拟诺卡氏菌(Nocard1psis dassonvillei)的磷酸酮醇酶。可用于本发明的磷酸酮醇酶的另外例子在U.S.7，785，858中描述，将该专利以引用的方式并入本文。
[0203]能够增加异戊二烯产暈的重组细胞
[0204]异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是在大量应用中使用的重要有机化合物。例如，异戊二烯在多种化学组合物和聚合物的合成中，包括在合成橡胶的制备中用作中间体或原料。异戊二烯还是由许多植物和动物天然合成的重要生物材料。
[0205]异戊二烯通过异戊二烯合酶的酶促作用从DMAPP产生。因此，不受理论的束缚，据认为通过任何上述组合物和方法增加宿主细胞中甲羟戊酸的细胞产量将类似地导致产生较高量的异戊二烯。当与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯二磷酸异构酶和用于异戊二烯和类异戊二烯产生的其他适当酶的适当酶活性水平组合时，增加从葡萄糖产生甲羟戊酸的摩尔产率可转化为较高的从葡萄糖产生类异戊二烯前体和类异戊二烯(包括异戊二烯)的摩尔产率。
[0206]可通过使用任何本文所述的重组宿主细胞来进行异戊二烯的产生，其中使用乙酰乙酰辅酶A合酶制备乙酰乙酰辅酶A以用于MVA途径中的下游使用。乙酰乙酰辅酶A合酶的使用可增加甲羟戊酸产量，这继而可用于产生异戊二烯。任何上述能够增加甲羟戊酸产量的、表达一个或 多个拷贝的编码MVA上游途径多肽(包括但不限于HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶(如来自格氏李斯特菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、铅黄肠球菌和/或粪肠球菌的mvaS多肽)的异源核酸的重组宿主细胞也可能够增加异戊二烯的产量。在一些方面，这些细胞还包含一种或多种编码MVA下游途径的多肽的异源核酸和编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。
[0207]设想本文所述的重组细胞的组合物也处于本发明的范围内。应理解，重组细胞也涵盖子代细胞。
[0208]示例性的细胞培养基
[0209]如本文所用，术语“基本培养基”是指含有细胞可能生长所需的最少营养物的培养基,通常但并非总如此,不存在一种或多种氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种氨基酸)。基本培养基通常含有:(I)用于宿主细胞生长的碳源；(2)各种盐，其可因宿主物种和生长条件而变动；和(3)水。从简单的糖如葡萄糖到其他生物质的较复杂水解产物如酵母提取物，碳源可以有很大变化，如下文更详细论述的。盐通常提供必需元素如镁、氮、磷和硫以允许细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充有选择剂，例如抗生素，以针对某些质粒的维持等进行选择。例如，如果微生物对某一抗生素例如氨苄青霉素或四环素具有抗性，则可将该抗生素添加至培养基以便防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可在必要时补充有其他化合物以选择所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0210]任何基本培养基制剂均可用于培养宿主细胞。示例性的基本培养基制剂包括例如M9基本培养基和TM3基本培养基。每升M9基本培养基含有(I) 200ml无菌M9盐(每升64gNa2HP04-7H20、15gKH2P04、2.5g NaCl 和 5.0gNH4Cl); (2) 2mllM MgSO4 (无菌);(3) 20ml20%(w/v)葡萄糖(或其他碳源);和(4) 10mllM CaCl2 (无菌)。每升TM3基本培养基含有(I) 13.6gK2HPO4 ； (2) 13.6g KH2PO4 ； (3) 2g MgS04*7H20 ； (4) 2g 柠檬酸一水合物；(5) 0.3g 柠檬酸铁铵；
(6)3.2g (NH4)2SO4 ； (7)0.2g酵母提取物；和(8) Iml 1000X 痕量元素(Trace Elements)溶液；将pH调节至约6.8并将该溶液过滤灭菌。每升1000X痕量元素含有:(l)40g柠檬酸一水合物；(2) 30gMnS04*H20 ； (3) 1g NaCl ； (4) Ig FeS04*7H20 ； (4) Ig CoC12*6H20 ； (5) lgZnS04*7H20 ；(6) 10mg CuS04*5H20 ； (7) 10mg H3BO3 ;和(8) 100mgNaMo04*2H20 ;将 pH 调节至约 3.0。
[0211]另外的示例性基本培养基包括⑴磷酸钾Κ2ΗΡ04、⑵硫酸镁MgS04*7H20、(3)柠檬酸一水合物C6H807*H20、⑷柠檬酸铁铵NH4FeC6H5Op (5)酵母提取物(来自思宾格公司(b1springer) )、(6) 1000X 改良痕量金属溶液(Modified Trace Metal Solut1n)、(7)硫酸50%w/v> (8) foamblast882 (艾默罗德性能材料公司(Emerald Performance Materials))和
(9)宏量盐溶液(Macro Salts Solut1n) 3.36ml。将所有组分一起添加并溶解于去离子H2O中，然后加热灭菌。冷却至室温后，用氢氧化铵(28%)将pH调节至7.0，然后定容。灭菌和pH调节后添加维生素溶液和壮观霉素。
[0212]任何碳源均可用于培养宿主细胞。术语“碳源”是指一种或多种能够被宿主细胞或生物体代谢的含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可包含任何适于维持生活力或培养宿主细胞的碳源。在一些方面，碳源为碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)或转化糖(如酶处理过的蔗糖糖浆)。
[0213]在一些方面，碳源包括酵母提取物或酵母提取物的一种或多种组分。在一些方面，酵母提取物的浓度为 0.l%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v) 、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或 0.01%(w/v)酵母提取物。在一些方面，碳源既包括酵母提取物(或其一种或多种组分)又包括另一碳源，例如葡萄糖。
[0214]示例性的单糖包括葡萄糖和果糖；示例性的低聚糖包括乳糖和蔗糖，示例性的多糖包括淀粉和纤维素。示例性的碳水化合物包括C6糖(如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(如木糖或阿拉伯糖)。
[0215]示例性的细胞培养条件
[0216]下文，例如在实例部分中描述了适于本发明重组细胞维持和生长的材料和方法。适于细胞培养物的维持和生长的其他材料和方法是本领域所熟知的。示例性的技术可见于国际公开N0.W02009/076676、美国专利申请N0.12/335,071 (美国公开N0.2009/0203102)、W02010/003007、美国专利公开 N0.2010/0048964、TO2009/132220、美国专利公开 N0.2010/0003716 ；Manual of Methods for General Bacter1logy (《普通细菌学方法手册》)Gerhardt等人编辑,华盛顿特区美国微生物协会(American Society forMicrob1logy, Washington, D.C.) (1994)；或 Brock,载于 B1technology:A Textbook ofIndustrial Microb1logy (《生物技术:工业微生物学教材》),第二版(1989),马萨诸塞州桑德兰的 Sinauer Associates 公司(Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA.)。在一些方面，将细胞在培养基中在允许由插入宿主细胞中的核酸编码的一种或多种HMG辅酶A还原酶、HMG辅酶A合酶、异戊二烯合酶、DXP途径(例如DXS)、ID1、MVA下游途径多肽或PGL多肽表达的条件下培养。
