用于产毒性测试的组合物和方法

用于产毒性测试的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及用于测试试剂的组合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridium?botulinum)神经毒素(BoNT)检测和分析)。尤其是，本发明涉及人诱导的多能干(hiPS)来源的细胞用于试剂检测和分析的用途。
【专利说明】用于产毒性测试的组合物和方法
[0001]本申请要求2011年9月29日提交的美国临时申请N0.61/540，693的优先权，将其通过引用以其整体在本文合并。
【【技术领域】】
[0002]本发明涉及用于测试剂(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神经毒素(BoNT)检测和分析)的组合物和方法。尤其是，本发明涉及人诱导的多能干(hiPS)来源的细胞用于试剂检测和分析的用途。
【【背景技术】】
[0003]由革兰氏阳性，土壤-居住细菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)合成的肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是人类知道的最毒性物质，且是神经麻痹性疾病肉毒中毒的成因剂(Johnson E (2005) in Topley and Wilson's microbiology and microbialinfections, ed S.P.Borriello, P.R.Murray, and G.Funke (Hodder Arnold, London, UnitedKingdom)，ppl035 - 1088)。已描述被指定为A~G的BoNT的7种免疫学不同的血清型(Gimenez DF&Gimenez JA (1995) Int J Food Microbiol27:1 ~9) oBoNT起初作为~150kDa的单链多肽合成，但翻译后蛋白水解切割产生由二硫键连接的~IOOkDa和~50kDa的不同重和轻链(HC和LC)。HC还被功能性地分为HCe和HCn亚结构域。HCe结构域负责识别及结合导致胞吞的特定神经元细胞表面受体，而HCn结构域负责胞吞囊泡膜中的通道形成和跨内体膜的 LC 的转位和内化(Montecucco et al., (2004)Trends Microbiol 12:442-446 ;Fischer A&Montal M(2007)J Biol Chem282:29604-29611 ；Fischer A, et al(2009)ProcNatl Acad Sci U S A106:1330-1335)。在转位期间，二硫键切割，及LC释放到细胞胞质溶胶及再作为 锌-依赖性内肽酶折叠为活性酶组分(Fischer et al., supra ；FischerA&Montal M(2007)Proc Natl Acad Sci U S A104:10447-10452)。LC然后特别在突触前囊泡靶向及切割细胞内SNARE蛋白，这导致神经递质释放的抑制。各BoNT血清型具有不同切割靶，BoNT/A和E切割SNAP-25在不同位点，BoNT/B，D，F和G在不同位点切割VAMP/突触泡蛋白，及 BoNT/C 切割 SNAP-25 和突触融合蛋白(见 Montecucco C&Schiavo G(1994)MolMicrobiol 13:1 ~8 的综述)。
[0004]天然存在的肉毒中毒是罕见但严重的疾病，在美国每年发生~110例和致死率是~5 ~10% (Johnson EA&Montecucco C(2008) in Handbook of Clinical Neurology, edAndrew G.Engel Elsevier, pp333_368)。由于它们的极度效力(对于 BoNT/A, lng/kg 的体重的估计的人致死剂量)(Bossi P, et al (2006)Cell Mol Life Sci63:2196-2212)，治疗情况中涉及的疾病肉毒中毒的严重性和高成本，尤其以大规模，BoNT已被分类为类别A选择剂及作为生物恐怖主义武器呈现严重的威胁(Arnon SS,等人(2001) JAMA285:1059-1070)。
[0005]BoNT/A及在更少得多的程度BoNT/B也被用作独特和重要药物来治疗各种神经肌肉病症及用于化妆品。食品和药物管理局批准的使用BoNT的条件包括化妆品治疗及暂时减轻各种肌肉痉挛状态病症，多汗和偏头痛(Chaddock JA&Acharya KR(2011)FEBS J278:899~904)。BoNT的化妆品和临床应用在增加，开发用于药学目的的BoNT的新制剂使需要临床试验，精确的效力确定，及中和抗体筛选。例如，BoNT被药学施用用于治疗:疼痛病症，随意肌肉强度，病灶张力失调，包括子宫颈，颅张力失调和良性自发眼睑痉挛，单侧面痉挛，及病灶痉挛状态，胃肠病症，多汗和化妆皱纹修正，眼睑痉挛，口颚肌张力失调，开颌类型，闭颌类型，夜磨牙症，Meige综合征，舌张力失调，眼睑失用症，打开子宫颈张力失调，颈项前屈，颈后倾，颈侧倾，斜颈，咽张力失调，喉张力失调，痉挛性发声困难/收肌类型，痉挛性发声困难/展肌类型，痉挛性呼吸困难，肢张力失调，臂张力失调，任务特定张力失调，作家痉挛，音乐家痉挛，高尔夫球员痉挛，腿张力失调，股内收，股外展膝屈曲，膝延伸，踝屈曲,踝延伸，马蹄内翻足,畸形足张力失调,纹状体趾,趾屈曲,趾延伸,轴张力失调，pisa综合征，腹部舞者张力失调，节段性张力失调，偏侧肌张力障碍，一般张力失调，X-连锁的张力失调帕金森症中的张力失调，皮质基底变性中的张力失调，X-连锁的张力失调帕金森症中的张力失调，迟发张力失调，脊髓小脑共济失调中的张力失调，帕金森病中的张力失调，亨廷顿病中的张力失调，Hallervorden-Spatz病中的张力失调，多巴-诱导的运动障碍/多巴-诱导的张力失调，迟发运动障碍/迟发张力失调，阵发性运动障碍/张力失调，运动性非-运动性作用-诱导的腭肌阵挛，肌阵挛肌纤维颤搐，刚性，良性肌肉痉挛，遗传性下颚震颤，反常性颌肌肉活性，半咀嚼痉挛，肥大性鳃肌病，咬肌肥大，胫骨前肌肥大，眼球震颤，振动幻觉核上性凝视麻痹，癫痫，持续性不全癫痫，痉挛性斜颈操作计划，展肌声带麻痹，顽固性突变发声困难，上食管括约肌功能障碍，声带肉芽肿，口吃抽动秽语综合征，中耳肌阵挛，保护性喉闭合，喉切除术后，言语失败，保护性上睑下垂，眼睑内翻括约肌Odii功能障碍，假性食道弛不能，非失弛缓症，食管运动神经病症，阴道痉挛，手术后固定震颤，膀胱功能障碍，逼肌括约肌协同 动作障碍，膀胱括约肌痉挛，单侧面痉挛，神经支配恢复术运动障碍，化妆品使用克劳足，皱眉面部不对称，颏肌笑靥，僵人综合征，破伤风前列腺增生，肥胖，治疗婴儿脑麻痹斜视，混合的麻痹相伴的，在视网膜剥离手术之后，在白内障手术之后，在无晶状体肌炎斜视中，肌病斜视，分离垂直性偏斜，作为斜视手术的附加，内斜视，外斜视，失弛缓症，肛门龟裂，外分泌腺活动过度，Frey综合征，鳄泪综合征，多汗，腋掌足底鼻漏，中风中的相对多涎，在帕金森氏中，在肌萎缩侧索硬化症中，痉挛性病情，在脑炎和脊髓炎自身免疫过程中，多发性硬化，横贯性脊髓炎，Devic综合征，病毒感染，细菌感染，寄生虫感染，真菌感染，在遗传性痉挛性轻截瘫卒中后综合征半球梗塞，脑干梗塞，脊髓梗塞中，在中枢神经系统创伤，半球损伤，脑干损伤，脊髓损伤中，在中枢神经系统出血，脑内出血，蛛网膜下出血,硬膜下出血,脊柱内出血中，在瘤形成,半球肿瘤,脑干肿瘤和脊髓肿瘤中。由此,在环境中，食品中，药学制备物中，为抗体检测，及在研究应用中BoNT活性的定量和可靠的检测在防止肉毒中毒，为反恐怖主义，以及新药物开发和患者安全性和产品的质量控制和保证测试中是关键的。
