肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志物和对egfr激酶抑制剂的响应的制作方法

肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志物和对egfr激酶抑制剂的响应的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于测定肿瘤的上皮和间充质表型以及预测肿瘤生长对使用EGFR抑制剂治疗为敏感还是抗性的方法。具体地，提供在至少一种选自下组的基因中的CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失作为肿瘤细胞间充质表型的标志物，用于确定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性，和/或鉴定很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的癌症患者：CLDN7、HOXC4、CP2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、ERBB2和C20orf55。提供在至少一种选自下组的基因中的CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失作为肿瘤细胞上皮表型的标志物：PCDH8、PEX5L、GALR1和ZEB2。
【专利说明】肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志 物和对EGFR激酶抑制剂的响应
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2011年9月30日提交的美国临时申请No. 61/542, 141的权益，其公 开内容通过提述完整并入本文。 发明领域
[0003] 本发明提供基于基因甲基化状态来预测对癌症疗法的响应的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 本发明针对用于诊断和治疗癌症患者的方法。具体地，本发明针对用于确定哪些 患者将最受益于使用表皮生长因子受体（EGFR)激酶抑制剂治疗的方法。
[0006] 癌症是大范围细胞恶性的通用名，其特征在于不受调控的生长、缺少分化、和侵入 局部组织并转移的能力。这些赘生性恶性以各种患病程度影响体内的每个组织和器官。
[0007] 在过去的数十年中已开发出多种治疗剂来治疗各种类型的癌症。最普遍使 用的抗癌剂类型包括：DNA烧化剂（例如环磷酰胺（cyclophosphamide)、异环磷酰胺 (ifosfamide))、抗代谢物（例如甲氨蝶呤、叶酸拮抗剂和5-氟尿啼陡、啼陡拮抗剂）、微管 破坏物（例如长春新碱（vincristine)、长春碱（vinblastine)、帕利他赛（paclitaxel))、 DNA嵌入剂（例如多柔比星（doxorubicin)、道诺霉素（daunomycin)、顺钼）、和激素疗法 (例如他莫昔芬（tamoxifen)、氟他胺（flutamide))。
[0008] 表皮生长因子受体（EGFR)家族包含4种紧密相关的受体（HER1/EGFR、HER2、HER3 和HER4)，其牵涉细胞应答如分化和增殖。EGFR激酶或其配体TGF α的过表达经常与许多 癌症有关，包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、头和颈癌、成胶质细胞 瘤和星形细胞瘤，且认为促进这些肿瘤的恶性生长。还发现EGFR基因（EGFRvIII)中的一 种特定的缺失突变增加细胞致瘤性。EGFR刺激的信号传导途径的活化促进潜在促进癌症 的多种过程，例如增殖、血管发生、细胞运动和侵入、降低的细胞凋亡和药物抗性诱导。增加 的HER1/EGFR表达经常与晚期疾病、转移和不良预后关联。例如，在NSCLC和胃癌中，已显 示增加的HER1/EGFR表达与高转移率、较差的肿瘤分化和增加的肿瘤增殖相关。
[0009] 已在NSCLC和成胶质细胞瘤中观察到激活受体的内在蛋白酪氨酸激酶活性和/ 或增加下游信号传导的突变。然而，突变作用作为赋予对EGF受体抑制剂例如厄洛替尼 (erlotinib) ( TARCEVA^ )或吉非替尼（gefitinib) (IRESSA?)的敏感性的原理机制一 直是有争议的。最近，已报告全长EGF受体的突变体形式预测对EGF受体酪氨酸激酶抑制 剂吉非替尼的响应性（Paez，J.G.等（2004) Science304:1497-1500 ;Lynch，I\J.等（2004) N. Engl. J. Med. 350:2129-2139)。细胞培养研究显示表达EGF受体的突变体形式的细胞系 (即H3255)对通过EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的生长抑制更敏感，且需要高得多 浓度的吉非替尼来抑制表达野生型EGF受体的肿瘤细胞系。这些观察表明EGF受体的特定 突变形式可能反映对EGF受体抑制剂的更大的敏感性但不鉴定完全不响应的表型。
[0010] 开发用作抗肿瘤剂的直接抑制EGFR的激酶活性的化合物，以及通过阻断EGFR活 化来降低EGFR激酶活性的抗体是大量研究努力的领域所在（de Bono J. S.和Rowinsky，E. K. (2002)TrendsinMol.Medicine8:S19_S26;Dancey，J·和 Sausville，E.A. (2003)Nature Rev. Drug Di scovery2:92-313)。数项研究已显示、披露或表明一些EGFR激酶抑制剂 在与某些其他抗癌剂或化疗剂或治疗组合使用时可能改进肿瘤细胞或赘生物杀伤（例 如 Herbst，R.S.等（2001)Expert0pin.Biol.Ther· 1:719-732 ;Solomon，B.等（2003) Int. J. Radi at. Oncol. Biol. Phys. 55 : 713-723 ；Krishnan, S.等(2003) Frontiers in Bioscience8，el_13 ;Grunwald，V.和 Hidalgo，M. (2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867 ; Seymour L. (2003) Current Op in. Investig. Drugs4 (6) :658-666 ; Khalil，Μ· Y.等 (2003)Expert Rev. Anticancer Ther. 3:367-380 ;Bulgaru，A. M.等（2003)Expert Rev. Anticancer Ther.3:269_279;Dancey，J·和 Sausville，E.A. (2003)Nature Rev.Drug Discovery2:92-313 ;Ciardiello，F.等（2000)Clin. Cancer Res. 6:2053-2063 ;和专利公开 文本 N〇:US2003/0157104)。
[0011] 厄洛替尼（例如厄洛替尼HC1，亦称为TARCEVA·v或0SI-774)是口服可用的 EGFR激酶的抑制剂。在体外，厄洛替尼已在许多人肿瘤细胞系（包括结直肠癌和乳腺癌 中）显示出针对EGFR激酶的实质抑制性活性（Moyer J. D.等（1997)Cancer Res. ^1:4838)， 而且临床前评估显示针对许多表达EGFR的人肿瘤异种移植物的活性（Pollack，V. A.等 (1999) T. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739)。最近，厄洛替尼在许多适应证的I期和II期 试验中显示有前景的活性，所述适应证包括头和颈癌（Soulieres，D.，等（2004)J. Clin. Oncol.益：77)、NSCLC(Perez-Soler R，等（2001)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.並：310a， 摘要 1235)、〇^((^3，]\1，等（2003)?1'〇。^111.5〇。.(：1丨11.011。〇1.益：1963，摘要 785)和 MBC(Winer，E.，等（2002)fceast Cancer Res. Treat.l^:5115a，摘要 445)。在 III 期试 验中，厄洛替尼单一疗法在患有晚期治疗不应性NSCLC的患者中显著延长存活、延迟疾病 进展和延迟肺癌有关症状的恶化（Shepherd, F.等（2004) J. Clin. Oncology,益:14S(Ju lyl5Supplement)，摘要7022)。尽管许多关于厄洛替尼的临床试验数据涉及其在NSCLC 中的使用，但来自l/π期研究的初步结果已显示厄洛替尼和卡培他滨（capecitabine)/ 厄洛替尼组合疗法在患有大范围的人实体肿瘤类型（包括CRC(0za，M.，等（2003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a，摘要 785)和 MBC(Jones, R. J.，等（2003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.益:45a，摘要180))的患者中的有前景的活性。2004年11月美国食品和药物管理 局（FDA)批准了在至少一种在前的化疗方案失败后，将厄洛替尼用于治疗患有局部晚期或 转移性的非小细胞肺癌（NSCLC)的患者。厄洛替尼是表皮生长因子受体（EGFR)类中在III 期临床试验中显示晚期NSCLC患者存活增加的唯一药物。
[0012] 抗赘生性药物理想地将选择性杀伤癌细胞，关于其对非恶性细胞的毒性有较宽的 治疗指标。它还会保留它对恶性细胞的功效，甚至在延长暴露于药物之后。不幸的是，没有 一种目前的化疗具有这类理想概况。相反，大多数具有非常窄的治疗指标。此外，暴露于稍 微亚致死浓度的化疗剂的癌细胞将非常经常地形成对这类药剂的抗性，而且还相当经常地 形成对几种其他抗赘生性药剂的交叉抗性。另外，对于任何给定的癌症类型，甚至在使用较 新的基因靶向疗法如EGFR激酶抑制剂时也经常不能预测哪个患者很可能应答特定治疗， 如此需要大量试验和错误来发现最有效的疗法，这对患者经常带来相当大的风险和不适。
[0013] 如此，需要更有效的用于赘生物形成和其他增殖性病症的治疗，和更有效的用于 确定哪些肿瘤将响应哪种治疗的手段。用于增强现有药物的治疗功效的策略牵涉其施用时 间安排中的变化，以及其与其他抗癌剂或生化调控剂的组合使用。组合疗法公知为是一种 相对于使用治疗有关剂量的单独每种药剂，能产生更大功效和减少的副反应的方法。在一 些情况中，药物组合的功效是加和性的（组合的功效约等于单独每种药物的效果之和），但 在其他情况中，该效果是协同性的（组合的功效大于单独给出的每种药物的效果之和）。