[0217]可将标准的细胞培养条件用于培养细胞(参见例如，W02004/033646及其中所引用的参考文献)。在一些方面，将细胞在适当的温度、气体混合物和pH下(例如在约20°C至约37°C、在约6%至约84%C02和在约5至约9的pH下)培养和维持。在一些方面，在适当的细胞培养基中于35°C下培养细胞。在一些方面，发酵的pH范围为约pH5.0至约pH9.0 (例如，约pH6.0至约pH8.0或约pH6.5至约7.0)。可根据宿主细胞的需求在有氧、缺氧或无氧条件下培养细胞。此外，可将更多具体的细胞培养条件用于培养细胞。例如，在一些实施例中，细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)表达一种或多种在低拷贝至中等拷贝质粒中在强启动子控制下的编码HMG辅酶A还原酶的异源核酸并且在34°C培养。
[0218]可使用的标准培养条件和发酵模式(如分批发酵、分批补料发酵或连续发酵)在如下专利文献中进行了描述:国际公开N0.W02009/076676、美国专利申请N0.12/335,071 (美国公开 N0.2009/0203102)、W02010/003007、美国公开 N0.2010/0048964、W02009/132220、美国公开N0.2010/0003716。分批发酵和分批补料发酵是通用的并为本领域所熟知，其例子可在如下文献中找到:Brock, B1technology:A Textbook of Industrial Microb1logy(《生物技术:工业微生物学教材》)，第二版(1989) Sinauer Associates公司。
[0219]在一些方面，将细胞在限制葡萄糖条件下培养。所谓“限制葡萄糖条件”意指添加的葡萄糖的量低于细胞消耗的葡萄糖的量或约细胞消耗的葡萄糖的量的105% (例如约100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%)。具体地讲，在具体的一段时间，添加至培养基的葡萄糖的量与细胞所消耗的葡萄糖的量大致相同。在一些方面，通过限制所添加的葡萄糖的量使得细胞以细胞培养基中的葡萄糖的量可支持的速率生长来控制细胞生长的速率。在一些方面，在培养细胞期间葡萄糖不积聚。在多个方面，将细胞在限制葡萄糖条件下培养超过或约1、2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60或70小时。在多个方面，将细胞在限制葡萄糖条件下培养超过或约培养该细胞的总时长的5、10、15、20、25、30、35、40、
50、60、70、80、90、95或100%。虽然无意于受任何特定理论束缚，但据信限制葡萄糖条件可允许对细胞进行更有利的调节。
[0220]在一些方面，将宿主细胞分批培养。还可将宿主细胞分批补料培养或连续培养。另外，可将宿主细胞在基本培养基(包括但不限于任何上述基本培养基)中培养。基本培养基可还补充有1.0%(W/V)葡萄糖或任何其他六碳糖或更少。具体地讲，基本培养基可补充有 1% (w/V)、0.9% (w/V)、0.8% (w/V)、0.7% (w/v)、0.6% (w/v)、0.5% (w/v)、0.4% (w/v)、0.3% (w/v)、0.2%(w/v)或0.l%(w/v)葡萄糖。另外，基本培养基可补充0.l%(w/v)或更少的酵母提取物。具体地讲，基本培养基可补充有0.l%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04%(w/v)、0.03%(w/v)、0.02%(w/v)或 0.01%(w/v)酵母提取物。或者，基本培养基可补充有 l%(w/v)、0.9%(w/v)、0.8%(w/v)、0.7%(w/v)、0.6%(w/v)、0.5% (w/v)、0.4%(w/v)、0.3% (w/v)、0.2% (w/v)或 0.l%(w/v)葡萄糖以及补充有 0.l%(w/v)、0.09%(w/v)、0.08%(w/v)、0.07%(w/v)、0.06%(w/v)、0.05%(w/v)、0.04% (w/v)、0.03%(w/v)、
0.02% (w/v)或 0.01% (w/v)酵母提取物。
[0221]使用重组细胞来产生异戊二烯的方法
[0222] 本文还提供产生异戊二烯的方法，其包括培养任何本文所述的重组微生物。在一个方面，异戊二烯可通过培养重组宿主细胞(例如细菌细胞)产生，所述重组宿主细胞包含编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽(例如乙酰乙酰辅酶A合酶)的一种或多种核酸以及编码如下多肽的一种或多种核酸:(a)异戊二烯合酶多肽，其中该异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和(b) —种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽。在一个方面，可使用编码HMG辅酶A还原酶、MVA下游途径多肽和异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸。在另一个方面，异戊二烯可通过培养包含编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶、MVA下游途径多肽以及异戊二烯合酶多肽的一种或多种异源核酸的重组宿主细胞(例如细菌细胞)产生。异戊二烯可从任何本文所述的和根据任何本文所述方法的细胞产生。可将任何所述细胞用于从碳水化合物(包括六碳糖如葡萄糖)产生异戊二烯的目的。
[0223]该细胞可还包含一种或多种编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述异戊二烯合酶多肽(如银白杨异戊二烯合酶)的核酸分子。在一些方面，该宿主细胞可以是任何本文所述细胞。任何本文所述异戊二烯合酶或其变体、任何本文所述宿主细胞株系(如细菌株系)、任何本文所述启动子和/或任何本文所述载体也可用于利用任何本文所述能量来源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)来产生异戊二烯。在一些方面，产生异戊二烯的方法还包括回收异戊二烯的步骤。
[0224]在一些方面，在某个生产率时间点测量所产生的异戊二烯量。在一些方面，细胞的生产率为大约任何本文所公开的异戊二烯量。在一些方面，测量所产生的异戊二烯的累积总量。在一些方面，细胞的累积总生产率为大约任何本文所公开的异戊二烯量。
[0225]在一些方面，任何本文所述的细胞(例如培养物中的细胞)以大于约如下中的任一者或以约如下中的任 一者产生异戊二烯:1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1, 750,2, 000,2, 500,3, 000,4, 000,5, 000 或更多纳摩尔的异戊二烯/克细胞湿重/小时(nmol/gwc;m/hr)。在一些方面，异戊二烯的量为约2至约 5，OOOnmol/gwail/hr,例如约 2 至约 100nmol/gwail/hr、约 100 至约 500nmol/gwail/hr、约 150至约 500nmol/gwem/hr、约 500 至约 1，000nmol/gwem/hr、约 1，000 至约 2，OOOnmoI/gwcm/hr 或约2，000至约5，OOOnmoI/gwcm/hr0在一些方面，异戊二烯的量为约20至约5，OOOnmoI/gwcm/hr、约 100 至约 5，000nmol/gwail/hr、约 200 至约 2，000nmol/gwail/hr、约 200 至约 1，OOOnmol/gwail/hr、约 300 至约 1，OOOnmoI/gwcm/hr 或约 400 至约 1，OOOnmoI/gwcm/hr0