[0006]许多BoNT检测方法已出版，及它们可分为4大类别(Cai等人，(2007)Crit RevMicrobiol33:109~125的综述):1.免疫学检测全毒素的存在,但无法区别有活性的或无活性状态的体外测定(ELISA) ；2.检测毒素LC的酶促活性，但不区别有生物学活性的全毒素和仅LC的内肽酶测定；3.体内测定(小鼠生物测定)；及最后4.体内模拟测定诸如半隔膜测定，局部注射测定，及使用原代或永生化的细胞的基于细胞的测定。为了检测完全有活性的BoNT，检测测定应测量中毒过程的全部步骤(例如:结合于细胞表面受体的HC，胞吞，囊泡通道形成，二硫键切割，LC转导进细胞胞质溶胶，及SNARE蛋白的最终蛋白水解切割)。仅小鼠生物测定和体内模拟测定测量全部这些步骤。小鼠生物测定涉及给小鼠静脉内或腹膜内注射BoNT的不同稀释，然后观察小鼠肉毒中毒的症状(肢麻痹，用力呼吸，裙皱的毛皮，等)(Hatheway CL (1988) in Laboratory diagnosis of infectiousdiseases:principles and practice.eds Balows A, Hausler WH, Ohashi M&TuranoMA(Springer-Verlag, New York)，pplll - 133 ;Schantz EJaK, D.A.(1978)Journal of theAssociation of Official Analytical Chemists61:96-99)和最终死亡。尽管MBA是定量的，且可监测全部中毒步骤，但其具有大的出错率，在实验室之间或实验室之内不标准化，需要大量的动物，及对应设备及训练的人员。半隔膜和局部注射测定减少动物痛苦，且一些足够敏感，但仍需要大量的动物及熟练的人员。 [0007]这些测定的这些清楚地鉴定的缺点刺激了来自调控机构包括FDA和USDA的建议，以开发会提供对MBA特异性，敏感和定量替代性的基于细胞的模型(NationalInstitute of Environmental Health Sciences, 2008)。各种连续细胞系，包括神经-2a和PC-12，已用于毒性测试，但对与MBA竞争不是敏感足够的。源于大鼠，小鼠或鸡的原发性神经元，及源于小鼠胚胎干细胞的神经元显著地更敏感(Hall YH, et al(2004)JTmmunol Methods288:55-60 ；Keller JE, Cai F&Neale EA(2004)Biochemistry43:526-532 ；Lalli G, et al(1999)J Cell Scill2(Ptl6):2715-2724 ;Neale et al., (1999)J CellBioll47:1249-1260 ；Stahl AM, et al(2007)J Biomol Screenl2:370_377)。所描述的用于毒性测试及抗体检测的最敏感细胞类型是原发性大鼠脊髓细胞(RSC)测定(Pellett等人，(2007) FEBS Lett581:4803-4808)，其相比MBA更敏感，可再现及良好关联于小鼠生物测定(Pellett et al., (2010)J Pharmacol Toxicol Methods)。此外，源于胚胎干细胞的神经兀已也显不高度敏感(McNutt et al., (2011)Biochem Biophys Res Commun405:85-90 ；Pellett S, et al(2011)Biochem Biophys Res Commun404:388-392 ;Kiris E,et al(2011)Stem Cell Res)。但是，RSC测定仍需要使用一些动物及用于细胞制备的熟练的人员，且由于连续制备新批细胞的需求而不容易适应于测试标准化。
[0008]【发明概述】
[0009]本发明涉及用于测试试剂的组合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素(BoNT)检测和分析)。尤其是，本发明涉及人诱导的多能干(hiPS)来源的细胞用于试剂检测和分析的用途。
[0010]本发明的实施方式提供用于研究，筛选，临床和治疗性应用的神经元细胞(例如，人(例如，iPS来源的))。在一些实施方式中，方法用于BoNT及对BoNT的中和抗体的检测和分析。例示实施方式在这里及下文所述。另外的实施方式在本文所述及在本领域技术人员的知识之内。
[0011]例如，在一些实施方式中，本发明提供检定梭菌物种(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神经毒素(BoNT))的活性的方法,包括:(a)使人诱导的多能干细胞(hiPS)来源的神经元细胞与包含NT的组合物接触；及(b)检定NT的生物学活性。在一些实施方式中，梭菌物种是肉毒梭菌(Clostridium botulinum),丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum),或巴氏梭菌(Clostridium baratii)。在一些实施方式中，BoNT包括全部7种知道的血清型，包括血清型A，B, C，D，E，F和G及各血清型之内已知道的亚型。在一些实施方式中，NT是重组体，突变体或嵌合NT。在一些实施方式中，生物学活性是SNAP-25，VAMP或突触融合蛋白的切割。在一些实施方式中，测定是定性的，而在其他实施方式中，测定是定量的。在一些实施方式中，NT经纯化，而在其他实施方式中，其在复合物，溶液或基质中。在一些实施方式中，NT是重组体。在一些实施方式中，NT与选自下列的另一分子缀合:治疗性模式，标志物，成像剂，酶，受体，抗体或生物活性化合物。在一些实施方式中，方法还包括在接触hPS来源的神经元细胞之前，使NT与测试化合物接触的步骤。在一些实施方式中，测试化合物是NT的抗体(例如，中和抗体)或小分子抑制物。在一些实施方式中，中和抗体经纯化或在血清或抗毒素样品中。
[0012]本发明还提供检定梭菌物种神经毒素(例如，BoNT)的活性的方法，包括:(a)使人诱导的多能干(hiPS)来源的神经元细胞与包含(a)NT ;及(b)中和抗体的组合物接触；及(b)检定NT的生物学活性。
[0013]本发明也涉及测定包含有生物学活性的BoNT的制备物(优选，药学包含有生物学活性的BoNT的制备物)中有生物学活性的BoNT的量的方法及。在一些实施方式中，方法包括下列步骤:(a)使hiPS细胞来源的神经元细胞与包含有生物学活性的BoNT的制备物的样品接触 '及(b)测定存在于制备物中的有生物学活性的BoNT的量通过检定样品的BoNT的生物学活性。
[0014]在进一步实施方式中，本发明提供人诱导的多能干(hiPS)细胞来源的神经元细胞用于检定BoNT的活性的用途。
[0015]在本文描述了另外的实施方式。
【【专利附图】

【附图说明】】
[0016]图1显示iPS神经元中的BoNT受体表达。A.使iPS细胞成熟4，7，10，14和21天，及经蛋白印迹检定BoNT受体的表达水平。B.使iPS细胞成熟5，10，15和20天，并将成年人脑细胞用于实施定量-PCR测定。
[0017]图2显示平铺在7种不同底物上的iPS神经元的BoNT/Al敏感度的比较(显示在右侧)。
[0018]图3显示iPS神经元和RSC细胞的BoNT/Al敏感度。
[0019]图4显示检测iPS神经元中的BoNT/Al活性的时间依赖性。
[0020]图5显示相比RSC细胞，iPS神经元的BoNT/Al摄取速度。
[0021]图6显示由神经元的活性-依赖性BoNT/Al摄取。A.在细胞-刺激培养基中使iPS神经元和RSC细胞暴露于55U或275U的BoNT/Al经1，5，10和15分钟，之后去除毒素，并24h温育。B.使iPS神经元在神经元和细胞-刺激培养基中暴露于55U的BoNT/Al经1，5和lOmin。C.使神经元在细胞-刺激培养基中暴露于1.7~55U的BoNT/Al经5min，用神经元培养基洗涤两次，并温育24h。
[0022]图7显示iPS神 经元中抗体保护测定的蛋白印迹和光密度测定法数据。A.使iPS神经元暴露于1.5U的毒素和抗体经24h。B.使iPS神经元在细胞-刺激培养基中暴露于55U的毒素-抗体混合物经5分钟，移出混合物，将细胞洗涤两次，并温育24h。
[0023]图8显示iPS神经元对BoNT/A复合物及纯化的BoNT/A的敏感度。A.比较纯化的BoNT/A I 和 BoNT/Al 复合物的 SDS-PAGE 凝胶(自 Invitrogen 的阶梯:See Blue? Plus2前染色的标准)。B.在48h毒素暴露之后iPS神经元对BoNT/Al纯化的毒素和BoNT/Al复合物的敏感度。
[0024]图9显示iPS神经元中BoNT/B，C和E活性的检测。使iPS神经元成熟7天和使RSC细胞平行暴露于BoNT/B (A)，/C (B)及/E (C)的系列稀释48h。
[0025]【定义】
[0026]为了辅助本发明的理解，以下定义许多术语和短语:[0027]如本文所用，术语“宿主细胞”指称任何真核生物或原核生物细胞(例如，哺乳动物细胞，禽细胞，两栖动物细胞，植物细胞，鱼细胞和昆虫细胞)，无论位于体外或体内。
[0028]如本文所用，术语〃细胞培养物〃指称细胞的任何体外培养物。包括在此术语之内的是连续细胞系(例如，具有永生表型)，原代细胞培养物，有限细胞系(例如，非-转化的细胞)和体外维持的任何其他细胞群，包括卵母细胞和胚胎。
[0029]如本文所用，术语“毒性”指称，相比在毒物施用之前的相同的细胞或组织，对细胞或组织的任何有害或有害效应。
[0030]如本文所用，术语“药物组合物”指称活性剂与惰性或有活性的载体的组合，使组合物尤其适合于体外，体内或离体诊断或治疗性用途。
[0031 ] 如本文所用，术语“药学可接受的载体”指称任何标准药学载体，诸如磷酸盐缓冲溶液，水，乳剂(例如，诸如油/水或水/油乳剂)，及各种类型的润湿剂。组合物也可包括稳定剂和防腐剂。例如载体，稳定剂和佐剂。(见例如，Martin, Remington’s PharmaceuticalSciences, 15th Ed., Mack Publ.C0., Easton, PA[1975])?