[0014] 靶物特异性的治疗办法如厄洛替尼一般与相比于常规细胞毒性剂的降低的毒 性有关，因此，有助于其在组合方案中使用。在厄洛替尼与贝伐单抗（Mininberg，E.D.， 等（2003)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.益:627a，摘要 2521)和吉西他滨（gemcitabine) (0四8(^丨(*，1'.，（2003)?1'〇(3^111.5〇(3.(：1丨11.011(3〇1.益：2233，摘要 895)组合的1/11期 研究中已观察到有前景的结果。在NSCLC III期试验中的最近数据显示与标准化疗组 合的一线厄洛替尼或吉非替尼未改进存活（Gatzemeier, U.，（2004)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.益:617(摘要 7010) ;Herbst，R.S·，（2004)Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:617(摘 要 7011);Giaccone，G·，等（2004)J.Clin.0ncol.益:777;Herbst，R·，等（2004)J.Clin. Oncol.益:785)。然而，胰腺癌III期试验显示一线厄洛替尼组合吉西他滨确实改进存活。
[0015] 几个小组已研究了潜在的生物标志物来预测患者对EGFR抑制剂的响应（参见例 W0 2004/063709, W0 2005/017493, W0 2004/111273, W02004/071572 ；US 2005/0019785 和US 2004/0132097)。一种这类生物标志物是上皮和间充质表型。在大多数癌症转移 期间，在肿瘤细胞中发生一项重要的变化，称为上皮-到-间充质转变（EMT) (Thiery，J. P. (2002)Nat.Rev. Cancer2:442-454 ；Savagner, P. (2001) Bioessays 23:912-923； Kang Y.和 Massague，J. (2004)Cell 118:277-279 ;Julien_Grille，S·，等 Cancer Research63:2172-2178 ;Bates，R.C.等（2003) Current Biologyl3:1721-1727 ;LuZ·，等 (2003)Cancer Cell. 4(6) :499-515)。紧密结合在一起且展现极性的上皮细胞产生间充质细 胞，其更宽松地保持在一起，展现出极性的降低且具有行进的能力。这些间充质细胞能传播 到原始肿瘤周围的组织中，侵入血管和淋巴管，并行进至新位置，在该处分裂并形成另外的 肿瘤。EMT不发生在健康细胞中，除了在胚胎发生期间以外。在正常情况下，TGF-β充当生 长抑制剂，然而在癌症转移期间，TGF- β开始促进EMT。
[0016] 上皮和间充质表型与特定的基因表达模式关联。例如，上皮表型在W02006101925 中显示为与Ε-|丐粘蛋白、Brk、γ-连环蛋白（catenin)、α -连环蛋白、角蛋白8、角蛋白18、 连接蛋白31、口]^1?^11；[1;[113、81:四七311111、核纤层蛋白（15和51'14的高表达水平有关，而间充 质表型与波形蛋白、纤连蛋白、微纤维蛋白-1、微纤维蛋白-2、胶原a2(IV)、胶原a2(V)、 L0XL1、巢蛋白（nidogen)、C11或f9、肌腱蛋白（tenascin)、Ν-|丐粘蛋白、胚EDB+纤连蛋白、 微管蛋白ct3和上皮形成素（epimorphin)的高表达水平有关。
[0017] 表观遗传学（epigenetics)是对由基础DNA序列中变化以外的机制导致的基因表 达或细胞表型中的可遗传变化的研究，因此名称为epi-(希腊语：在上、之上、外部）_遗传 学。这类变化的例子包括DNA甲基化和组蛋白修饰，两者均作用于调控基因表达而不改变 相关基因的序列。这些变化可以是体细胞可遗传的，其经由生物体剩余生命中的细胞分裂， 而且还可以传递到生物体的后续世代。然而，在生物体的基础DNA序列中没有变化；相反， 是非遗传因素导致生物体的基因有不同的行为或表达。
[0018] DNA甲基化是高等生物中正常生物发育和细胞分化中至关重要的部分。DNA甲基 化稳定地改变细胞中的基因表达模式，从而细胞能"记得其曾在何处";例如，在胚胎发育期 间程序化为胰岛的细胞在生物体的整个生命中在没有告诉它们必须保持岛的持续信号的 情况下保持为胰岛。另外，DNA甲基化抑制病毒基因和其他已掺入宿主基因组的有害元件 随时间的表达。DNA甲基化还形成染色质结构的基础，这使得细胞能从DNA的单个不可变序 列形成多细胞生命所需要的无数特征。DNA甲基化还在几乎所有类型的癌症的形成中起着 至关重要的作用。在胞嘧啶位置5的DNA甲基化具有降低基因表达的特定效果，且已在检 查的每个脊椎动物中发现。在成人体细胞组织中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸背 景中，而非CpG甲基化在胚胎干细胞中是普遍的。
[0019] "CpG"是"-C-磷酸-G-"的缩写，即胞嘧啶和鸟嘌呤由仅一个磷酸分开；磷酸将任 意两个核苷在DNA中连接在一起。"CpG"记法用于将此线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱 基对区分开来。CpG二核苷酸中的胞嘧啶可经甲基化以形成5-甲基胞嘧啶（5-mC)。在哺乳 动物中，将基因内的胞嘧啶甲基化能关闭该基因。将甲基基团添加到DNA的酶称为DNA甲 基转移酶。在哺乳动物中，70%至80%的CpG胞嘧啶是甲基化的。存在具有更高的CpG位 点浓度的基因组区域，称为CpG岛。这些"CpG岛"还具有高于预期的GC含量（即>50% )。 哺乳动物基因组中的许多基因具有与基因起始关联的CpG岛。因此，CpG岛的存在被用来 协助基因的预测和注释。CpG岛对于甲基化是顽固性的，这可能有助于维持开放的染色质构 型。另外，这能产生对转变突变的降低的易受损性，因此导致续存更高平衡密度的CpG。基 因启动子内CpG位点的甲基化能导致其沉默，这是在许多人癌症中发现的一种特征（例如 肿瘤抑制基因的沉默）。相反，CpG位点的低甲基化与癌细胞内癌基因的过表达有关。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明的一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括检测肿 瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG 位点处甲基化的存在指示所述肿瘤细胞具有上皮表型。在某些实施方案中，所述CpG位点 在PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。
[0022] 本发明的另一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括检测 表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处甲 基化的缺失指示所述肿瘤细胞具有上皮表型。在某些实施方案中，所述CpG位点在CLDN7、 H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞 是NSCLC细胞。
[0023] 本发明的另一个方面提供一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感 性的方法，包括检测样品肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的 存在或缺失，其中任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑 制剂的抑制敏感。在一个实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼（erlotinib)、西妥昔 单抗（cetuximab)或帕尼单抗（panitumumab)。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC 细胞。
[0024] 本发明的另一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患 者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点 处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为缺失，那么将 所述患者鉴定为很可能受益于使用所述EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，所述CpG位 点在CLDN7、H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述 EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。
[0025] 本发明的又一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患 者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点 处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为存在，那么将 所述患者鉴定为很可能受益于使用所述EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，如果所述患 者被鉴定为很可能会受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者，那么对所述患者施用治疗有效 量的EGFR抑制剂。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单 抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。
[0026] 本发明的另一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，包括检 测肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何 CpG位点处甲基化的缺失指示所述肿瘤细胞具有间充质表型。在某些实施方案中，所述CpG 位点在PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细 胞。
[0027] 本发明的另一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，包括检 测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处 甲基化的存在指示所述肿瘤细胞具有间充质表型。在某些实施方案中，所述CpG位点在 CLDN7、H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述肿 瘤细胞是NSCLC细胞。
[0028] 本发明的又一个方面提供一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感 性的方法，包括检测样品肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的 存在或缺失，其中任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示所述肿瘤生长对使用所述EGFR 抑制剂的抑制有抗性。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕 尼单抗。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。