[0226]在一些方面，培养物中的细胞以大于如下的量或以约如下的量产生异戊二烯:1、
10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1,500,1,750、2，000,2, 500,3, 000,4, 000,5, 000、10，000、100，000 或更多纳克的异戊二烯 / 克细胞湿重 /hr (ng/gwcm/h)。在一些方面,异戍二烯的量为约2至约5，000ng/gwem/h,例如约2至约10ng/
约 100 至约 500ng/gwem/h、约 500 至约 1，000ng/gwem/h、约 1，000 至约 2，OOOng/gwcm/h或约2，000至约5，000ng/gwem/h。在一些方面，异戊二烯的量为约20至约5，000ng/gwem/h、约 100 至约 5，000ng/gwcm/h、约 200 至约 2，000ng/gwcm/h、约 200 至约 I, 000ng/gwcm/h、约 300至约 1，OOOng/gwcm/h 或约 400 至约 1，000ng/gwem/h。
[0227]在一些方面，培养物中的细胞以大于约如下量中的任一者或以约如下量中的任一者产生累积滴度(总量)的异戊二烯:1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1，000,1, 250,1, 500,1,750,2,000,2,500,3,000,4,000,5,000,10,000、50，000、100，000或更多毫克的异戊二烯/L发酵液(mg/Lss?，其中发酵液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些方面，异戊二烯的量为约2至约5，000mg/Lssa，例如在约2至约100mg/L发酵液、约100至约500mg/L发酵液、约500至约I, 000mg/L发酵液、约I, 000至约2，000mg/L发酵液或约2，000至约5，000mg/L发酵液。在一些方面，异戊二烯的量为约20至约5，OOOmg/L发酵液、约100至约5，000mg/L发酵液、约200至约2，000mg/L发酵液、约200至约
I,000mg/L发酵液、约300至约1，000mg/L发酵液或约400至约1，000mg/L发酵液。
[0228]在一些方面，培养物中的细胞所产生的异戊二烯占发酵排气的至少约1、2、5、10、
15、20或25体积％。在一些方面，异戊二烯占排气的约I至约25体积％，例如约5至约15%、约15至约25%、约10至约20%或约I至约10%。
[0229]能够增加类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产暈的重组细胞
[0230]类异戊二烯可在任何生物体中从类异戊二烯前体分子的合成产生，所述类异戊二烯前体分子是MVA途径的终产物。如上所述，类异戊二烯代表重要的一类化合物并且包括例如食品和饲料补充剂、风味和气味化合物以及抗癌化合物、抗疟疾化合物、抗真菌化合物和抗细菌化合物。
[0231]类异戊二烯作为一类分子，根据化合物中所包含的异戊二烯单位数对其进行分类。单萜包含十个碳或两个异戊二烯单位，倍半萜包含15个碳或三个异戊二烯单位，二萜包含20个碳或四个异戊二烯单位，二倍半萜包含25个碳或五个异戊二烯单位等等。类固醇(通常包含约27个碳)为裂解或重排的类异戊二烯产物。
[0232]类异戊二烯可由类异戊二烯前体分子IPP和DMAPP产生。这些各式各样的化合物衍生自这些相当简单的通用前体并且由成组的保守聚异戊二烯焦磷酸合酶合成(Hsieh等人，Plant Phys1l.(《植物生理学》)2011年3月;155 (3): 1079-90)。这些直链异戊二烯焦磷酸的各种链长(反映它们独特的生理学功能)通常由聚异戊二烯焦磷酸合酶高度发达的活性位点经由烯丙 基底物(二甲基烯丙基二磷酸(C5-DMAPP)、香叶基焦磷酸(Cltl-GPP)、法尼基焦磷酸(C15-FPP)、香叶基香叶基焦磷酸(C2tl-GGPP))与对应数目的异戊烯焦磷酸(C5-1PP)的缩合反应决定(Hsieh等人，Plant Phys1l.(《植物生理学》)2011年3月；155(3):1079-90)。
[0233]类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产生可通过使用包含乙酰乙酰辅酶A合酶的任何重组宿主细胞进行。此外，这些细胞可表达一个或多个拷贝的编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸以增加甲羟戊酸、异戊二烯、类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量。任何上述能够增加甲羟戊酸或异戊二烯产量的、表达一个或多个拷贝的编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸的重组宿主细胞也可以能够增加类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量。在一些方面，这些细胞还包含一种或多种编码如上所述的MVA下游途径的多肽、IDI和/或DXP途径的异源核酸和编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸。不受理论的束缚，据认为通过任何上述组合物和方法增加宿主细胞中甲羟戊酸的细胞产量将类似地导致产生较高量的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。当与甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶、异戊烯二磷酸异构酶和用于异戊二烯和类异戊二烯产生的其他适当酶的适当酶活性水平组合时，增加从葡萄糖产生甲羟戊酸的摩尔产率可转化成较高的从葡萄糖产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯(包括异戊二烯)的摩尔产率。
[0234]类异戊二烯的类型
[0235]本发明的重组微生物能够增加类异戊二烯和类异戊二烯前体分子DMAPP和IPP的产量。类异戊二烯的例子包括(不限于)半萜类化合物、单萜类化合物、倍半萜类化合物、二萜类化合物、二倍半萜类化合物、三萜类化合物、四萜类化合物和更高级的多萜类化合物。在一些方面，半萜类化合物为戊二烯醇(即3-甲基-2- 丁烯-1-醇)、异戊二烯醇(即3-甲基-3- 丁烯-1-醇)、2_甲基-3- 丁烯-2-醇或异戊酸。在一些方面，单萜类化合物可以为(不限于)香叶基焦磷酸、桉叶素、柠檬烯或菔烯。在一些方面，倍半萜类化合物为法尼基焦磷酸、青蒿素或没药醇。在一些方面，二萜类化合物可以为(不限于)香叶基香叶基焦磷酸、视黄醇、视黄醒、植醇、紫杉醇、毛喉素(forskolin)或阿非迪霉素(aphidicolin)。在一些方面，三萜类化合物可以为(不限于)角鲨烯或羊毛留醇。类异戊二烯还可选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、金合欢烯、α-金合欢烯、金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β_菔烯、桧烯、Y-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
[0236]在一些方面，四萜类化合物为番茄红素或胡萝卜素(类胡萝卜素)。如本文所用，术语“类胡萝卜素”是指一组天然存在的有机色素，其在植物、一些其他光合生物体如藻类的叶绿体和色质体中、在某些类型的真菌以及在某些细菌中产生。类胡萝卜素类包括含氧叶黄素类和非含氧胡萝卜素类。在一些方面，类胡萝卜素类选自叶黄素类和胡萝卜素类。在一些方面，叶黄素类为叶黄素或玉米黄质。在一些方面，类胡萝卜素为α -胡萝卜素、β -胡萝卜素、Y-胡萝卜素、隐黄质或番茄红素。