[0032]如本文所用，术语“检测(detect)”，“检测(detecting) ”或“检测(detection) ”可描述发现或分辩或特定观察可检测标记的组合物的一般行为。
[0033]如本文所用，术语〃纯化的(purified) 〃或〃纯化(to purify) 〃指称自样品去除组分(例如，混杂物)。例如，抗体通过去除混杂的非-免疫球蛋白来纯化；它们也通过去除不与靶分子结合的免疫球蛋白来纯化。非-免疫球蛋白的去除和/或不与靶分子结合的免疫球蛋白的去除导致样品中靶-反应性免疫球蛋白的百分率的增加。在另一例中，重组多肽在细菌宿主细胞中表达,并将多肽通过去除宿主细胞蛋白来纯化；样品中重组多肽的百分率由此增加。
[0034]如本文所用，术语〃样品〃以最广义使用。在一种意义上，其意指包括自任何来源获得的样本或培养物，以及生物学和环境样品。生物学样品可从动物(包括人)得到及包括流体，固体，组织和气体。生物学样品包括细胞，组织，血制品，诸如血浆，血清等。但是该例不旨在被解释为限制可应用于本发明的样品类型。在一些实施方式中，样品也可为包含有生物学活性的BoNT的制备物的样品，诸如待应用于药物或化妆目的的BoNT制备物。而且，在本公开的一方面，样品也可为被怀疑包含BoNT的环境样品或食品样品。
[0035]【发明详述】
[0036]本发明涉及测试试剂的组合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素(BoNT)检测和分析)。尤其是，本发明涉及人诱导的多能干(hiPS)来源的细胞用于试剂检测和分析的用途。
[0037]本发明的实施方式提供检测和分析BoNT的系统和方法。在一些实施方式中，系统和测定法利用人iPS来源的神经元作为用于肉毒神经毒素(BoNT)检测的高度敏感和可再现的平台。在一些实施方式中，神经元是GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神经元的98%纯泛(pan)-神经元群，并作为分化的细胞产生及冷冻保存。在另一方面，神经元是基本上纯的GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神经元的泛-神经元群，并作为分化的细胞产生及冷冻保存，其中关于神经元细胞而言，细胞是至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %或至少96 %纯。在本发明的实施方式的开发过程期间进行的实验展示，细胞表达由全部BoNT血清型的BoNT中毒所必需的全部受体和底物。BoNT检测测定展示，源于iPS的神经元对于BoNT/A，B，C和E及中和抗体的定量检测是高度敏感的。
[0038]在2007年11月，2个独立小组首次显示，人成纤维细胞可通过活化一小组沉默的基因来简单地重编程为多能干细胞(Takahashi K, et al (2007) Celll31:861-872 ；Yu J, etal (2007) Science318:1917-1920)。这些细胞被称为诱导的多能干细胞和可类似于细胞系维持及冷冻保存。此发现开启了开发模拟全效、分化的人体细胞及不需要任何动物使用的巨大数的人iPS来源的细胞模型的机会。
[0039]在选择用于在本文所述的系统和方法中使用的iPS细胞中，优选的是，细胞可可靠地和可再现地产生及以对于该研究足够的量产生分化的细胞的纯群。在一些实施方式中，该细胞可获自 Cellular Dynamicslnc.(Madison, WI)。
[0040] 在本发明的实施方式的开发过程期间进行的实验证实，源于人iPS的神经元是对于肉毒神经毒素，中和抗体和抑制物的检测，及对于BoNT细胞进入及运输研究高度敏感、选择性和物种-特异性的细胞模型。这些神经元对于BoNT效力确定以及对于抗体检测，抑制物筛选，及研究应用适合取代MBA。
[0041]【1.细胞】
[0042]如本文所述，本发明的实施方式提供试剂诸如BoNT的检测和分析中使用的多能来源的干细胞。在一些实施方式中，细胞是人(例如，人诱导的多能干细胞来源的细胞(hiPS)来源的神经元细胞或人胚胎干细胞)。产生iPS细胞的方法描述于，例如，Yu等人，Science.2009May8 ；324(5928):797-801.Epub2009, W02011056971 和 W02011025852，各通过引用以其整体在本文合并。在一些实施方式中，使用适合的方法将iPS细胞分化为神经元(例如，描述于美国专利申请US2010/0279403和US2010/0216181的那些，各通过引用以其整体在本文合并)。
[0043]在一些实施方式中，神经元是GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神经元的98 %纯泛-神经元群，并作为分化的细胞产生及冷冻保存。在一些实施方式中，利用可商购的神经兀来源的 iPS 细胞(例如，来自 Cellular Dynamics Inc.(Madison, WI)或 GlobalStem,(Rockville, MD)的那些)，尽管可利用其他来源的。在一些实施方式中，细胞是神经元hiPS细胞。
[0044]在另一方面，细胞是神经元是GABA能，多巴胺能和谷氨酸能神经元的基本上纯的泛-神经元群，并作为分化的细胞产生及冷冻保存，其中细胞是相对于神经元细胞至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少96%纯。
[0045]本发明不限于本文所述的细胞。可利用另外的细胞系和原代细胞培养物。例如，在一些实施方式中，利用胆碱能神经元。
[0046]在一些实施方式中，适合的细胞系表达对于BoNT中毒必需或足够的受体和底物。[0047]在一些实施方式中，本发明提供系统和试剂盒，其包含本文所述的细胞系以及对于实施BoNT的检测和分析必需、足够或有用的组分。例如，在一些实施方式中，试剂盒包含细胞和细胞培养试剂(例如，板，缓冲剂，等)，测定试剂，对照(阳性和阴性BoNT和/或抑制物对照)和用于实施及分析测定的使用说明。
[0048]在本发明的一方面，hiPS细胞来源的神经元细胞通过由以上说到的过程产生的hiPS细胞分化和/或成熟为神经元细胞可获得或已获得。该神经元细胞分化,在一方面，可通过于约37°C及在约5% CO2下培养hiPS细胞来达到。在一方面，培养用培养基可为补充了 B27 及 glutamax 的 Neurobasal 培养基(Invitrogen, Inc., USA)。在仍另一方面，在聚-赖氨酸包被的板上培养细胞，在仍再一方面，板再包被基质胶(BD Bioscience, USA)。在一方面，将96孔板用于培养，其中细胞以约40，000细胞/孔的密度生长。在一方面，使细胞接种约24小时。之后，一方面使细胞成熟约2~约28天，在一方面，约4~约14或，在一方面，约4~约7天。
[0049]在一方面，所述的hiPS细胞来源的神经元细胞通过基本上描述于以下随附实施例的分化和成熟过程获得。
[0050]本发明的 实施方式也涉及由上述的分化和成熟过程获得的hiPS细胞来源的神经元细胞。
[0051]在一方面，该hiPS细胞来源的神经元细胞特征在于存在以下标志物之一种或更多，在一方面全部:β 3-微管蛋白，NeuN, vGAT, vGLUT2, NSE神经元-特异性烯醇酶)或Tbrl (T-结构域转录因子I)。对于β 3-微管蛋白或NeuN而言，见到本发明的hiPS细胞来源的神经元细胞的培养物中阳性细胞数是约99%。对于vGAT或VGLUT2而言，在一方面见到，培养物的至少部分细胞对于所述的标志物是阳性的。
[0052]在一方面，该hiPS细胞来源的神经元细胞特征在于缺失以下标志物之一种或更多及，在一方面全部:GFAP，TH, NNE (非-神经元烯醇酶)，Tbr2 (T-结构域转录因子2)，或NoGo a, C。对于GFAP而言，见到hiPS细胞来源的神经元细胞的培养物中阳性细胞数显著地低，而在一方面，约5%以下或甚至约1%以下，在一方面，对于余下标志物而言，见到它们，如果存在，以可检测的量以下存在。
[0053]上述的标志物的存在或缺失或量可，在一方面，通过常规免疫学技术测定。例如，标志物可通过免疫组织学染色技术，细胞裂解物的蛋白印迹分析测定或，至于β 3-微管蛋白或NeuN由FACS分析测定。还描述了其他检测技术(见，例如，US2012/0178083,US2008/0280301, Englund2005, J Neurosci25:247-251 ；Dupuis2002, Neurobiology ofDiseaseslO: 358-365 ;各通过引用在本文合并)。
[0054]在再一方面，hiPS细胞来源的神经元细胞特征在于以下电生理学性质之至少一种及，在一方面全部:Na2+通道被河豚毒素(TTX)抑制，K+通道被四乙基铵抑制，L-型Ca2+通道被硝苯地平抑制，P/Q-型Ca2+通道被W-美洲蜘蛛毒素IVA抑制或N-型Ca2+通道被W-食鱼螺毒素GVIA抑制。该电生理学性质可由标准电生理学测量测试，包括，例如，在将细胞用相应抑制物处理之前及之后实施膜片钳测量。
[0055]在另一方面，hiPS细胞来源的神经元细胞特征在于对BoNT及，在一方面，对BoNT/A的敏感度。而且，细胞，在一方面，也以剂量依赖性方式敏感于其他神经毒性化合物及，尤其是，敏感于至少一种或全部以下化合物:星形孢菌素，ATP竞争性激酶抑制物，氯丙嗪或吩噻嗪。向上述的化合物的敏感度可在，例如，细胞活力测定中测定。
[0056]在一方面，关于神经突生长物而言，hiPS细胞来源的神经元细胞也敏感于以下化合物之至少一种及，在一方面全部:抗霉素A，丝裂霉素C，MK571，PD98092或星形孢菌素。
[0057]而且，在一方面，关于线粒体膜电位损失而言，hiPS细胞来源的神经元细胞敏感于以下化合物之至少一种或，在一方面，全部:抗霉素A或缬氨霉素。
[0058][I1.测定和用途】
[0059]本发明的实施方式提供检定BoNT的组合物和方法。测定被用于研究，临床，诊断和治疗性应用中。
[0060]在一些实施方式中，测定利用多能细胞(例如，hiPS来源的神经元细胞)。使用人细胞提供物种-特 异性模型的优势。此外，与源于癌细胞系或修饰的细胞系的神经元(其可不是体细胞神经元的反映)相反，源于多能细胞的神经元是正常，健康神经元的代表。
[0061]在一些实施方式中，测定利用神经元细胞例如，hiPS来源的神经元细胞，以筛选BoNT的效力。在其他实施方式中，测定就BoNT的毒性进行筛选。在仍进一步实施方式中，测定法就BoNT的中和抗体的存在或性质进行筛选或就活性筛选其他生物医药。在一些实施方式中，测定是定量的，而在其他实施方式中，它们是定性的。