[0029] 本发明的另一个方面提供一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感 性的方法，包括检测样品肿瘤细胞中表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的 存在或缺失，其中任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示所述肿瘤生长对使用所述EGFR 抑制剂（如例如厄洛替尼、吉非替尼（gefitinib)、拉帕替尼（lapatinib)、西妥昔单抗或帕 尼单抗）的抑制有抗性。在某些实施方案中，所述CpG位点在CLDN7、H0XC4、P2L3、TB⑶、 ESPRUGRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥 昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。
[0030] 本发明的另一个方面提供一种在患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者施用治 疗有效量的EGFR抑制剂，其中所述患者在施用所述EGFR抑制剂之前诊断为患有展现出在 表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处存在DNA甲基化的癌症。在某些实施方案中，所述 EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。
[0031] 本发明的另一个方面提供一种在患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者施用治 疗有效量的EGFR抑制剂，其中所述患者在施用所述EGFR抑制剂之前诊断为患有展现出在 表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处缺失DNA甲基化的癌症。在某些实施方案中，所述 EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。
[0032] 本发明的另一个方面提供一种为癌症患者选择疗法的方法，其包括在来自所述患 者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，且 当表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处检测为存在甲基化时，选出用于治疗的EGFR抑制 剂的步骤。在一个实施方案中，如果选择EGFR疗法，那么对患者施用治疗有效量的EGFR抑 制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述患者患有NSCLC。
[0033] 本发明的另一个方面提供一种为癌症患者选择疗法的方法，其包括在来自所述患 者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，且 当表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处检测为缺失甲基化时，选出用于治疗的EGFR抑制 剂的步骤。在一个实施方案中，如果选择EGFR疗法，那么对患者施用治疗有效量的EGFR抑 制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述患者患有NSCLC。 [0034] 在上文各方面的某些实施方案中，甲基化的存在或缺失通过焦磷酸测序检测。在 上文各方面的某些实施方案中，DNA从福尔马林固定、石蜡包埋的（FFPE)组织或新鲜冷冻 的组织分离。在一个实施方案中，在焦磷酸测序前将从组织样品分离的DNA预扩增。
[0035] 附图简述
[0036] 本专利或申请文件含有至少一幅以彩色制成的图。具有彩图的本专利或专利申请 公开文本的拷贝会在请求并支付必要费用后由专利局提供。
[0037] 图1。依照Fluidigm EMT基因表达集分类为上皮和间充质表型的NSCLC细胞系。
[0038] 图2。将细胞系表征为上皮样或间充质样的层次聚类。
[0039] 图3。分类为对EGFR抑制剂厄洛替尼敏感性、居中和抗性的上皮和间充质NSCLC 细胞系的DNA甲基化样式。
[0040] 图4。选择用于亚硫酸氢钠测序或qMSP和焦磷酸测序阵列设计的DMR的注释。
[0041] 图5A。对CLDN7启动子区的焦磷酸测序基于上皮样/间充质样表型区分42种 NSCLC细胞系。
[0042] 图5B。CLDN7mRNA的相对表达，其使用标准的Λ Ct方法在42种（η = 20种上皮 样，19种间充质样，3种居中）经DMS0处理和经5-氮杂-dC处理的NSCLC细胞系中测定。
[0043] 图6A-H。基于TaqMan的甲基化检测测定法，其特异于与基因（A)MST1R/R0N、（C) FAM110A、（E)CP2L3/GRHL2 和（G)ESRPl 有关的 DMR，以及（B)RON、（D)FAMllOA、（F)GRHL2 和 (H)ESRP1 的接受者操作特征（Receiver operating characteristic) (ROC)图。
[0044] 图7A-M。在厄洛替尼敏感性对厄洛替尼抗性NSCLC细胞系中的定量甲基化特 异性PCR测定法的接受者操作特征（R0C)曲线-PEX5L (A)、PCDH8 (B)、ZEB2 (C)、ME3 (D)、 MSTR1 (E)、STX2 (F)、H0XC5 (G)、C20orf55 (H)、ESRP1 (I)、BCAR3 (J)、CLDN7 (K)、NKX6. 2 (L)、 CP2L3 〇〇。
[0045] 图8A-B。显示82种NSCLC细胞系的上皮（E)或间充质（M)分类和厄洛替尼IC50 值的表。
[0046] 列表
[0047] 表1。与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸（CpG)。
[0048] 表2。与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸（CpG)。
[0049] 表3。与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸（CpG)，通过基因的染色体编号、 核苷酸位置和Entrez ID标识。
[0050] 表4。与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸（CpG)，通过基因的染色体编号、核 苷酸位置和Entrez ID标识。
[0051] 发明详述
[0052] 术语"癌症"在动物中指具有致癌细胞典型特征的细胞存在，所述特征如不受控的 增殖、永生化、转移潜力、快速生长和增殖速率、和某些特征性形态学特征。癌症细胞经常将 以肿瘤的形式，但这类细胞可在动物中单独存在，或可在血液流中作为独立细胞循环，如白 血病细胞。
[0053] 如本文中使用的，除非另外指示，"异常细胞生长"指独立于正常调控机制的细胞 生长（例如失去接触抑制）。这包括以下异常生长：（1)通过表达突变的酪氨酸激酶或过表 达受体酪氨酸激酶来增殖的肿瘤细胞（肿瘤）；（2)其他增殖性疾病的良性和恶性细胞，其 中发生异常酪氨酸激酶活化；(4)通过受体酪氨酸激酶增殖的任何肿瘤；(5)通过异常丝氨 酸/苏氨酸激酶活化增殖的任何肿瘤；和（6)其他增殖性疾病的良性和恶性细胞，其中发生 异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化。
[0054] 如本文中使用的，除非另外指示，术语"治疗/处理"意指在患者中逆转、减轻、抑 制进展、或预防（部分或完全地）肿瘤生长、肿瘤转移或其他致癌或赘生性细胞。如本文中 使用的，除非另外指示，术语"治疗/处理"指治疗/处理的行为。
[0055] 短语"一种治疗方法"或其等同体，在应用于例如癌症时指设计为减少或消除动物 中的癌症细胞数，或减轻癌症症状的作用规程或过程。" 一种治疗"癌症或另一种增殖性病 症的"方法"不必然指事实上将消除癌细胞或其他病症，事实上将减少细胞数或病症，或事 实上将减轻癌症或其他病症的症状。
[0056] 术语"治疗有效的药剂"意指将引发研究者、兽医、医学医师或其他临床医师寻求 的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的组合物。
[0057] 术语"治疗有效量"或"有效量"意指将引发研究者、兽医、医学医师或其他临床医 师寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的受试化合物或组合的量。
[0058] 术语"ErbBl"、"HERl"、"表皮生长因子受体"和"EGFR"和"EGFR激酶"在本文 中可交换使用且指 EGFR，如例如在 Carpenter 等 Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987) 中披露的，包括其天然存在的突变体形式（例如一种缺失突变体EGFR，如Humphrey等 PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的）。erbBl 指编码 EGFR 蛋白产物的基因。
[0059] 如本文中使用的，术语"EGFR激酶抑制剂"和"EGFR抑制剂"指本领域中目前已知 的或未来将鉴定的任何EGFR激酶抑制剂，其包括在对患者施用时导致与患者中EGF受体活 化有关的生物学活性（包括另外从EGFR天然配体对EGFR的结合得到的任何下游生物学效 应）受抑制的任何化学实体。这类EGFR激酶抑制剂包括能阻断EGFR活化或EGFR活化的 任何下游生物学效应（与患者中的癌症治疗有关）的任何药剂。这类抑制剂能通过直接结 合受体的胞内域并抑制其激酶活性起作用。或者，这类抑制剂能通过占据EGF受体的配体 结合位点或其部分起作用，由此使得受体为其天然配体不可达的，从而阻止或降低其正常 生物学活性。或者，这类抑制剂能通过调控EGFR多肽的二聚体化，或EGFR多肽与其他蛋白 质的相互作用，或增强EGFR的遍在蛋白化和胞吞降解起作用。EGFR激酶抑制剂包括但不限 于低分子量抑制剂、抗体或抗体片段、反义构建体、小抑制RNA(即通过dsRNA的RNA干扰； RNAi)和核酶。在一个优选的实施方案中，所述EGFR激酶抑制剂是特异性结合人EGFR的小 有机分子或抗体。
[0060] EGF受体功能的抑制剂已显示临床效用，而且描述最可能受益于治疗的患者亚组 的关键EGF受体信号传导途径的定义已成为一个重要的研究领域。已在NSCLC和成胶质细 胞瘤中观察到活化受体的内在蛋白质酪氨酸激酶活性和/或增加下游信号传导的突变。体 外和临床研究已显示wtEGF受体细胞系和肿瘤之间在其对EGF受体抑制的细胞应答中的相 当大的变异性，这部分已显示为源自磷脂酰肌醇3-激酶途径的EGF受体独立性的活化，导 致抗细胞凋亡丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的持续的磷酸化。PI3激酶活化的备选路径和由此 的EGF受体抑制剂不敏感性的分子决定物是一个积极的研究领域。例如强烈活化PI3激酶 途径的胰岛素样生长因子1受体（IGF-1受体）牵连对EGF抑制剂的细胞抗性。在介导对 选择性EGF受体抑制的不敏感性中经由PI3激酶途径也能施加存活信号的细胞-细胞和细 胞-粘着网络的作用不那么清楚且将假定为影响对EGF受体阻断物的细胞敏感性。在缺少 对胞外基质的粘附或细胞-细胞接触的情况下肿瘤细胞维持生长和存活信号的能力是重 要的，不仅在细胞迁移和转移的背景中，而且还在维持伤口样肿瘤环境中的细胞增殖和存 活中，其中胞外基质被重塑且细胞接触抑制减少。