[0237]编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸
[0238]在本发明的一些方面，在本文任何组合物或方法中所述的包含乙酰乙酰辅酶A合酶的重组细胞还包含如本文所述编码非硫解酶MVA途径多肽的一种或多种核酸，以及编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的一种或多种核酸。该聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽可以为内源多肽。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可有效连接至组成型启动子或可类似地有效连接至诱导型启动子。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可另外有效连接至强启动子。或者，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的内源核酸可有效连接至弱启动子。具体地讲，对细胞进行工程改 造以相对于野生型细胞过表达内源聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽。
[0239]在一些方面，聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽为异源多肽。本发明的细胞可包含不止一个拷贝的编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。
[0240]编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中或可在细胞中稳定表达。编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸另外可位于载体上。
[0241]示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸包括编码具有聚异戊二烯焦磷酸合酶的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽将类异戊二烯前体分子转化为更复杂的类异戊二烯化合物。示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽和核酸包括来自任何本文所述来源生物体的天然存在的多肽和核酸。此外，聚异戊二烯焦磷酸合酶的变体可具有改善的活性如改善的酶活性。在一些方面，聚异戊二烯焦磷酸合酶变体具有其他改善的特性，例如改善的稳定性(如热稳定性)和/或改善的溶解性。示例性的聚异戊二烯焦磷酸合酶核酸可包括编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽例如(不限于)香叶基二磷酸(GPP)合酶、法尼基焦磷酸(FPP)合酶和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶或任何其他已知聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸。
[0242]在本发明的一些方面，任何本文组合物或方法中所述的细胞还包含一种或多种编码法尼基焦磷酸(FPP)合酶的核酸。FPP合酶多肽可以为内源基因编码的内源多肽。在一些方面，FPP合酶多肽由大肠杆菌中的内源ispA基因编码。编码FPP合酶多肽的内源核酸可有效连接至组成型启动子或可类似地有效连接至诱导型启动子。编码FPP合酶多肽的内源核酸可另外有效连接至强启动子。具体地讲，对细胞进行工程改造以相对于野生型细胞过表达内源FPP合酶多肽。
[0243]在一些方面，FPP合酶多肽为异源多肽。本发明的细胞可包含不止一个拷贝的编码FPP合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码FPP合酶多肽的异源核酸有效连接至组成型启动子。在一些方面，编码FPP合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导型启动子。在一些方面，编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸有效连接至强启动子。
[0244]编码FPP合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中或者可在细胞中稳定表达。编码FPP合酶的核酸另外可位于载体上。
[0245]可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将IPP转化为更高级的类异戊二烯的能力，来确定该多肽是否具有聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽活性。这些方法是本领域所熟知的并且例如在如下参考文献中进行描述:美国专利 N0.: 7，915，026 ；Hsieh 等人，Plant Phys1l.(《植物生理学》)2011 年 3 月；155(3): 1079-90 ；Danner 等人,Phytochemistry.(《植物化学》)2011 年 4 月 12 日[印刷版之前的电子出版物]Jones等人，J B1l Chem.(《生物化学杂志》)2011年3月24日[印刷版之前的电子出版物]Reeling等人，BMC Plant B1l.(《BMC植物生物学》)2011年3月7H ；11:43 ;Martin 等人，BMC Plant B1l.(《BMC 植物生物学》)2010 年 10 月 21 日；10:226 ；Kumeta 和 Ito, Plant Phys1l.(《植物生理学》)2010 年 12 月；154(4): 1998-2007 ；以及KMner 和 Boland, J Org Chem.(《有机化学杂志》)2010 年 8 月 20 日；75(16): 5590-600。
[0246]使用重组细胞来产生类异戊二烯和/或类异戊二烯前体分子的方法
[0247]本文还提供的是产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，该方法包括培养重组微生物(如重组细菌细胞)，所述重组微生物包含乙酰乙酰辅酶A合酶、聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽以及一种或多种编码MVA途径多肽的核酸，所述MVA途径多肽包括但不限于:HMG辅酶A还原酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG辅酶A合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG辅酶A还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯基磷酸激酶(IPK)多肽、IPP异构酶多肽、IDI多肽，以及具有两种或更多种MVA途径多肽的活性的多肽(如融合多肽)。
[0248]类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯可从任何本文所述和根据任何本文所述方法的细胞产生。可将任何所述细胞用于从碳水化合物(包括六碳糖如葡萄糖)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的目的。