[0062]在一些实施方式中，细胞首先培养在适合的基质中。在一些实施方式中，培养细胞，以便获得神经元的成熟。相比既有测定中使用的细胞，在本发明的实施方式中使用的多能细胞提供更快速成熟的优势。在一些实施方式中，细胞接下来暴露于毒素(例如，BoNT)经适合的时期。毒素暴露之后，通过使用适合的方法计算期望的参数(例如，EC50)。本文所述的测定适宜于检测纯化的BoNT和在复合物中(例如，与如见于天然环境及一些药学制备物中的其他蛋白复合)的BoNT。本文所述的测定适宜于检测任意数的BoNT血清型(例如，BoNT/A, B, C，D, E, F和其G)或变体或嵌合体。在一些实施方式中，BoNT被重组表达。在其他实施方式中，它们自细菌细胞纯化。
[0063]在一些实施方式中，实施抗体保护测定，以测试中和抗体。尽管BoNT被有效用于就各种病情治疗大量的患者(见Dhaked等人，Indian J Med Resl32:489_503的综述)，一些会发展中和抗体，其会阻止进一步治疗的成功。例如，在子宫颈张力失调的治疗中估计，~5%的被治疗的患者会发展会阻碍进一步治疗的中和BoNT抗体(Kessler等人，(1999)J Neurol246:265~274)。目前，患者未被在它们的治疗过程中，就中和抗体的发展进行监测，因为高度敏感和定量测定不是可商购的(Sesardic等人，(2004)MovDisordl9Suppl8:S85_91)。使用iPS神经元的本文呈现的测试平台提供接收了 BoNT的重复的治疗剂或化妆注射的患者血清中BoNT-中和抗体的敏感和定量检测。中和抗体可在任意数的样品类型中进行检测(例如，纯化的抗体，血清，抗毒素，等)。
[0064]在一些实施方式中，测试BoNT的小分子抑制物(例如，为研究或药物筛选)。例如，在一些实施方式中，使细胞首先暴露于BoNT，然后暴露于抑制物，使细胞共暴露于二者，或使细胞首先暴露于抑制物，然后暴露于BoNT。
[0065]可利用任意数的适合的端点测量来检定BoNT活性。例包括，但不限于，蛋白印迹，神经递质释放，ELISA(Nuss JE, et al (2010) J Biomol Screenl5:42_51)或细胞内表达的报告子诸如，例如，FRET传感器(Dong等人，(2004)Proc Natl Acad Sci U S AlOl:14701-14706)。[0066]在一些实施方式中，本文所述的测定可用于在BoNT或衍生物作为药物产生期间测试质量控制或在诊断评定，在临床治疗的优化及施剂及治疗性模式的选择中用于研究用途。
[0067]本文所述的测定的另外的应用包括，但不限于，检测抑制物和诊断，临床，筛选及研究用途。
[0068]在一些实施方式中，本发明提供检定肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神经毒素(BoNT)的活性的方法，包括:(a)使hiPS来源的神经元细胞与包含BoNT的组合物接触；及(b)检定BoNT的生物学活性。
[0069]在所述的方法的一方面，检定可包括测定BoNT的生物学活性的存在或缺失。该测定有时也在本文被称为定性测定。需知，基于BoNT生物学活性的存在或缺失，可总结于在包含或怀疑包含所述有生物学活性的BoNT的组合物中有生物学活性的BoNT的存在或缺失。而且，在仍另一方面，检定可包括测定在包含有生物学活性的BoNT的组合物中有生物学活性的BoNT的量。需知 ，有生物学活性的BoNT的量可源于就在组合物中所述的BoNT检定的生物学活性的量。该测定可有时在本文也被称为定量测定。
[0070]在本发明的方法的一方面，BoNT是选自梭菌神经毒素的不同血清型组的神经毒素，例如，选自，例如，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C I，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F 或 BoNT/G。而且，在一方面，在本发明的方法中可将破伤风毒素(TeNT)用作神经毒素。
[0071]细菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别天然地产生这些高度有力的神经毒素，例如，肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些神经毒素特异性结合于神经元细胞及破坏神经递质释放。各毒素作为大致150kDa的无活性单链蛋白合成。翻译后处理涉及二硫桥形成，及被细菌蛋白酶的限制的蛋白水解(切割)。有活性的二链神经毒素由2条链组成，由二硫键连接的大致50kDa的N-端轻链和大致IOOkDa的重链。神经毒素结构上由3个结构域组成，例如，催化性轻链，包括转位结构域(N-端一半)和受体结合结构域(C-端一半)的重链,见,例如，Krieglsteinl990, EurJ Biocheml88，39 ;Krieglsteinl991，Eur J Biochem202，41 ;Krieglsteinl994，J ProteinCheml3, 49。BoNT多肽和TeNT多肽的结构已被描述于上述的参考文献。
[0072]BoNT和TeNT的7种抗原性地不同的血清型是通过切割SNARE蛋白来阻断突触胞吐的Zn2+-内切蛋白酶。神经毒素导致见于肉毒中毒和破伤风病症的弛缓性肌肉麻痹，见Fischer2007,Proc Natl.Acad.Sc1.USA104, 10447。
[0073]在仍另一方面，修饰的BoNT或TeNT的活性可在本发明的方法中检定。该修饰的 BoNT 可源于上述的 BoNT/A，BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 或 BoNT/G 或通过向BoNT或TeNT的氨基酸序列导入至少一个取代，添加和/或缺失来源于TeNT。该修饰的BoNT或TeNT，由此，可具有与以上提及的任何一种BoNT或TeNT的氨基酸序列具有至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。本文所用的术语〃同一”指称通过测定2个氨基酸序列之间的同一氨基酸数来表征的序列同一性，其中序列被比对，从而获得最高顺序匹配。其可通过使用公开的以计算机程序编码化的技术或方法计算诸如，例如，BLASTP 或 FASTA (Altschul 1990，J Mol Biol215, 403)。百分率同一性值，在一方面，在整个氨基酸序列上计算。为比较不同序列的基于各种算法的一系列程序是熟练的工人可利用的。在此情景中，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出特别可靠的结果。为了实施序列比对，可使用程序PileUp (Higginsl989，CAB10S5，151)或程序Gap和BestFit (Needlemanl970, J Mol Biol48 ；443 ；Smithl981, Adv Appl Math2, 482)，其是 GCG软件包的部分(Genetics Computer Groupl991, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)。以上以百分率(％)叙述的序列同一性值，在本发明的另一方面，使用程序GAP，用以下设置，在整个序列区测定:空位权重:50，长度重量:3，平均匹配:10.000和平均错配:
0.000，除非另外特别说明，其应总是被用作用于序列比对的标准设置。
[0074]在一方面，各上述的修饰的BoNT或TeNT多肽保留一个或更多及，在另一方面，全部相应未修饰的多肽的生物学性质，即BoNT/A，BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F,BoNT/G或TeNT。本领域技术人员会同意，在蛋白水解活化之后全生物学活性维持，即使可想到，未加工的前体可发挥一些生物学功能或是部分有活性的。本文所用的"生物学性质"指称(a)受体结合，(b)内化，(c)跨内体膜转位进胞质溶胶，和/或(d)涉及突触囊泡膜融合的蛋白的内源性蛋白分解性切割。用于评定生物学活性的体内测定包括小鼠LD50测定和离体小鼠半隔膜测定,如描述于,例如，Dressier等人。(Dressler2005, Mov Disord20:1617-1619，Keller2006, Neurosciencel39:629-637)。生物学活性通常以小鼠单位(MU)表达。如本文所用，IMU是神经毒性组分的量，其在腹膜内注射之后杀灭50%的特定的小鼠群，即小鼠腹膜内LD50。在再一方面，修饰的多肽可改善或改变生物学性质，例如，它们可包含改善酶识别或可改善受体结合或上述任何其他性质的切割位点。
[0075]在一方面，修饰的BoNT或TeNT可检定由本文所述的以上方法提到的生物学活性之一种或更多及，在一方面，全部。
[0076]在本发明的一方面，修饰的BoNT或TeNT选自，例如，BoNT或BoNt/TeNT杂合体，再靶向的BoNT，再靶向的TeNT和嵌合BoNT或TeNT。描述了修饰的BoNT和TeNT。
[0077]在本发明的方法的一方面，接触包括使至少2个不同组分物理接近，以允许所述组分的物理和/或化学相互作用。在上述的方法中，使hiPS来源的神经元细胞与包含或怀疑包含有生物学活性的BoNT的组合物接触。接触在足以允许在组合物中包含的有生物学活性的BoNT对hiPS细胞来源的神经元细胞发挥其生物学活性的时间及条件下实施。在一方面，由此，接触应使(a)受体结合，(b)内化，(c)跨内体膜转位进胞质溶胶，和/或(d)突触囊泡膜融合中涉及的蛋白或模拟hiPS细胞来源的神经元细胞中的所述过程的底物的内源性蛋白分解性切割。本领域技术人员熟知哪种条件需应用于hiPS细胞来源的神经元细胞的给定培养物。接触可，在一方面，在细胞培养系统中实施，其中将hiPS细胞来源的神经兀细胞，在孔板上，在适合的培养基中，及在适合的培养条件下，通过向培养基添加待由本文所述的方法检定BoNT活性的组合物的样品来培养。
[0078]在一方面,适合的培养条件包含在约37°C及在约5% CO2下培养。在一方面，培养用培养基是补充了 B27 及 glutamax 的 Neurobasal 培养基(Invitrogen, Inc., USA)。在仍另一方面，在聚-赖氨酸包被的板上培养hiPS细胞来源的神经元细胞,在仍再一方面,利用再包被基质胶(BD BiosciencejUSA)的板。在一方面，将96孔板用于培养，其中细胞以约10，000~约100，000细胞，在再一方面，约20，000~约60，000细胞和在仍一方面约40，000细胞/孔的密度生长。在 一方面，使细胞接种约24小时。在一方面，然后，使细胞成熟约2~约28天，在一方面，约4~约14或，在一方面，约4~约7天，之后实施接触。[0079]在仍一方面，所述的接触如描述于下文随附实施例进行实施。