[0061] 先前已开发了与NSCLC细胞系对厄洛替尼的体外敏感性相关的EMT基因表达签 名。（Yauch等，2005, Clin Cancer Resll, 8686-8698)。基于该项工作开发了与上皮和间充 质表型有关的基于fluidigm的EMT表达签名（图1)。
[0062] 本发明部分基于使用整合的基因组办法，其将基因表达分析与全基因组甲基化概 况分析组合以显示甲基化生物标志物能对癌症（如NSCLC)中的上皮和间充质表型分类，从 而证明DNA甲基化模式中的基因组范围内的差异与癌症的独特的生物学和临床相关子集 有关。使用本文中描述的方法将甲基化模式用于癌症的表型子集分类是有利的，因为它需 要比更传统的基于DNA和RNA的分析方法更少量的测试组织。该特征在组织有限的情况下 分析临床样品时特别有用。
[0063] 在开发预测性生物标志物中的一项主要挑战是需要建立用于前景评估的有力的 "截点（cut-point)"。这对于基于蛋白质的测定法如免疫组织化学尤其成问题。尽管受 到广泛使用，但免疫组织化学受制于许多限制其在预测性生物标志物开发中使用的技术挑 战。这些限制包括抗体特异性和灵敏性、表位可获性和稳定性、以及不同病理学家对数据解 译的内在主观性（24、25)。能利用PCR的动态范围和特异性的分子测定法则是更期望的。 然而，基于PCR的测定法也存在限制：RNA是高度不稳定的且需要预先设定的截留点。突变 检测测定法，尽管是潜在二元性的，但受到高流行性突变热点和靶序列的可获性的限制。如 实施例中显示的，基于PCR的甲基化测定法潜在地解决了这些问题中的许多个，因为它们 具有突变测定法的许多特性，包括广泛的动态范围和基本二元性的读出（具有与突变测定 法类似的灵敏性），但由于CpG甲基化状态的局部相关行为，用于测定法设计的靶区域可以 是相当大的。更重要的是，DNA甲基化可用于以差不多与过去使用基因表达相同的方式来 推断肿瘤的生物学状态。
[0064] 本文实施例中呈现的数据显示，在细胞培养中或在体内生长的含有野生型EGFR 的肿瘤细胞如NSCLC或胰腺癌细胞，根据其是否经历上皮到间充质转变（EMT)，显示对EGFR 激酶抑制剂的抑制的一定范围的敏感性。在EMT之前，肿瘤细胞对于EGFR激酶抑制剂如厄 洛替尼HC1 (Tarceva? )的抑制非常敏感,而经历EMT的肿瘤细胞对于这类化合物的抑制 要不敏感得多。数据指示EMT可能是决定肿瘤对EGFR激酶抑制剂的敏感性水平的一般性 生物学转换。本文中显示，肿瘤对EGFR激酶抑制剂的敏感性水平可通过测定由肿瘤细胞表 达的、EMT事件之前或之后的细胞特征性的生物标志物的水平来评估。例如，上皮生物标志 物如E-钙粘蛋白的高肿瘤细胞表达水平（指示细胞尚未经历EMT)与对EGFR激酶抑制剂 的高敏感性相关。相反，间充质生物标志物如波形蛋白或纤连蛋白的高肿瘤细胞表达水平 (指示细胞已经历EMT)与对EGFR激酶抑制剂的低敏感性相关。如此，这些观察能形成用于 预测EGFR激酶抑制剂对肿瘤生长的影响的诊断方法的基础，并给予肿瘤学家一项协助他 们来选择针对其患者的最适宜治疗的工具。
[0065] 如实施例中描述的，基于DNA甲基化模式，癌症可区分成为上皮样（EL)和间充质 样（ML)肿瘤。间充质表型（或已经历EMT的肿瘤细胞）与表1和表3中显示的特定基因 的甲基化有关。因此，本发明提供一种确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，包括检测 肿瘤细胞中表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG 位点处的甲基化指示所述肿瘤细胞具有间充质表型。相反，表1或表3中鉴定的任一个CpG 位点处DNA甲基化的缺失指示所述肿瘤具有上皮表型。
[0066] 在一个具体的实施方案中，确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法包括检测 以下一种或多种基因中CpG位点处甲基化的存在或缺失：CLDN7(密蛋白（claudin)-7)、 H0XC4 (同源框C4)、CP2L3 (grainyhead样3)、STX2 (突触融合蛋白2)、RON (巨噬细胞 刺激性1受体）、TBCD(微管蛋白特异性分子伴侣D)、ESRP1 (上皮剪接调控蛋白1)、 GRHL2(grainyhead样2)、ERBB2和C20orf55(第20号染色体开读框55)基因，其中任一个 CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。相反，任一个CpG位点处DNA甲基 化的缺失指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，所述方法包括在以下一 种或多种基因中检测CpG位点处的甲基化：CLDN7、H0XC4、CP2L3、STX2、RON、TBCD、ESRP1、 GRHL2、ERBB2和C20orf55基因，其中任一个CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间 充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的2种基因中CpG位点处甲基 化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中 的3种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施 方案中，检测出表1或表3中的4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间 充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的5种基因中CpG位点处甲基 化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出CLDN7、H0XC4、 CP2L3、STX2、R0N、TBCD、ESRP1、GRHL2 和 C20orf55 基因中的 2、3 或 4、5、6、7、8 或所有 9 种 基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在另一个实施方案中，检 测出CLDN7、R0N、ESRP1和GRHL2中的2、3或4种中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤 具有间充质表型。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、R0N、ESRP1和GRHL2的所有4种基 因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。
[0067] 另外，本发明提供一种预测肿瘤生长对通过EGFR抑制剂的抑制的敏感性的方法， 包括在取自肿瘤的样品细胞中检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存 在或缺失，其中在任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制 剂的抑制是抗性的。相反，在任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示肿瘤生长对于通过 EGFR抑制剂的抑制是敏感的（即响应的）。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中 的2种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是 抗性的。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的3种基因中CpG位点处甲基化 的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案 中，检测出表1或表3中的4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用 EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的5种基因 中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在 一个具体的实施方案中，检测出 CLDN7、H0XC4、CP2L3、STX2、RON、TBCD、ESRP1、GRHL2、ERBB2 和C20orf55基因中的2、3或4、5、6、7、8或所有9种基因中CpG位点处甲基化的存在指示 所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制为抗性的。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、 R0N、ESRP1和GRHL2中的2、3或4种中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使 用EGFR抑制剂的抑制为抗性的。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、R0N、ESRP1和GRHL2 的所有4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑 制为抗性的。
[0068] 本发明的另一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患 者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点 处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为缺失，那么将 所述患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。相反，在任一个CpG位点处DNA甲基 化的存在指示患者不太可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测 表1或表3中的2种基因中CpG位点处的甲基化为缺失指示患者很可能受益于使用EGFR抑 制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表1或表3中的3种基因中CpG位点处的甲基 化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检 测表1或表3中的4种基因中CpG位点处的甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用 EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表1或表3中的5种基因中CpG位点处 的甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方 案中，检测 CLDN7、H0XC4、CP2L3、STX2、R0N、TBCD、ESRP1、GRHL2、ERBB2 和 C20orf55 基因中 的2、3或4、5、6、7、8或所有9种基因中CpG位点处甲基化为缺失指示所述患者很可能受益 于使用EGFR抑制剂治疗。在另一个实施方案中，检测CLDN7、R0N、ESRP1和GRHL2中的2、3 或4种中CpG位点处甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在 另一个实施方案中，检测CLDN7、R0N、ESRP1和GRHL2的所有4种中CpG位点处甲基化为缺 失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，对视为很可能受 益于使用EGFR抑制剂治疗的患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