[0249] 因此，本文提供制备类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法，该方法包括在适于产生异戊二烯以及产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的条件中，培养包含乙酰乙酰辅酶A合酶、聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽以及一种或多种编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸的重组宿主细胞。该细胞可还包含一种或多种编码上述MVA下游途径多肽(如MVK、PMK、MVD和/或IDI)和任何上述聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的核酸分子。在一些方面，该宿主细胞可以是任何本文所述细胞。任何本文所述的聚异戊二烯焦磷酸合酶或其变体、任何本文所述的宿主株系、任何本文所述的启动子和/或任何本文所述的载体也可用于利用任何本文所述能量来源(如葡萄糖或任何其他六碳糖)来产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
[0250]产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法可类似地包括如下步骤:(a)培养不内源性地具有HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的宿主细胞(例如，细菌细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中宿主细胞异源性地表达一个或多个拷贝的编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的基因；以及(b)产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯，其中宿主细胞与不包含HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体的宿主细胞相比，产生更大量的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。在某些实施例中，宿主细胞是细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞(包括丝状真菌)或酵母细胞。
[0251]用于产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的本发明方法与不包含HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的并且未经工程改造来增加流向甲羟戊酸产生的碳通量的产类异戊二烯和/或类异戊二烯前体的宿主细胞相比，可产生高出至少5%的量的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯。或者，该宿主细胞可产生高出约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯，包括这些百分数。在一些方面，产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。
[0252]本文提供的 是使用任何上述细胞来增大类异戊二烯和/或类异戊二烯前体分子的产量的方法。由细胞产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量可通过表达乙酰乙酰辅酶A合酶以及一种或多种编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸、一种或多种编码MVA下游途径多肽的异源核酸和一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽的异源核酸来增大。如本文所用，“增大的”类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产量是指，与不具有一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽、MVA下游途径多肽、DXP途径多肽和/或HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸且尚未经工程改造来增加流向甲羟戊酸产生的碳通量的细胞相比，任何本文所述组合物和方法所描述的细胞增加的针对类异戊二烯前体和/或类异戊二烯产生的细胞生产力指数(CPI)、增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的滴度、增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的质量产率，和/或增加的类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的比生产率。类异戊二烯前体和/或类异戊二烯的产量可增大约5%至约1，000, 000倍。与不表达一种或多种编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸并且尚未经工程改造来增加流向甲羟戊酸产生的碳通量的细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产量相比，类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量可增大约10%至约I, 000，000倍(例如，约I至约500，000倍、约I至约50，000倍、约I至约5，000倍、约I至约1，000倍、约I至约500倍、约I至约100倍、约I至约50倍、约5至约100，000倍、约5至约10，000倍、约5至约1，000倍、约5至约500倍、约5至约100倍、约10至约50，000倍、约50至约10，000倍、约100至约5，000倍、约200至约I, 000倍、约50至约500倍或约50至约200倍)。
[0253]与不表达一种或多种编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的异源核酸并且尚未经工程改造来增加流向甲羟戊酸产生的碳通量的细胞的类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯产量相比，类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的产量可增大至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、1 倍、2 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍、200 倍、500 倍、1000 倍、2000 倍、5000 倍、10，000 倍、20，000 倍、50，000 倍、100，000 倍、200，000 倍、500，000倍或1，000，000倍中任一种。
[0254]此外，可将更具体的细胞培养条件用于培养本文所述方法中的细胞。例如，在一些方面，用于产生类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的方法包括如下步骤:(a)在34°C下培养不内源性地具有HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的宿主细胞(包括细菌细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞)，其中宿主细胞异源表达在低拷贝至中等拷贝质粒上且处于强启动子控制下的一个或多个拷贝的编码HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合酶的基因；以及