[0080]在本发明的方法的一方面，包含有生物学活性的BoNT的组合物是已知包含有生物学活性的BoNT的组合物或怀疑包含有生物学活性的BoNT的组合物。组合物可除了所述的有生物学活性的BoNT之外，还包含其他成分，诸如，例如，适合的溶剂和/或稳定化剂诸如蛋白及，在一方面，80见'(撤70，撤17，撤33或见'順(他?))的复合蛋白，或其他蛋白稳定剂。组合物也可进一步包含例如，通过增强在本文别处提及的BoNT的任何生物学活性来辅助BoNT的生物学活性的蛋白。在仍一方面，组合物可包含多于一种BoNT。
[0081]在一方面，组合物是肉毒或包含有生物学活性的BoNT的其他细菌细胞或非-细菌细胞的细胞裂解物。在一方面，该组合物也是自该细胞裂解物由部分纯化获得的BoNT制备物，例如粗提物，或BoNT的纯化，例如，纯化的BoNT制备物。在另一方面，组合物是包含混合的组分的人工组合物。在仍一方面，组合物是如在本文别处定义的待用作药物组合物的制备物。
[0082]在本发明的方法的一方面，检定BoNT的生物学活性通过测定突触囊泡膜融合中涉及的蛋白的内源性蛋白分解性切割或，如果存在，hiPS细胞来源的神经元细胞中由有生物学活性的BoNT的其他底物切割来实施。
[0083]在一些实施方式中，突触囊泡膜融合中涉及的蛋白或其他基质具有由待检定的BoNT或TeNT识别的神经毒素切割位点。本文所用的神经毒素切割位点指称由神经毒素多肽的内源性蛋白酶识别及切割的切割位点。描述了被神经毒素蛋白酶识别的切割位点(见，例如，EP1926744B1 ;通过引用以其整体在本文合并)。原理上，神经毒素切割位点可为基质中天然地存在 的切割位点或是由神经毒素多肽蛋白酶识别及切割的人工设计的切割位点。
[0084]由BoNT/A蛋白酶识别及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/A切割的蛋白。在一方面，该蛋白是人SNAP25A或B或自下列物种的同源物，旁系同原物或其直系同原物:大鼠，小鼠，牛，担尼鱼属(Danio),鲫属(Carassius),爪蟾属(Xenopus),电鳐属(Torpedo),球海胆属(Strongylocentrotus),枪乌贼属(Loligo),椎实螺属(Lymnaea)或雨虎属(Aplysia)。源于所述蛋白的适合的切割位点公开于EP1926744B1。
[0085]由BoNT/B蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/B的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/细胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐属(Torpedo) VAMP-1,球海胆属(Strongylocentrotus) VAMP,果妮属(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕属(Hirudo) VAMP,爪蟾属(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,担尼鱼属(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,枪乌贼属(Loligo)VAMP,椎实螺属(Lymnaea) VAMP,雨虎属(Aplysia)VAMP或新小杆线虫属(Caenorhabditis) SNBl-样或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于所述蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。
[0086]由BoNT/Cl蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/Cl的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是人和小鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白IBl，突触融合蛋白2-1，突触融合蛋白2-2，突触融合蛋白2-3，突触融合蛋白3A或突触融合蛋白1B2，牛或大鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白IBl或突触融合蛋白1B2，大鼠突触融合蛋白2或大鼠突触融合蛋白3，小鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白IBl，突触融合蛋白1B2，突触融合蛋白2，突触融合蛋白3A，突触融合蛋白3B或突触融合蛋白3C，鸡突触融合蛋白IA或突触融合蛋白2 ;爪蟾属(Xenopus)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白1B，担尼鱼属(Danio)突触融合蛋白1A，突触融合蛋白IB或突触融合蛋白3，电鳐属(Torpedo)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白1B,球海胆属(Strongylocentrotus)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白1B,果蝇属(Drosophila)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白1B,水蛭属(Hirudo)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白1B，枪乌贼属(Loligo)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白1B，椎实螺属(Lymnaea)突触融合蛋白IA或突触融合蛋白IB或任何直系同原物，旁系同原物或其同源物。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。
[0087]由BoNT/D蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/D的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/细胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐属(Torpedo)VAMP-1,球海胆属(Strongylocentrotus) VAMP,果妮属(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕属(Hirudo) VAMP,爪蟾属(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,担尼鱼属(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,枪乌贼属(Loligo) VAMP,椎实螺属(Lymnaea) VAMP,雨虎属(Aplysia)VAMP或新小杆线虫属(Caenorhabditis) SNBl-样或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。[0088]由BoNT/E蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/E的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是，该蛋白是人SNAP-25A或B或自下列物种的同源物，旁系同原物或其直系同原物:大鼠，小鼠，牛，担尼鱼属(Danio)，鲫属(Carassius)，爪蟾属(Xenopus)，电耀属(Torpedo)，球海胆属(Strongylocentrotus)，枪乌贼属(Loligo),椎实螺属(Lymnaea)或雨虎属(Aplysia)。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。
[0089]由BoNT/F蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/F的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是，该蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/ 细胞短蛋白聚糖，牛 VAMP-2，大鼠 VAMP-2 或 VAMPUl VAMP-1，VAMP-2 或 VAMP-3，电耀属(Torpedo)VAMP-1,球海胆属(Strongylocentrotus)VAMP,果妮属(Drosophila)sybA, synB, synC, synD 或 syn,水輕属(Hirudo) VAMP,爪蟾属(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,担尼鱼属(Danio) VAMP-1 或 VAMP-2,枪乌贼属(Loligo) VAMP,椎实螺属(Lymnaea) VAMP,雨虎属(Aplysia) VAMP或新小杆线虫属(Caenorhabditis) SNBl-样或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。