[0069] 如实施例中描述的，肿瘤细胞中的上皮表型与表2和表4中显示的特定基因的甲 基化有关。因此，本发明提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括在肿瘤细胞 中检测表2或表4中鉴定的任一个胞嘧啶核苷酸（CpG位点）处DNA甲基化的存在或缺失， 其中任一个胞嘧啶核苷酸（CpG位点）处甲基化的存在指示所述肿瘤细胞具有上皮表型。相 反，本发明还提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括在肿瘤细胞中检测表2 或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中CpG位点处甲基化的缺 失指示所述肿瘤具有间充质表型。
[0070] 在一个具体的实施方案中，所述方法包括在以下一种或多种基因中的CpG位点处 检测甲基化的存在或缺失：PCDH8(原钙粘蛋白（pr〇t〇Cadherin)8)、PEX5L(过氧化物酶体 生源因子5样）、GALR1(神经节肽（galanin)受体1)、ZEB2(锌指E盒结合同源框2)和 ME3(苹果酸酶3)基因，其中CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤具有上皮表型。在一个具体 的实施方案中，所述方法包括检测ZEB2基因中的CpG位点处甲基化的存在或缺失，其中CpG 位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或 表4中的2种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体 的实施方案中，检测表2或表4中的3种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤 具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的4种基因中CpG位点处的 甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中 的5种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施 方案中，检测K：DH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因的每一种中CpG位点处的甲基化为存在指示 所述肿瘤具有上皮表型。
[0071] 另外，本发明提供一种预测肿瘤生长对通过EGFR抑制剂的抑制的敏感性的方法， 包括在取自肿瘤的样品细胞中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存 在或缺失，其中在任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制 剂的抑制是敏感的。相反，在任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示肿瘤生长对于通过 EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，所述方法包括检测PCDH8、PEX5L、 GALR1或ZEB2基因的一种或多种中CpG位点的甲基化，其中在任一个CpG位点处甲基化的 存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，所述 方法包括检测ZEB2基因中CpG位点处的甲基化，其中ZEB2基因中CpG位点处甲基化的存 在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表 2或表4中的2种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑 制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的3种基因中CpG位 点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具 体的实施方案中，检测表2或表4中的4种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿 瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4 中的5种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑 制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测K：DH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因的每一种中 CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。
[0072] 本发明的另一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患 者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点 处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为存在，那么将 所述患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。相反，任一个CpG位点处的DNA甲基 化的缺失指示患者不太可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测 表2或表4中的2种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用 EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的3种基因中CpG位点处 的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方 案中，检测表2或表4中的4种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益 于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的5种基因中CpG 位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的 实施方案中，检测PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2中的2、3或4种中CpG位点处的甲基化为存 在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在另一个实施方案中，检测ZEB2中 CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在某些实施 方案中，对视为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
[0073] 本发明的另一个方面提供一种治疗癌症患者的方法，使用本文中描述的DNA甲基 化概况分析先前已鉴定所述癌症患者是很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者，所述 方法包括对该患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
[0074] 本发明的另一个方面提供一种基于本文中描述的DNA甲基化概况分析方法为癌 症患者选择疗法的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在来自所述患者的癌症的样品 中检测表2或表4中鉴定的CpG位点之一处甲基化的存在或缺失，并且当表2或表4中鉴 定的CpG位点之一处检测为存在甲基化时，选出EGFR抑制剂用于疗法。在另一个实施方案 中，所述方法包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的CpG位点之一 处DNA甲基化的存在或缺失，并且当表1或表3中鉴定的CpG位点之一处检测为缺失甲基 化时，选出EGFR抑制剂用于疗法。在某些实施方案中，如果选择EGFR抑制剂疗法，那么对 患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。
[0075] 医学领域，特别是关于诊断性测试的应用和治疗学治疗的医学领域中的技术人员 将认可生物学系统可展现出变异性且并非总是完全可预测的，如此许多较好的诊断性测试 或治疗学有时是无效的。如此，最终由主治医师基于测试结果、患者状况和病史、及其自身 经验的判断来确定个体患者的最适宜的治疗过程。甚至有以下情况，例如，当基于来自诊断 测试或来自其他标准的数据肿瘤未预测为对EGFR激酶抑制剂特别敏感时，医师会选择用 EGFR抑制剂来治疗患者，尤其是在如果所有或大多数其他明显的治疗选项已经失败，或者 预期在与另一种治疗一起施用时有一些协同性的情况下。与癌症治疗中使用的许多其他抗 癌药物如更传统的化疗剂或细胞毒性剂相比，EGFR抑制剂作为一类相对耐受较好的药物的 事实使其成为更可行的选择。
[0076] 因此，本发明提供一种预测肿瘤细胞生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性 的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种（或一组）上皮生物标志物的DNA甲基化水平； 和预测肿瘤细胞生长对EGFR抑制剂所致抑制的敏感性，其中所有肿瘤细胞上皮生物标志 物的同时较高的DNA甲基化水平与对通过EGFR抑制剂的抑制的高度敏感性相关。在该方 法的一个具体的实施方案中，所述上皮生物标志物包括基因 POTH8、PEX5L、GALR1、ZEB2和 ME3,其中两种肿瘤细胞上皮生物标志物的同时的高表达水平与对EGFR激酶抑制剂所致抑 制的高度敏感性相关。