(b)产生甲羟戊酸。在一些方面，产生甲羟戊酸的方法还包括回收类异戊二烯前体分子和/或类异戊二烯的步骤。在某些实施例中，宿主细胞是细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞(包括丝状真菌)或酵母细胞。
[0255]示例性的纯化方法
[0256]在一些方面，任何本文所述方法还包括回收所产生的化合物的步骤。在一些方面，任何本文所述方法还包括回收异戍二烯的步骤。在一些方面，通过吸收汽提(absorpt1nstripping)(参见例如美国申请N0.12/969，440)回收异戍二烯。在一些方面,任何本文所述方法还包括回收异源多肽的步骤。在一些方面，任何本文所述方法还包括回收萜类化合物或类胡萝卜素的步骤。
[0257]合适的纯化步骤在美国专利申请公开US2010/0196977A1中有更详细描述。
[0258]通过参照以下实例能进一步理解本发明，这些实例以举例说明的方式提供而非旨在进行限制。
[0259]SM
[0260]实例1:编码用于通讨乙酰乙酰辅酶A合酶(NDhT7)产牛MVA的MVA h游涂径的质粒的构建
[0261]产生表达质粒以编码分别表达乙酰乙酰辅酶A合酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶的nphT7基因、mvaS基因和mvaR基因。简单而言，合成正向引物和反向引物来由编码链霉菌蛋白质的合成基因扩增mvaS基因(MCM489和MCM490)、mvaR基因(MCM491和MCM492)以及nphT7基因(MCM495和MCM496)(表1)。将MCM485正向引物和MCM486反向引物用于扩增表达载体。用于载体扩增的DNA模板是pMCMl225 (表2)。用于从链霉菌扩增mvaS和mvaR的DNA模板是Str印CL190 (DNA2.0)，其含有编码mvaS和mvaR的合成操纵子，也编码乙酰辅酶A乙酰基转移酶(atoB)。将包括编码带组氨酸标记的NphT7的合成基因的pMCM1187模板用于扩增编码NphT7的基因(Genbank BAJ10048)。
[0262]表1.用于构律DMCM1320和DMCM1321的引物
[0263]
【权利要求】
1.一种能够产生异戊二烯的重组微生物，所述重组微生物包含一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸以及一种或多种编码如下多肽的核酸: a.异戊二烯合酶多肽，其中所述异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和 b.一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽， 其中在合适的培养基中培养所述重组微生物可产生所述多肽以及合成异戊二烯。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸为乙酰乙酰辅酶A合酶基因。
3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰辅酶A合酶基因为来自放线菌的基因。
4.根据权利要求3所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰辅酶A合酶基因为来自链霉菌属的基因。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其中所述乙酰乙酰辅酶A合酶基因编码具有SEQID NO:1的氨基酸序列的蛋白质或氨基酸序列与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有80%或更高同一性且具有由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的功能的蛋白质。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组微生物，其中所述异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽或其变体。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其中所述异戊二烯合酶多肽为来自葛属(Pueraria)或杨属(Populus)或杂种银白杨(Populus alba)x欧洲山杨(Populus tremula)的多肽或其变体。
8.根据权利要求7所述的重组微生物，其中所述异戊二烯合酶多肽选自山葛(Pueraria montana)或野葛(Pueraria 1bata)、美洲山杨(Populus tremuloides)、银白杨、黑杨(Populusnigra)和毛果杨(Populus trichocarpa)或其变体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种编码(b)中的一种或多种MVA途径多肽的核酸为异源核酸。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种编码(b)中的一种或多种MVA途径多肽的核酸为内源核酸的拷贝。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种MVA途径多肽选自(a)将乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成HMG辅酶A的酶；(b)将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；和(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组微生物，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶选自马氏甲烷八叠球菌(M.mazei)甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌(M.burtonii)甲轻戍酸激酶多肽、乳杆菌(Lactobacillus)甲轻戍酸激酶多肽、清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)甲轻戍酸激酶多肽、酵母甲轻戍酸激酶多肽、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)甲轻戍酸激酶多妝、链球菌(Streptococcus)甲轻戍酸激酶多肽、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)甲轻戍酸激酶多肽和链霉菌(Streptomyces)甲轻戍酸激酶多肽或链霉菌CL190甲轻戍酸激酶多肽。
13.根据权利要求12所述的重组微生物，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的重组微生物，其还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸S异构酶(IDI)多肽的核酸。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的重组微生物，其还包含一种或多种编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的核酸。
16.根据权利要求15所述的重组微生物，其中所述一种或多种编码一种或多种DXP途径多肽的核酸为异源核酸。
17.根据权利要求15所述的重组微生物，其中所述一种或多种编码一种或多种DXP途径多肽的核酸为内源核酸的拷贝。