[0090]由BoNT/G蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由BoNT/G的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是，该蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/ 细胞短蛋白聚糖，牛 VAMP-2，大鼠 VAMP-2 或 VAMPUl VAMP-1，VAMP-2 或 VAMP-3，电耀属(Torpedo)VAMP-1,球海胆属(Strongylocentrotus)VAMP,果妮属(Drosophila)sybA, synB, synC, synD 或 syn,水輕属(Hirudo) VAMP,爪蟾属(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,担尼鱼属(Danio) VAMP-1 或 VAMP-2,枪乌贼属(Loligo) VAMP,椎实螺属(Lymnaea) VAMP,雨虎属(Aplysia) VAMP或新小杆线虫属(Caenorhabditis) SNBl-样或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。[0091]由TeNT蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的一方面，源于敏感于由TeNT的切割的蛋白。在一方面，该蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/细胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐属(Torpedo)VAMP-1,球海胆属(Strongylocentrotus) VAMP,果妮属(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕属(Hirudo) VAMP,爪蟾属(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,担尼鱼属(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,枪乌贼属(Loligo) VAMP,椎实螺属(Lymnaea) VAMP,雨虎属(Aplysia)VAMP或新小杆线虫属(Caenorhabditis) SNBl-样或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。
[0092] 由BoNT蛋白酶识别的及切割的神经毒素切割位点，在本发明的另一方面，源于BoNT蛋白中发现的自动催化性切割位点。在一方面，待根据本发明使用及源于给定BoNT或TeNT的自动催化性切割位点的神经毒素切割位点包含至少6，至少8，至少10或至少15 个连续残基，其包括:BoNT/A 残基 250Tyr-251Tyr，BoNT/B 残基 256Phe_257Phe，BoNT/Cl 残基 257Phe-258Tyr，BoNT/D 残基 257Phe_258Phe，BoNT/E 残基 239Pro_240Leu，BoNT/F 残基 254Pro-255Leu，BoNT/G 残基 256Phe_257Phe，TeNT 残基 259Ile_260Tyr，BoNT/A 残基 Phe266-Gly267，BoNT/B 残基 Phe272_Gly273，BoNT/C I 残基 Phe273_Gly274，BoNT/D 残基 Phe273-Gly274，BoNT/E 残基 Phe255_Gly256，BoNT/F 残基 Phe270_Gly271，BoNT/G 残基Phe272-Gly273或TeNT残基Phe275_Gly276。源于蛋白的适合的切割位点公开于，例如，EP1926744B1。
[0093]在本发明的一方面，BoNT和TeNT的上述神经毒素切割位点的切割可通过测定由上述的蛋白的切割获得的一种或更多切割产物来检定。源于蛋白的产物可由特异性结合所述的切割的产物，但不结合未切割的蛋白的抗体测定。该特异性结合抗体与产物的结合可通过在本文或在别处所述的技术测定。例如，特异性地结合的抗体可共价或非-共价连接于可检测的标记物。该可检测的标签可为与特异性地结合的抗体共价连接的可检测的部分或其可为检测剂，诸如检测抗体或特异性结合特异性地结合的抗体及允许，例如，经与之共价连接的可检测的部分检测的适体。各种类型的该免疫测定可以此方式用于测定切割的产物及，由此，用于检定BoNT或TeNT的生物学活性。
[0094]一方面，本文定义的具有神经毒素切割位点的蛋白的切割可通过蛋白印迹测定。在另一方面，所述切割可通过ELISA，RIA或其他免疫学检定形式，包括在本文别处提及的那些测定。
[0095]在另一方面，可使用人工底物，其包含上述神经毒素切割位点，及在所述位点切割后，至少一种物理和/或化学性质改变。例如，该一方面涉及的底物可包含能彼此物理学和/或化学相互作用，且被具有神经毒素切割位点的接头隔开的第I和第2部分。作为切割位点的切割的结果，2部分之间的上述的相互作用会改变。适合的部分是，例如，在未切割的状态中呈现共振能量转移的供体和受体荧光团，所述共振能量转移在切割之后间断。或者，可应用荧光团和猝灭剂，其中猝灭剂的淬灭效应在切割之后逆转。所述种类的底物描述于，例如下列文献中的任何一个:EP1438586B1，EP2208067A1, EP1543329A2, EP1869459B1,EP2293064B1, EP1920248B1, EP2264458A1, EP2332959A2, W02011/47241, EP1901069B1,EP2293064B1, EP1807698B1或EP2107112B1 ;各通过引用以其整体在本文合并。
[0096]在本发明的方法的仍一个特定方面，检定通过通过使用第I抗体及，在一方面，特异性结合所述切割的SNAP-25的单克隆抗体测定切割的SNAP-25的量来测定存在于hiPS细胞来源的神经元细胞中的切割的SNAP-25的量来实施。而且，存在于细胞中的总SNAP-25，例如，切割的及未切割的SNAP-25，由第2抗体及，在一方面，结合所述总SNAP-25的多克隆抗体测定。在一方面，结合的第I抗体的量和结合的第2抗体的量可通过检测剂，在一方面，由一种或更多允许区别结合的第I抗体的量和结合的第2抗体的量的检测抗体来测定。例如，可使用偶联于第I标记物及结合于第I抗体的第I检测抗体和偶联于第2标记物及结合于第2结合的抗体的第2检测抗体。结合的第I抗体及结合的第2抗体的量及，由此，切割的及总SNAP-25的量可随后源于测定的第I和第2标记物的量。在一方面，在本文涉及的第I标记物可为酶诸如辣根过氧化物酶。在另一方面，在本文涉及的第2标记物可为酶诸如碱性磷酸酶。标记物可用于催化非-荧光底物向荧光产物的可检测的转变。
[0097]在本发明的方法的仍另一方面，检定通过测定神经递质释放进，例如，培养基来实施。释放的或非-释放的神经递质的量可通过在本文或在别处所述的技术测定。
[0098]有利地，由本发明涵盖的方法基于非-动物资源，例如，hiPS细胞来源的神经元细胞，及，因此，避免动物测试。然而，hiPS细胞来源的神经元细胞允许测试需要的BoNT的全部生物学活性，例如，(a)受体结合，(b)内化，(C)跨内体膜转位进胞质溶胶，和/或(d)突触囊泡膜融合中涉及的蛋白的内源性蛋白分解性切割。因此，方法可用于安全性或质量控制措施以及具有修饰的生物学性质的BoNT的开发(通常需要，例如，大规模筛选方法)。
[0099]本发明也涉及测定包含有生物学活性的BoNT的制备物中有生物学活性的BoNT的量的方法，包括 下列步骤:(a)使hiPS细胞来源的神经元细胞与所述的制备物的样品接触；及(b)通过检定样品的BoNT的生物学活性来测定存在于制备物中的有生物学活性的BoNT的量。
[0100]本发明也涉及hiPS细胞来源的神经元细胞用于检定组合物中BoNT活性的用途，如在本文别处特别说明。
[0101]在一方面，检定包括测定BoNT活性和/或有生物学活性的BoNT的存在或缺失。用于有生物学活性的BoNT的定性测定可用于，例如，旨在风险评定的应用，以便防止由BoNT导致的任何伤害，例如，作为在BoNT的生产过程期间或在药物或化妆品应用期间的安全性控制措施或用于防止基于BoNT的犯罪行为，诸如生物恐怖主义。
[0102]在另一方面，检定包括测定BoNT活性和/或有生物学活性的BoNT的量。有生物学活性的BoNT的定量测定可在BoNT制备或调整用于化妆品或药物应用的有生物学活性的BoNT的适当的剂量的过程期间使用。由此，该测定也可作为适当的药物或化妆产品的质量控制或制剂的手段有用。
[0103]本发明也涉及hiPS细胞来源的神经元细胞用于测定包含所述有生物学活性的BoNT的制备物中有生物学活性的BoNT的量的用途，如在本文别处特别说明。
[0104]本说明书以上引用的参考文献通过引用以它们的整个公开内容和此说明书中特别提及的公开内容并入本文。
[0105]【实验】
[0106]提供下列实施例，以便展示及进一步例证本发明的特定优选的实施方式和方面，且不被解释为限制其范围。
[0107]【实施例】[0108]【实施例1】
[0109]【Α.方法】
[0110]神经元细胞:由Cellular Dynamics Inc.(Madison, WI)供给冷冻的人iPS来源的神经元。将神经元根据Cellular Dynamics的使用说明解冻，及由锥虫蓝排除测定进行活细胞计数。除非另外指示，将细胞以40，000细胞/孔的密度接种于包被了 0.01 %聚-L-鸟氨酸(SIGMA)和 8.3 μ g/cm2 基质胶(BD Biosciences)的 96-孔皿(TPP, MidSci)，并在神经元培养基(补充B27及glutamax的Neurobasal,全部来自Invitrogen并由0)1供给)于37 C ,5% CO2中温育指定的成熟时间。在接种之后24h,完全更换培养基，然后每2~3天更换一半的培养基。
[0111]原代大鼠脊髓(RSC)细胞如之前描述(Pellett等人，2007和2010)制备，并以75，000细胞/孔的密度接种于 基质胶-包被的96-孔板。
[0112]肉毒杆菌神经毒素:从之前描述的肉毒梭菌(C.botulinum)株Hall A hyper,OkraB, Brazil C 和 Beluga E 制备纯肉毒神经毒素(BoNT)A, B, C 和 E(150kDa)和 BoNT/A 复合物(Malizio et al., (2000)Methods Mol Biol 145:27-39 ；Prabakaran et al., (2001)Toxicon39:1515-1531)，其中由Malizio等人(2000)的方法，用在硫酸铵沉淀之前向培养物添加0.2mg/ml的酵母RNA(SIGMA)的另外的步骤实施BoNT/C纯化。将毒素溶于磷酸盐缓冲液，PH7.4和40%甘油，并存储于_20°C直到使用。通过小鼠生物测定(HathewayCL(1988), supra ；Schantz EJ&Kautter DA(1978)J Assoc Off Anal Chem61:96-99)测定BoNT/A, /B, /C, /E和BoNT/A-复合制备物的活性，及比毒性是7 X IO7小鼠LD50单位/mg (BoNT/AI)，7.7X107LD50 单位 /mg (BoNT/AI 复合物)，I X IO8LD50 单位 /mg (BoNT/B)，1.1 X IO7LD50 单位 /mg (BoNT/C)，及 7.6 X IO7LD50 单位 /mg (BoNT/E)。