[0077] 本发明还提供一种预测肿瘤细胞生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方 法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种（或一组）间充质生物标志物的水平；和预测肿瘤细 胞生长对EGFR抑制剂所致抑制的敏感性，其中所有肿瘤细胞间充质生物标志物的同时的 高水平与对通过EGFR抑制剂的抑制的抗性相关。在该方法的一个具体的实施方案中，所述 间充质生物标志物包括基因 CLDN7、H0XC4、CP2L3、TBCD、ESRP1、GRHL2和C20orf55,其中至 少两种肿瘤细胞间充质生物标志物的同时的高DNA甲基化水平与对通过EGFR抑制剂的抑 制的抗性相关。
[0078] 本发明还提供一种预测癌症患者是否患有会对使用EGFR激酶抑制剂的治疗有效 响应的肿瘤的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种（或一组）上皮生物标志物PCDH8、 PEX5L、GALR1、ZEB2和ME3的DNA甲基化水平；和预测肿瘤是否会有效响应使用EGFR抑制 剂的治疗，其中所有肿瘤细胞上皮生物标志物的同时的高表达水平与会有效响应使用EGFR 抑制剂的治疗的肿瘤相关。
[0079] 本发明还提供一种预测癌症患者是否患有会对使用EGFR激酶抑制剂的治疗有 效响应的肿瘤的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种（或一组）间充质生物标志物 CLDN7、H0XC4、CP2L3、TBCD、ESRP1、GRHL2和C20orf55的水平；和预测肿瘤是否会有效响应 使用EGFR抑制剂的治疗，其中所有这类肿瘤细胞间充质生物标志物的高DNA甲基化水平与 对使用EGFR抑制剂的治疗有抗性的肿瘤相关。
[0080] 在本文所述方法中，肿瘤细胞通常将来自诊断为患有癌症、癌症前期疾患、或异常 细胞生长的另一种形式，并且需要治疗的患者。所述癌症可以是肺癌（例如非小细胞肺癌 (NSCLC))、胰腺癌、头和颈癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌或下文中描述的多种其他癌症 中的任一种。所述癌症是已知潜在可用EGFR抑制剂治疗的癌症。肿瘤细胞可获自患者痰、 唾液、血液、尿、粪、脑脊髓液，或直接获自肿瘤，例如通过细针穿刺（fine needle aspirate)。
[0081] 可通过许多方法学来分析样品中各种生物标志物的存在和/或水平/量，其中许 多是本领域中已知且熟练技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学（"IHC")、West ern 印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选（"FACS"）、 MassARRAY、蛋白组学、基于血液的定量测定法（如例如血清ELISA)、生化酶活性测定法、原 位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应（"PCR"）（包括定 量实时PCR( "qRT-PCR"）和其他扩增类型检测方法，如例如分支的DNA、SISBA、TMA等）、 RNA_Seq、FISH、微阵列分析、基因表达概况分析、和/或基因表达系列分析（"SAGE")，以及 可通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析实施的许多种测定法中的任一种。用于评估基因和 基因产物状态的典型方案见于例如Ausubel等编，1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units2 (Northern Blotting), 4(Southern Blotting), 15(Immunoblotting)和 18 (PCR Analysis)。还可使用多重免疫测定法如那些可从Rules Based Medicine or Meso ScaleDiscovery( "MSD"）获得的。
[0082] 用于评估DNA甲基化的方法是公知的。例如，Laird(2010)Nature Reviews Geneticsl 1:191-203提供关于DNA甲基化分析的综述。在一些实施方案中，评估甲基化的 方法包括将基因组DNA随机剪切或随机片段化，用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶切 害IJDNA，随后选择性鉴定和/或分析切割或未切割的DNA。选择性鉴定可包括例如，分离切割 和未切割的DNA (例如通过大小）并量化感兴趣的切割或未切割的序列。参见例如，美国专 利No. 7, 186, 512。在一些实施方案中，所述方法可涵盖在限制酶消化后扩增完整的DNA，由 此仅扩增在扩增区域中未被限制酶切割的DNA。参见例如，美国专利申请No. 10/971,986 ; 11/071，013;和10/971，339。在一些实施方案中，扩增可使用基因特异性的引物进行。或 者，可将接头添加到随机片段化的DNA的端，所述DNA可用甲基化依赖性或甲基化敏感性限 制酶消化，完整DNA可使用与接头序列杂交的引物扩增。在一些实施方案中，可实施第二步 骤来测定DNA的扩增池中特定基因的存在、缺失或量。在一些实施方案中，使用实时定量 PCR来扩增DNA。
[0083] 在一些实施方案中，所述方法包括量化基因组DNA群体内的靶序列中的平均甲基 化密度。在一些实施方案中，所述方法包括使基因组DNA与甲基化依赖性限制酶或甲基化 敏感性限制酶在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件 下接触；量化基因座的完整拷贝；并将扩增产物的量与代表对照DNA甲基化的量的对照值 比较，由此相比于对照DNA的甲基化密度量化基因座中的平均甲基化密度。
[0084] DNA基因座的甲基化的量可通过以下来测定：提供包含该基因座的基因组DNA样 品，将DNA用甲基化敏感或甲基化依赖性的限制酶切割，然后在感兴趣的DNA基因座处量化 完整DNA的量或量化切割DNA的量。完整或切割DNA的量将依赖于含有该基因座的基因 组DNA的起始量，基因座中甲基化的量，和在基因组DNA中甲基化的基因座中核苷酸的数目 (即部分）。DNA基因座中的甲基化量可通过将完整DNA或切割DNA的量与在类似处理的 DNA样品中代表完整DNA或切割DNA的量的对照值比较来测定。对照值能代表已知或预测 数目的甲基化核苷酸。或者，对照值能代表来自另一种细胞（例如正常、未患病的）中的同 一基因座或第二基因座的完整或切割DNA的量。
[0085] 通过在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件 下使用甲基化敏感性或甲基化依赖性限制酶，随后量化剩余的完整拷贝，并将该量与对照 比较，能测定基因座的平均甲基化密度。如果使甲基化敏感性限制酶与DNA基因座的拷贝 在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件下接触，那么剩 余的完整DNA将与甲基化密度直接成比例，如此可与对照比较来测定样品中基因座的相对 甲基化密度。类似地，如果使甲基化依赖性限制酶与DNA基因座的拷贝在允许基因座中至 少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件下接触，那么剩余的完整DNA将与 甲基化密度成反比，如此可与对照比较来测定样品中基因座的相对甲基化密度。这类测定 法披露在例如美国专利申请Ser. No. 10/971，986中。
[0086] 在一些实施方案中，可使用定量扩增方法（例如定量PCR或定量线性扩增）来 量化限制性消化后由扩增引物侧接的基因座中完整DNA的量。定量扩增的方法披露于 例如美国专利 No. 6, 180, 349 ;6, 033, 854 ;和 5, 972, 602,以及例如 Gibson 等，Genome Research6:995_1001(1996) ;DeGraves 等，Biotechniques34(l):106_10, 112-5(2003); Deiman B 等，Mol Biotechnol. 20 (2) : 163-79 (2002)。
[0087] 用于检测DNA甲基化的其他方法可牵涉在用亚硫酸氢盐处理DNA之前和之后的基 因组测序。参见例如，Frommer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1827-1831 (1992)。当将亚 硫酸氢钠与DNA接触时，未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不被修饰。
[0088] 在一些实施方案中，将从亚硫酸氢盐转化后的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化 用于检测 DNA 甲基化。参见例如，Sadri&Hornsby，Nucl. Acids Res. 24:5058-5059(1996); Xiong&Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534(1997)。
[0089] 在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用MethyLight测定法来检测DNA 甲基化（参见 Eads 等，Cancer Res. 59:2302-2306(1999))。简言之，在 MethyLight 方法中， 基因组DNA在亚硫酸氢钠反应中转化（亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿 嘧啶）。然后，实施感兴趣DNA序列的扩增，其使用与CpG二核苷酸杂交的PCR引物。通过 使用仅与得自未甲基化DNA的亚硫酸氢盐转化的序列（或者与未转化的甲基化序列）杂交 的引物，扩增可指示引物杂交之处序列的甲基化状态。类似地，扩增产物可使用一种探针检 测，该探针特异性结合得自未甲基化（或甲基化）DNA的亚硫酸氢盐处理的序列。如果期望 的话，可将两种引物和探针均用于检测甲基化状态。如此，用于与MethyLight使用的试剂 盒可包括亚硫酸氢钠以及在经亚硫酸氢盐处理的甲基化和未甲基化DNA之间区分的引物 或可检测标记的探针（包括但不限于Taqman或分子信标探针）。其他试剂盒组分可包括， 例如DNA扩增所需的试剂，包括但不限于PCR缓冲液、脱氧核苷酸；和热稳定的聚合酶。
[0090] 在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用Ms-SNuPE (甲基化敏感性单核 苷酸引物延伸，Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension)来检测DNA 甲基化（参见 Gonzalgo&Jones Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997))。Ms-SNuPE 技术 是用于基于DNA的亚硫酸氢盐处理来评估特定CpG位点处的甲基化差异，接着是单核苷酸 引物延伸的定量方法。简言之，使基因组DNA与亚硫酸氢钠反应来将未甲基化的胞嘧啶转 化成尿嘧啶，而留下5-甲基胞嘧啶不变。然后使用特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的PCR 引物来实施对期望靶序列的扩增，将所得产物分离并用作在感兴趣的CpG位点处甲基化分 析的模板。