18.根据权利要求15所述的重组微生物，其中所述一种或多种DXP途径多肽选自(a)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、(b) 1-脱氧-D-木酮糖_5_磷酸还原异构酶(DXR)、(c) 4- 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓醇合酶(MCT)、(d)4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK)、(e) 2C-甲基-D-赤藓醇-2，4-环二磷酸合酶(MCS)、(f) 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(HDS)和(g) 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4- 二磷酸还原酶(HDR)。
19.根据权利要求18所述的重组微生物，其中所述DXP途径多肽为DXS。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种异源核酸被置于诱导型启动子或组成型启动子之下。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种异源核酸被克隆进一种或多种多拷贝质粒中。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种异源核酸被整合进所述细胞的染色体中。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物为细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。
24.根据权利要求23所述的重组微生物，其中所述微生物为细菌细胞。
25.根据权利要求24所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
26.根据权利要求25所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞选自大肠杆菌细胞、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)细胞、棒杆菌属(Corynebacterium)物种细胞、朽1檬泛菌(P.citrea)细胞、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞、地衣芽孢杆菌(B.1icheniformis)细胞、迟缓芽孢杆菌(B.1entus)细胞、短芽孢杆菌(B.brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophiIus)细胞、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)细胞、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)细胞、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)细胞、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)细胞、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)细胞、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)细胞、环状芽孢杆菌(B.circulars)细胞、灿烂芽孢杆菌(B.1autus)细胞、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)细胞、白色链霉菌(S.albus)细胞、变铅青链霉菌(S.1ividans)细胞、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)细胞、灰色链霉菌(S.griseus)细胞、假单胞菌属(Pseudomonas)物种细胞以及产碱假单胞菌(P.alcaligenes)细胞。
27.根据权利要求26所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
28.根据权利要求26所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。
29.根据权利要求26所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为棒杆菌属物种细胞。
30.根据权利要求23所述的重组微生物，其中所述微生物为藻类细胞。
31.根据权利要求30所述的藻类细胞，其中所述藻类细胞选自绿藻、红藻、灰胞藻门、绿蜘藻、眼虫、色藻界或腰鞭毛虫。
32.根据权利要求23所述的重组微生物，其中所述微生物为真菌细胞。
33.根据权利要求32所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞为丝状真菌。
34.根据权利要求23所述的重组微生物，其中所述微生物为酵母细胞。
35.根据权利要求34所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞选自酵母菌属(Saccharomyces)物种、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种、毕赤酵母属(Pichia)物种或假丝酵母属(Candida)物种。
36.根据权利要求35所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
37.一种能够产生类异戊二烯的重组微生物，所述重组微生物包含一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸以及一种或多种编码如下核酸的核酸: a.一种或多种编码聚异戊二烯焦磷酸合酶的核酸；和 b.一种或多种编码一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽的核酸，其中在合适的培养基中培养所述重组微生物可产生所述多肽以及合成可回收量的类异戊二烯。
38.根据权利要求37所述的重组微生物，其中(b)的所述一种或多种编码一种或多种MVA途径多肽的核酸为异源核酸。
39.根据权利要求37-38中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种MVA途径多肽选自(a)将乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成HMG辅酶A的酶；(b)将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；和(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的重组微生物，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶选自马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、布氏拟甲烷球菌甲羟戊酸激酶多肽、乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、清酒乳杆菌甲羟戊酸激酶多肽、酵母甲羟戊酸激酶多肽、酿酒酵母甲羟戊酸激酶多肽、链球菌甲羟戊酸激酶多肽、肺炎链球菌甲羟戊酸激酶多肽和链霉菌甲羟戊酸激酶多肽、链霉菌CL190甲羟戊酸激酶多肽。
41.根据权利要求40所述的重组微生物，其中所述将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶为马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶。