[0113]神经元毒性测定:除非另外说明，对于全部神经元毒性测定，在50 μ I的神经元培养基中使iPS神经元暴露于BoNT的系列稀释。如在结果中所示，在一些测定中将原代大鼠脊髓细胞用作对照细胞。以最少三个重复测试全部样品，且总是包括无毒素的阴性对照。在特定的曝露时间之后，移出毒素溶液，并使细胞在50 μ I的IXLDS样品缓冲剂(Invitrogen)中裂解。就SNAP-25，或VAMP2切割，由蛋白印迹分析细胞裂解物，如之前描述(Pellett等人，(2007)，见上；Pellett等人，(2010)，见上)。由光密度测定法，使用Foto/Analyst FX系统和TotalLab Quant软件(Fotodyne)定量切割的及未切割的条带。制备数据标绘图及通过使用PRISM软件导出EC5tl。
[0114]基质选择:为了选择最佳表面基质，将神经元接种于7个不同基质。基质由下列组成:包被了 1.0 μ g/cm2层粘连蛋白(PDL层粘连蛋白)或8.3 μ g/cm2基质胶(PDL基质胶)的聚-D-赖氨酸包被的板(BD bioscience)，包被了 0.01 %聚-L-鸟氨酸之后包被了 1.0 μ g/cm2层粘连蛋白(PL0层粘连蛋白)或8.3 μ g/cm2基质胶(PL0基质胶)的板，自BD Biosciences购买的PLO-层粘连蛋白包被的板(PL0-层粘连蛋白(BD))，来自BDBiosciences 的 PDL 包被的板(PDL (BD))，或 0.01 % PLO 包被的板(PLO(CDI))。使神经元成熟14天，并通过使神经元暴露于毒素的系列稀释48h来测定对BoNT/A的敏感性。使一些神经元维持6周，并如上再次测试。
[0115]受体表达分析:为受体表达分析，将iPS神经元以0.75ml的体积，以210，000细胞/孔的密度平铺在24-孔板上。在75μ IlXLDS样品缓冲剂(Invitrogen)中平铺之后4，7，10，14和21天分别自3孔收获细胞。细胞裂解物由用于SV2A，B和C同种型，突触结合蛋白I和II，SNAP-25, VAMP的表达的蛋白印迹进行分析，其中使用识别VAMP2的抗体或识别VAMP1，2和3同种型，及突触融合蛋白的抗体。将β-肌动蛋白用作装载对照，及将原代大鼠脊髓细胞用作阳性对照。SV2C抗体(Janz R&Sudhof TC(1999)Neuroscience94:1279-1290)由Roger Janz慷慨地提供。全部其他抗体来自Synaptic Systems (哥廷根，德国)。全部抗体识别人蛋白。
[0116]为了由实时qPCR进行mRNA分析，使iPS神经元的3个独立培养物分别维持指示的时间。使细胞在板上直接裂解，并通过使用RNeasy Mini试剂盒和RNA酶-游离的DNA酶套件(Qiagen，Valencia, CA)纯化RNA。为了阳性对照，购买人成年总脑 RNA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)。对于全部样品，通过使用SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒(Life Technologies, Carlsbad, CA)产生 cDNA。在
Light Cycler? 480II (Roche, Basel, Switzerland)上，使用 Taq Mail? Gene 表达
Master Mix和以下TaqMan人Gene表达测定来实施实时qPCR扩增:SNAP25 (Hs00938962_ml) ；STX1A (Hs00270282_ml) ；STXIB(HsO 1041 3 I5_ml) ；VAMPl(Hs0024991 1_ml) ；VAMP2 (Hs00360269_ml) ；VAMP3(Hs00922166_ml) ；SV2A(Hs00372069_ml)；SV2B(Hs00208178_ml) ；SV2C(Hs00392676_ml) ；SYT1(Hs00194572_ml) ；SYT2(Hs00980604_ml)和人GAPDH内源性对照引物组(全部自Life Technologies)。对全部样品实施AbsQuant/第2衍生分析，并经标准化为内源性GAPDH表达的Cp来将Cp值转化为相对倍数变化。在3个生物学重复内，为各基因计算平均值和标准偏差。为各基因实施技术性四重PCR反应。
[0117]活性-依赖性BoNT/Al摄取测定:将BoNT/Al稀释至55或275U/50 μ I的细胞-刺激(含有 2.2mM CaCl 和 5 6mM KCl,补充 B27 及 glutamax 的 Invitrogen 自定义 Neurobasal培养基)或神经元培养基的浓度，并添加到成熟4天的⑶I iPS神经元和RSC细胞。将细胞与毒素温育分别1，5，10和15min。关于阴性对照，将无毒素的相应培养基加入细胞。移出毒素，并将细胞立即用200 μ I的神经元培养基洗涤两次，随后在200 μ I的新鲜神经元培养基中温育24h。以一式四份样品收集。
[0118]为了确定用于5min之内BoNT/Al的活性-依赖性摄取的最小需要的毒素浓度，将毒素稀释至1.72~55U之间/50 μ I的细胞-刺激培养基的浓度。使4天成熟的iPS神经元暴露于毒素稀释5min，之后移出毒素，并用神经元培养基2次洗涤，和在神经元培养基中温育24h。以一式四份测试全部稀释。
[0119]抗体-保护分析:ΒοΝΤ/Α1特异性抗体根据Johnson等人，1993制备。通过使用2种不同方法分析iPS神经元中的BoNT/Al活性被中和抗体的抑制。为第I测定，将55U的BoNT/A I与连续稀释的抗体在细胞-刺激培养基中组合，并于37°C温育lh，以使抗体-毒素相互作用。使成熟4天的iPS神经元暴露于毒素-抗体混合物5分钟,之后移出毒素-抗体混合物，并用神经元培养基进行2次洗涤步骤，并在神经元培养基中温育24h。为第2测定，将1.5U的BoNT/A与抗体的系列稀释在神经元培养基中组合，并于37°C温育lh。使iPS神经元暴露于毒素-抗体混合物24h。与小鼠生物测定的比较使用与5~10U的BoNT/Al，在环境温度，在167 μ L的体积中预温育1.5h的抗体的系列稀释。将体积调整至500 μ 1，并每稀释注射进4只小鼠。[0120]【B.结果】
[0121]iPS神经元表达对于BoNT中毒重要的受体:为了测定是否人iPS来源的神经元可用于检测BoNT活性，分别由蛋白印迹和定量PCR(qPCR)分析对于BoNT细胞进入和催化性活性必需的受体和酶促靶的表达(图1)。蛋白印迹导致SV2A，SV2B (模糊条带)，突触结合蛋白1，突触融合蛋白，SNAP-25，VAMP2和β -肌动蛋白的信号，其在细胞平铺之后21天的时期未变化(图1Α)。尽管VAMP2用VAMP2特异性抗体检测，识别全部3种VAMP同种型的抗体导致无信号，表明VAMP2在iPS神经元中是主要VAMP同种型。将原代大鼠脊髓细胞裂解物用作用于抗体检测的阳性对照，且iPS神经元对比RSC细胞的条带中的不同强度可由于由抗体的差异识别或由于不同表达水平。由qPCR的相同的蛋白的mRNA水平的分析指示分析的全部蛋白的表达(图2B)包括SV2B和C同种型，突触结合蛋白2，及VAMPl和3，这些未由蛋白印迹检测到。但是，那些同种型的mRNA水平至少200倍少于由蛋白印迹检测的同种型的那些(SV2A，突触结合蛋白1，及VAMP2)。由此，qPCR数据确证蛋白印迹数据，并指示，iPS神经元主要表达SV2A，突触结合蛋白I和这些蛋白的VAMP2同种型，这与代表前脑神经兀的神经兀一致(Janz R&Sudhof TC(1999)Neuroscience94:1279-1290)。全部蛋白的表达水平贯穿研究时期未变化，表明细胞在平铺之后4天完全成熟，并保持稳定至少21天。
[0122]表面基质不影响用于BoNT/Al测定的细胞的质量:为了测定是否平铺基质影响对BoNT的敏感度，就BoNT/Al敏感度测试将神经元平铺在7个不同基质上。神经元附接于全部基质及在全部基质上成熟，形成轴突及树突的增加的网络。在有或无层粘连蛋白或基质胶的板上生长的细胞之间观察到显著形态学差异。在H)L(BD Biosciences)层粘连蛋白或基质胶板上或在PLO(Cellular Dynamics)层粘连蛋白或基质胶板上生长的细胞通常以单层生长，但主要沿板的周界形成具有自它们延伸的长轴突的一些聚集物。相反，在PLO或PDL板上生长的细胞保持在具有在细胞网络之间延伸的轴突及树突的细胞的单个单层。在PLO层粘连蛋白(BD Biosciences)上生长的细胞类似于在PLO或PDL板上生长的细胞。
[0123]在14天的成熟之后，使神经元暴露于BoNT/A的系列稀释，及细胞裂解物的蛋白印迹分析指示，对于全部测试的底物，SNAP-25切割几乎相同(图2)。检测限是0.05小鼠LD5tl单位，及在1.75和3.5U之间切割完全。EC50S为0.21~0.31。
[0124]这些数据指示，细胞可平铺在用于此测定的任何测试的表面基质上。全部以下实验在PLO-基质胶包被的板上实施。为了减少细胞聚集，使用TPP板(MidSci)，其具有更平的表面区域。此完全消除了孔周界周围的聚集。
[0125]4~14天的细胞成熟时间提供优良和敏感的BoNT/Al测试平台:为了测定是否细胞成熟时间影响iPS神经元的BoNT敏感度，就BoNT/Al敏感度，在平行平铺之后4和7天，使用相同的毒素稀释分析细胞。也平行测试原代大鼠脊髓细胞(RSC细胞)，以比较iPS神经元与RSC细胞(目前就BoNT检测描述的最敏感细胞)的敏感度(Pellet etal., 2007, supra ；Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods)。得到的数据一贯地显示成熟4或7天的细 胞的敏感度上无统计学地显著差异，EC50是~0.3U(图3)。此近似于以上对第14天细胞(图2)及对RSC细胞观察到的EC5(i。iPS神经元的剂量-应答曲线相比RSC细胞显著地更陡，及以1.75U达到100%切割，而在RSC细胞中以使用的毒素浓度未达到100%切割。此可能是由于iPS神经元的高纯度。由此，成熟4~14天的细胞提供用于BoNT/Al检测和定量的可再现和高度敏感的基于细胞的模型。此外，4个不同iPS细胞批的测试指示在BoNT/Al敏感度上无主要差异。
[0126]iPS神经元的敏感度随更长曝露时间而增加:通过使细胞暴露于系列BoNT/Al稀释及在毒素添加之后6，16，24和48h收获样品来检查iPS神经元中BoNT检测的时间依赖性。得到的数据一贯地指示，48h暴露产生最高敏感度，相比24h测定~3-倍数增加和相比16h测定~6-倍数增加(图4)。6h毒素暴露导致敏感度~130倍减小，约40单位的EC5(I。