[0091] 在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用甲基化特异性PCR( "MSP"）反 应来检测DNA甲基化。MSP测定法必须首先通过亚硫酸氢钠来修饰DNA，将所有未甲基化 的而非甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后使用特异于甲基化相对于未甲基化DNA的引物 进行扩增。参见，Herman 等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA93:9821-9826, (1996);美国专利 No. 5, 786, 146。在一些实施方案中，DNA甲基化通过QIAGEN PyroMark CpG Assay预设计的 焦磷酸测序DNA甲基化测定法检测。
[0092] 在一些实施方案中，使用高通量DNA甲基化分析来测定细胞甲基化状态以确定对 EGFR抑制剂的敏感性。简言之，从细胞或组织样品（例如肿瘤样品或血液样品）分离基因 组DNA并在亚硫酸氢钠反应中转化（亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿 嘧啶），其使用本领域中的标准测定法。将经亚硫酸氢盐转化的DNA产物扩增、片段化并与 含有来自整个基因组的CpG位点的阵列杂交，其使用本领域中的标准测定法。杂交后，将 阵列成像，并使用本领域中的标准测定法处理用于分析DNA甲基化状态。在一些实施方案 中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组 织样品是新鲜冷冻的组织。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的 DNA预扩增。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增， 其通过使用 Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR 系统和 Platinum Taq。在一些 实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前使用基于Taqman的测定法将从组织样品分离的DNA预 扩增。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用ZymoEZDNA甲基化试剂盒进行。在 一些实施方案中，扩增经亚硫酸氢盐转化的DNA并与阵列杂交，其使用Illumina Infinium HumanMethylation450Beadchip 试剂盒。在一些实施方案中，将阵列在 Illumina iScan Reader上成像。在一些实施方案中，将图像用GenomeStudio软件甲基化模块处理。在一些 实施方案中，使用Bioconductor lumi软件程序包来分析甲基化数据。参见Du等，Bioinfo rmatics, 24(13):1547-1548(2008)。
[0093] 在一些实施方案中，使用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)鉴定DNA甲基化位点以确定对 EGFR抑制剂的敏感性。简言之，从细胞或组织样品（例如肿瘤样品或血液样品）分离基因 组DNA并在亚硫酸氢钠反应中转化（该亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿 嘧啶），其使用本领域中的标准测定法。将经亚硫酸氢盐转化的DNA产物用设计为特异于 经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物（例如亚硫酸氢盐特异性引物）扩增并连接到载体中用于 转化到宿主细胞中，其使用本领域中的标准测定法。在选出含有PCR扩增的、经亚硫酸氢盐 转化的、感兴趣的DNA产物的宿主细胞之后，分离DNA产物并测序以确定甲基化的位点，其 使用本领域中的标准测定法。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包 埋的（FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组织样品是FFPE组织，其已经过处理用于IHC 分析；例如针对基因表达。在一些实施方案中，所述组织样品是通过IHC显示极少或无基因 表达的FFPE组织。在一些实施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。在一些实施方案 中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，在亚硫酸氢 盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增，其使用Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR系统和Platinum Taq。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前使用基于Taqman 的测定法将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用 Zymo EZ DNA甲基化金试剂盒进行。在一些实施方案中，设计为特异于经亚硫酸氢盐转化 的DNA的引物是使用Applied Biosystems Methyl Primer Express软件设计的。在一些实 施方案中，所述亚硫酸氢盐转化的DNA产物是使用Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR System和Platinum Taq PCR扩增的。在进一步的实施方案中，PCR扩增的、经亚硫 酸氢盐转化的DNA产物使用Invitrogen Τ0Ρ0 TA克隆试剂盒连接到载体中。在一些实施方 案中，宿主细胞是细菌。在一些实施方案中，分离的PCR扩增的、经亚硫酸氢盐转化的、感兴 趣的DNA产物使用Applied Biosystems3730xlDNA Analyzer测序。在一些实施方案中，设 计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物是使用Qiagen PyroMark Assay Design软件设 计的。在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐转化的DNA产物是使用Invitrogen Superscript III One-St印RT-PCR System和Platinum Taq PCR扩增的。在进一步的实施方案中，PCR扩 增的、经亚硫酸氢盐转化的DNA产物使用Qiagen Pyromark Q24测序并用Qiagen PyroMark 软件分析。
[0094] 在一些实施方案中，使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)来鉴定DNA甲基化位点以 确定对EGFR抑制剂的敏感性。简言之，从细胞或组织样品分离基因组DNA并在亚硫酸氢钠 反应中转化（该亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶），其使用本领域 中的标准测定法。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的（FFPE) 组织。在一些实施方案中，所述组织样品是FFPE组织，其已经过处理用于IHC分析。在一 些实施方案中，所述组织样品是通过IHC显示极少或无基因表达的FFPE组织。在一些实 施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。经亚硫酸氢盐转化的DNA产物是使用设计为 特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物（例如定量甲基化特异性PCR引物）扩增的。将 经亚硫酸氢盐转化的DNA产物使用定量甲基化特异性PCR引物扩增并分析甲基化，其使用 本领域中的标准测定法。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的 (FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。在一些实施方案中，在 亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增，其使用Invitrogen Superscript III One-St印RT-PCR系统和Platinum Taq。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织 样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前使用基于Taqman的测定 法将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用商品化 的试剂盒进行。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用Zymo EZ DNA甲基化金试剂盒 进行。在一些实施方案中，设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物是使用Applied Biosystems Methyl Primer Express软件设计的。在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐转化的 DNA是使用基于Taqman的测定法扩增的。在一些实施方案中，在Applied Biosystems7900HT 上扩增经亚硫酸氢盐转化的DNA并使用Applied Biosystems SDS软件分析。
[0095] 在一些实施方案中，本发明提供测定甲基化的方法，其通过1)对肿瘤样品的IHC 分析，接着是2)对从步骤1的IHC分析中使用的肿瘤组织提取的DNA的定量甲基化特异性 PCR。简言之，通过以下两种方法之一从IHC载玻片移去盖玻片：将载玻片置于冷冻器中达 至少15分钟，然后使用剃刀片从显微镜载玻片撬开盖玻片。然后，将载玻片在二甲苯中室 温温育以溶解封固剂。或者，将载玻片浸泡在二甲苯中直至盖玻片脱落。这可能占用数天。 所有载玻片都通过5分钟二甲苯（x3)和5分钟100%乙醇（x2)的脱石蜡化规程。将组织 用剃刀片从载玻片刮下，置于含有蛋白酶K的组织裂解缓冲液中，并在56°C过夜温育。在其 中组织在温育后仍然存在的情况中，可再添加1〇μ 1蛋白酶K，并将组织再温育30分钟。继 续DNA提取；例如通过使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒。对从IHC载玻片直接提取的DNA 进行QMSP分析，其使用如上文描述的QMSP3引物和探针。