42.根据权利要求37-41中任一项所述的重组微生物，其还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸S异构酶(IDI)多肽的核酸。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种异源核酸被置于诱导型启动子或组成型启动子之下。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种异源核酸被克隆进一种或多种多拷贝质粒中。
45.根据权利要求37-43中任一项所述的重组微生物，其中所述一种或多种异源核酸被整合进所述细胞的染色体中。
46.根据权利要求37-45中任一项所述的重组微生物，其中所述微生物为细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。
47.根据权利要求46所述的重组微生物，其中所述微生物为细菌细胞。
48.根据权利要求47所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
49.根据权利要求47所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞选自大肠杆菌细胞、嗜酸乳杆菌细胞、棒杆菌属物种细胞、柠檬泛菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、迟缓芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、嗜碱芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、耐盐芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、灿烂芽孢杆菌细胞、苏云金芽孢杆菌细胞、白色链霉菌细胞、变铅青链霉菌细胞、天蓝色链霉菌细胞、灰色链霉菌细胞、假单胞菌属物种细胞以及产碱假单胞菌细胞。
50.根据权利要求49所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
51.根据权利要求49所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。
52.根据权利要求49所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为棒杆菌属物种细胞。
53.根据权利要求46所述的重组微生物，其中所述微生物为藻类细胞。
54.根据权利要求53所述的藻类细胞，其中所述藻类细胞选自绿藻、红藻、灰胞藻门、绿蜘藻、眼虫、色藻界或腰鞭毛虫。
55.根据权利要求46所述的重组微生物，其中所述微生物为真菌细胞。
56.根据权利要求55所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞为丝状真菌。
57.根据权利要求46所述的重组微生物，其中所述微生物为酵母细胞。
58.根据权利要求57所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞选自酵母菌属物种、裂殖酵母属物种、毕赤酵母属物种或假丝酵母属物种。
59.根据权利要求58所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
60.根据权利要求37-59中任一项所述的重组微生物，其中所述类异戊二烯选自单萜、二萜、三萜、四萜、倍半萜和多萜。
61.根据权利要求60所述的重组微生物，其中所述类异戊二烯为倍半萜。
62.根据权利要求37-61中任一项所述的重组微生物，其中所述类异戊二烯选自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、金合欢烯、Ct-金合欢烯、β -金合欢烯、金合欢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β_菔烯、桧烯、Y-萜品烯、异松香烯和瓦伦西亚桔烯。
63.—种产生异戊二烯的方法，所述方法包括: a.培养重组微生物，所述重组微生物包含一种或多种编码(i)能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸，和一种或多种编码如下多肽的核酸:(ii)异戊二烯合酶多肽，其中所述异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和(iii) 一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽，以及 b.产生异戊二烯。
64.根据权利要求63所述的方法，其还包括回收所述重组微生物产生的异戊二烯。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种编码能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸为乙酰乙酰辅酶A合酶基因。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽。
67.根据权利要求63所述的方法，其中所述一种或多种MVA途径多肽选自(a)将乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合以形成HMG辅酶A的酶；(b)将HMG辅酶A转化为甲羟戊酸的酶；(c)将甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸的酶；(d)将5-磷酸甲羟戊酸转化为5-焦磷酸甲羟戊酸的酶；和(e)将5-焦磷酸甲羟戊酸转化为异戊烯焦磷酸的酶。
68.根据权利要求63所述的方法，其还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸δ异构酶(IDI)多肽的核酸。
69.根据权利要求63所述的方法，其中所述重组微生物还包含一种或多种编码一种或多种1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径多肽的核酸。
70.根据权利要求63所述的方法，其中所述微生物为细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述微生物为细菌细胞。
72.根据权利要求7 1所述的方法，其中所述细菌细胞为革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述细菌细胞为大肠杆菌细胞。
74.根据权利要求72所述的方法，其中所述细菌细胞为嗜酸乳杆菌细胞。
75.根据权利要求72所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞为棒杆菌属物种细胞。
76.根据权利要求70所述的方法，其中所述微生物为酵母细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述酵母细胞为酿酒酵母细胞。
78.—种产生类异戊二烯的方法，所述方法包括: a.培养重组微生物，所述重组微生物包含一种或多种编码(i)能够由丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A合成乙酰乙酰辅酶A的多肽的核酸，和一种或多种编码如下多肽的核酸:(ii)聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽，其中所述聚异戊二烯焦磷酸合酶多肽由异源核酸编码；和(iii)一种或多种甲羟戊酸(MVA)途径多肽，以及 b.产生所述类异戊二烯。
【文档编号】C12N9/00GK104039844SQ201280048738
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年8月3日 优先权日:2011年8月4日
【发明者】I·S·阿尔多, Z·Q·贝克, M·C·米勒, C·M·派瑞斯 申请人:丹尼斯科美国公司, 固特异轮胎和橡胶公司