[0127]iPS神经元相比RSC细胞具有更快的BoNT/Al摄取速度:通过使iPS神经元和RSC细胞平行暴露于82U的BoNT/Al及评定在2，4，6，8和IOh的SNAP-25切割来检查BoNT/Al到iPS神经元(相比RSC细胞)的摄取速度。将2种不同培养基用于区分活性-依赖性和活性-独立性毒素摄取，由于神经元活性已被报道导致BoNT的更快的摄取(Keller等人，(2004)，见上)。第I培养基是神经元培养基(NM)，及第2培养基是细胞-刺激培养基(CSM)，其是用以化学刺激神经元细胞活性的含有56mM KCl和2.2mM CaCl2的神经元培养基的修饰的版本。
[0128]iPS神经元相比RSC细胞导致显著地更早和更完全的SNAP-25切割。在iPS神经元中，在8h达到100%的SNAP-25切割，和在~4h达到50% SNAP-25切割(图5)。相反，RSC细胞在IOh之后达到仅~70~80% SNAP-25切割，及在6h观察到~50%的SNAP-25切割。对于任一 细胞类型，在神经元和细胞-刺激培养基之间未观察到差异，指示在时间范围内测试的神经元活性不影响BoNT摄取入细胞。这些数据指示，iPS神经元相比RSC细胞显著地更敏感于BoNT/A，且以更快的速度摄取毒素，尽管此测定不区分SNAP-25的更快的毒素摄取和更快的切割。
[0129]在活性-依赖性测定中，iPS神经元摄取BoNT/Al相比RSC细胞显著地更快:为了进一步检查是否iPS神经元以活性-依赖性样式摄取BoNT，使4天成熟的iPS神经元和RSC细胞在细胞-刺激培养基中分别暴露于55和275U的BoNT/Al。使细胞暴露于毒素1，5，10或15min,之后是完全毒素移出和在神经元培养基中温育24h,以使进行SNAP-25切割。在暴露于55U的BoNT/Al之后早至lmin，在iPS神经元中观察到显著SNAP-25切割(图6A)。在5min之后，约75%的SNAP-25被切割，且随着更久毒素暴露无显著变化，指示5分钟之内完成的摄取。暴露于275U在测试的全部曝露时间导致完全SNAP-25切割(图6A)。相反，RSC细胞暴露于55单位的BoNT/Al在达15min曝露时间之后未导致显著SNAP-25切割，且在暴露于275U至少IOmin后仅约30~40%的SNAP-25被切割(图6A)。此指示iPS神经元以活性-依赖性样式摄取BoNT/Al，且指示相比在RSC细胞中，此摄取显著地更有效和更快发生。
[0130]为了确认iPS神经元中的快速摄取是活性-依赖性的，使神经元在细胞-刺激培养基或神经元培养基中暴露于55U的BoNT/A经1，5或lOmin。在用细胞-刺激培养基处理的细胞中有显著地更多的SNAP-25切割，在Imin之后观察到50%的SNAP-25的切割和在5min后观察到70%切割(图6B)。相反，在神经元培养基中，在10分钟后仅约20%的SNAP-25被切割(图6B)。此指示BoNT/Al快速摄取进iPS神经元是活性-依赖性的。
[0131]为了测定由iPS神经元的活性-依赖性BoNT/Al摄取的浓度依赖性，使细胞在细胞-刺激培养基中暴露于1.7~55U的BoNT/Al经5min。在毒素移出之后，将细胞温育24h，以使SNAP-25切割发生。随增加毒素浓度观察到SNAP-25切割的浓度依赖性增加，以约30U发生50% SNAP-25切割(图6C)。
[0132] BoNT/A I特异性抗体保护iPS神经元免于被BoNT/Al进行SNAP-25切割:由抗体保护测定使用2种不同检定形式确认iPS BoNT测定的特异性。在第I测定中，使细胞暴露于毒素抗体混合物经24h，使用达到几乎完全SNAP-25切割所需要的最小量的毒素(1.5单位)。在第2测定中，使细胞在细胞-刺激培养基中暴露于55U BoNT/A和连续稀释的抗体的混合物5min，之后是毒素移出和温育24h。第I测定在抗体检测中产生了显著地更高敏感度。神经元用少至0.0025 μ I的抗体完全被保护免于SNAP-25的切割。降至0.000625 μ I的抗体还观察到显著的部分保护(图7Α)。当使用0.5U的BoNT/Al和48h暴露，在RSC细胞中测试抗体时，之前观察到相同的保护模式。由小鼠生物测定测试相同的抗体稀释指示相比小鼠生物测定，基于细胞的测定的至少~10倍更大敏感度，如之前数据也显示。+RSC测定已显示相比小鼠生物测定，在中和抗体检测中更敏感(Pellett，S.2007，见上)。第2 (活性-依赖性)测定是约10倍欠敏感，为全保护每50 μ I需要0.016 μ I的抗体，及用
0.004 μ I观察到部分保护(图7Β)。
[0133]此确认此测定的特异性，且指示iPS神经元提供用于中和抗体检测的优良的和高度敏感的测定，且指示用更少毒素更久暴露相比需要更多毒素但较短曝露时间的活性-依赖性测定更敏感。活性-依赖性测定对于一些目的有用，诸如可具有细胞毒性的或需要溶于可经时伤害神经元的溶剂的化合物或抗毒素的筛选。
[0134]在其天然的复合物中的BoNT/Al毒素的检测相比纯化的毒素的检测更敏感:在梭菌中作为与几种其他蛋白(非毒性非血细胞凝集素蛋白(NTNH)和在BoNT/A的情况中是血细胞凝集素(HA))的复合物表达 BoNT(Johnson EA&Bradshaw M(2001)Toxicon39:1703-1722的综述)。非-毒性复合蛋白被认为保护毒素免于消化道的降解pH (Oguma etal., (2000)Microbial Foodborne Diseases:Mechanisms of Pathogenesis and Toxin
Synthesis273-293)。BoNT/A 的最通常使用的医疗制备物(BOTOX?和 Dysportd)制备)由整个毒素复合物组成，尽管FDA现在已批准含有仅纯化的BoNT的较新制剂(Xeomin?制备)。为了测定是否在其天然的复合物中的BoNT/Al被检测为具有与iPS神经元中纯BoNT/Al等同灵敏度，使细胞平行暴露于等同量的BoNT/Al复合物或纯化的BoNT/A 10复合物由约24% BoNT/A I和76%其他非毒性关联的蛋白组成，如由光密度测定法测定(图8A)。纯化的BoNT/Al制备物和BoNT/Al复合物具有近似比活性(7X 107U/mg和7.3X107U/mg)。在直接比较中，复合物的组分中需要显著地少的毒素，以达到全SNAP-25切割(图SB)。此发现指示，在此测定中，复合物的非-毒性蛋白增加BoNT/lA活性，这可能是由于神经元培养基中的保护性效应。
[0135]iPS神经元是用于BoNT血清型B，C和E的检测的高度敏感的细胞模型=BoNT受体分析指示，iPS神经元表达SNARE蛋白和全部BoNT血清型的细胞进入所需要的受体(图1)。BoNT/A 及 /E 切割 SNAP-25，BoNT/B 切割 VAMP，及 BoNT/C 切割 SNAP-25 和突触融合蛋白(Humeau等人，(2000)Biochimie82:427~446)。为了测试神经元对不同血清型的敏感度，将BoNT/B，C或E的系列稀释平行加入iPS神经元或RSC细胞经48h，并为它们的相应神经元底物的切割而经蛋白印迹检定细胞裂解物。iPS神经元以相比RSC细胞等同或更大敏感度一贯地检测到全部BoNT血清型(图9)。iPS神经元和RSC细胞的EC5tl值是，对于BoNT/B 是 15.7IU 和 29.22U (图 9A)，对于 BoNT/C 是 0.4U 和 0.36U (图 9B)，及在 iPS 神经元中BoNT/E是1.79U(图9C)。RSC细胞中BoNT/E的EC5tl值无法用PRISM软件推导，但估计近似于iPS神经元的EC5tl值(图9C)。[0136]以上说明书中提及的全部出版物，专利，专利申请和登录号通过引用以它们的整体在本文合并。尽管本发明已关联特定实施方式描述，但应明白，要求保护的发明应不过度地被限制于该特定实施方式。事实上，本发明的描述的组合物和方法的各种修饰和变异对于本领域普通技术人员会是显而易见的，及旨在落入以下权利要求的范围之内。
【权利要求】
1.检定肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素(BoNT)活性的方法,包括:(a)使人诱导的多能干细胞(hiPS)来源的神经元细胞与包含BoNT的组合物接触；以及 (b)检定所述BoNT的生物学活性。
2.权利要求1的方法，其中所述BoNT具有选自下列的血清型:A，B,C，E及所述BoNT的修饰的变体。
3.权利要求1的方法，其中所述生物学活性选自:SNAP-25的切割，VAMP2的切割和神经递质释放。
4.权利要求1的方法，其中所述测定是定性测定。
5.权利要求1的方法，其中所述测定是定量测定。
6.权利要求1的方法,其中所述BoNT经纯化。
7.权利要求1的方法，其中所述BoNT在复合物中。
8.权利要求1的方法，还包括在接触所述hPS来源的神经元细胞之前,使所述BoNT与测试化合物接触的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述测试化合物是抗体。
10.权利要求9的方法，其中所述抗体是中和抗体。
11.权利要求10的方法，其中所述中和抗体在选自下列的样品中:纯化的抗体，血清和抗毒素。
12.检定肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神经毒素(BoNT)活性的方法,包括: (a)使人诱导的多能干(hiPS)细胞来源的神经元细胞与包含(i)BoNT及(ii)中和抗体的组合物接触；以及 (b)检定所述BoNT的生物学活性。
13.权利要求12的方法，其中所述BoNT具有选自下列的血清型:A，B，C，E及所述BoNT的修饰的变体。
14.权利要求12的方法，其中所述生物学活性选自:SNAP-25的切割，VAMP2的切割和神经递质释放。
15.权利要求12的方法，其中所述测定是定性测定。
16.权利要求12的方法，其中所述测定是定量测定。
17.权利要求12的方法，其中所述BoNT经纯化。
18.权利要求1的方法，其中所述BoNT在复合物中。
19.权利要求12的方法，其中所述中和抗体在选自下列的样品中:纯化的抗体，血清和抗毒素。
20.测定包含有生物学活性的BoNT的制备物中有生物学活性的BoNT的量的方法，所述方法包括下列步骤:(a)使hiPS细胞来源的神经元细胞与包含有生物学活性的BoNT的制备物的样品接触；以及 (b)通过检定所述样品的BoNT的生物学活性来测定存在于制备物中的有生物学活性的BoNT的量。
21.人诱导的多能干(hiPS)细胞来源的神经元细胞用于检定BoNT的活性的用途。
【文档编号】C12Q1/02GK103958747SQ201280053513
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月29日
【发明者】E·A·约翰逊, S·佩莱特, W·H·特普, R·C·M·怀特玛诗 申请人:塞尔斯纳普有限责任公司