[0096] 在一些实施方案中，通过深度测序来对经亚硫酸氢盐转化的DNA测序。深度测序 是其中多次读序列的方法，如直接焦磷酸测序。深度测序可用于检测稀有事件如稀有突 变。对有限数目基因座的超深度测序可通过对PCR产物的直接焦磷酸测序和通过在单次 运行中对超过100种PCR产物测序来实现。在对经亚硫酸氢盐转化的DNA测序中的挑战 源于其在胞嘧啶残基到胸腺嘧啶（尿嘧啶）残基的亚硫酸氢盐转化后的低序列复杂性。 可引入降低代表性亚硫酸氢盐测序（Reduced representation bisulphite sequencing, RRBS)来减少序列冗余，其通过仅选择基因组的一些区域来通过DNA片段的大小-分断分离 (size-fractionation)测序（Laird, PW Nature Reviewsll :195-203 (2010))。革巴向可通过 在测序前阵列捕捉或挂锁捕捉（padlock capture)来完成。例如，在固定阵列上或通过溶液 杂交选择的靶向性捕捉能富集DNA或RNA寡核苷酸库靶向的序列并且可在亚硫酸氢盐转化 之前或之后实施。或者，挂锁捕捉提供改进的富集效率，其通过组合两种系留探针的增加的 退火特异性，随后使用通用引物来进行扩增，其允许比使用基因座特异性引物扩增更均一 的代表性。
[0097] 其他甲基化检测方法包括但不限于，甲基化的CpG岛扩增（参见Toyota 等，Cancer Res. 59:2307-12(1999))和记载于例如美国专利公开文本2005/0069879 ;Rein 等，Nucleic Acids Res. 26 (10) : 2255-64 (1998) ;01ek 等，Nat Genet. 17 (3) : 275-6 (1997); Laird, PW Nature Reviewsll: 195-203 (2010);和 PCT 公开文本 No. W000/70090)的那些。
[0098] DNA甲基化水平可由甲基化指标表示为甲基化的DNA拷贝数（循环次数）对参照 基因的循环次数（其等同扩增甲基化和非甲基化靶物）的比率。高水平的DNA甲基化可通 过比较非赘生性细胞的样品（特别是相同组织类型的或来自外周血单个核细胞的）中的 DNA甲基化水平来测定。在一个具体的实施方案中，特定基因中的高水平DNA甲基化可在相 比于正常细胞中更高的水平检测到。在另一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相 比于正常细胞中为约2倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于 正常细胞中为约3倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常 细胞中为约4倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞 中为约5倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为 约6倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约7 倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约8倍或 更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约9倍或更高。 在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约10倍或更高。
[0099] "低甲基化"意指可能甲基化的CpG位点中多数是未甲基化的。在某些实施方案 中，低甲基化意指基因的一部分中低于50%、低于45%、低于40%、低于35%、低于30%、低 于25%、低于20%、低于15%、低于10%、低于5%、或低于1 %的可能的甲基化位点是甲基 化的。在再一个实施方案中，低甲基化意指相比于在正常水平例如在非肿瘤细胞中表达的 基因，更少的可能甲基化的位点是甲基化的。在另一个实施方案中，低甲基化意指没有一个 CpG位点是甲基化的。
[0100] "高甲基化"意指可能甲基化的CpG位点中多数是甲基化的。在某些实施方案中， 高甲基化意指基因的一部分中高于50%、高于55%、高于60%、高于65%、高于70%、高于 75%、商于80%、商于85*%、商于90%、商于95*%、或商于99%的可能的甲基化位点是甲基 化的。在再一个实施方案中，高甲基化意指相比于在正常水平例如在非肿瘤细胞中表达的 基因，更多的可能甲基化的位点是甲基化的。在另一个实施方案中，高甲基化意指所有的 CpG位点是甲基化的。
[0101] 在一些实施方案中，通过评估细胞中的mRNA来测定细胞中的生物标志物表达。用 于评估细胞中mRNA的方法是公知的，且包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法（如使用 特异于一种或多种基因的经标记riboprobe的原位杂交、Northern印迹和相关技术）和各 种核酸扩增测定法（如RT-PCR，其使用特异于一种或多种基因的互补引物，和其他扩增类 型检测方法如例如分支的DNA、SISBA、TMA等）。在一些实施方案中，比较生物标志物在测 试样品与参照样品中的表达。例如，测试样品可以是肿瘤组织样品，参照样品可以是来自正 常组织或细胞如PBMC。
[0102] 来自哺乳动物的样品可使用Northern、点印记或PCR分析方便地测定。另外，这类 方法可包括允许测定生物学样品中靶mRNA的水平的一个或多个步骤（例如通过同时检查 "看家"基因如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平）。任选地，可测定扩增的 靶cDNA的序列。
[0103] 本发明的任选方法包括在组织或细胞样品中通过微阵列技术来检查或检测mRNA 如靶mRNA的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品 逆转录并标记以生成cDNA探针。然后，将探针与固定化在固体支持物上的核酸阵列杂交。 阵列配置为使得阵列的每个成员的序列和位置都是已知的。例如，可将其表达与抗血管生 成疗法的增加或降低的临床益处相关的基因选择排列在固体支持物上。经标记探针与特定 阵列成员的杂交指示该探针来源的样品表达该基因。
[0104] 依照一些实施方案，通过观察前述基因的蛋白质表达水平来测量存在和/或水平 /量。在某些实施方案中，所述方法包括使生物学样品与针对本文中描述的生物标志物的抗 体在允许生物标志物结合的条件下接触，并检测抗体与生物标志物之间是否形成复合物。 这类方法可以是体外或体内方法。
[0105] 在某些实施方案中，使用IHC和染色方案来检查样品中生物标志蛋白的存在和/ 或水平/量。已显示组织切片的IHC染色是测定或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。在一 个方面，使用包括以下的方法测定生物标志物的水平，包括：(a)使用抗体实施对样品（如 受试者癌症样品）的IHC分析；并b)测定样品中生物标志物的水平。在一些实施方案中， 相对于参照值测定IHC染色强度。
[0106] IHC可与另外的技术如形态学染色和/或突光原位杂交组合实施。IHC有两种一 般性方法；直接和间接测定法。依照第一种测定法，直接测定抗体对靶抗原的结合。该直 接测定法使用经标记的试剂，如荧光标签或酶标记的一抗，其可以在没有别的抗体相互作 用的情况下可视化。在典型的间接测定法中，未缀合的一抗结合抗原，然后经标记的二抗结 合该一抗。在二抗缀合于酶标记物的情况下，添加生色或产荧光底物以提供抗原的可视化。 发生信号扩增，因为几个二抗可以与一抗上的不同表位反应。
[0107] 用于IHC的一抗和/或二抗通常用可检测模块标记。存在大量标记，其一般可 分组成以下类别：(a)放射性同位素，如 34、14(：、1251、3!1和1311 ;〇3)胶体金颗粒；（(3)荧光 标记物，包括但不限于稀土螯合物（铕螯合物）、TexasRed、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺 (Lissamine)、伞形酮（umbelliferone)、藻红蛋白（phycocrytherin)、藻蓝蛋白、或商品化 的荧光团如SPECTRUM0RANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一种或多种的衍生物； (d)存在各种酶-底物标记物，且美国专利No. 4, 275, 149提供了对其中一些的综述。酶标记 物的例子包括萤光素酶（例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No. 4, 737, 456)、 萤光素、2, 3-二氢酞嗪二酮（dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物 酶如辣根过氧化物酶（HRP0)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶 (例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）、杂环氧化酶（如尿酸酶和 黄噪呤氧化酶）、乳过氧化物酶（lactoperoxidase)、微过氧化物酶（microperoxidase)等。
[0108] 酶-底物组合的例子包括,例如辣根过氧化物酶（HRP0)和作为底物的过氧化氢 酶；碱性磷酸酶（AP)和作为生色底物的对硝基苯基磷酸；和β -D-半乳糖苷酶（β -D-Gal) 与生色底物（例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶）或产荧光底物（例如4-甲基伞形 基（methylumbelliferyl)-P-D-半乳糖苷酶）。对于这些的一般性综述，参见美国专利 No. 4, 275, 149 和 4, 318, 980。
[0109] 可将如此制备的标本封固并盖上盖玻片。然后确定载玻片评估，例如使用显微镜， 并可采用本领域中常规使用的染色强度标准。在一些实施方案中，约1+或更高的染色模式 得分是诊断性和/或预后性的。在某些实施方案中，IHC测定法中约2+或更高的染色模式 得分是诊断性和/或预后性的。在其他实施方案中，约3或更高的染色模式得分是诊断性 和/或预后性的。在一个实施方案中，理解当使用IHC检查来自肿瘤或结肠腺瘤的细胞和/ 或组织时，通常在肿瘤细胞和/或组织中测定或评估染色（相对于可能存在于样品中的基 质或周围组织）。
[0110] 在备选的方法中，可使样品与特异于生物标志物的抗体在足以形成抗体-生物标 志物复合物的条件下接触，然后检测该复合物。可以许多途径来检测生物标志物的存在， 如通过Western印迹和ELISA规程，其用于测定很多种组织和样品，包括血浆或血清。有 大量使用这类测定形式的免疫测定技术，参见例如美国专利No. 4, 016, 043、4, 424, 279和 4, 018, 653。这些包括非竞争型的单位点和双位点二者或"三明治式"测定法，以及传统的 竞争性结合测定法。这些测定法还包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。
[0111] 选定的生物标志物在组织或细胞样品中的存在和/或水平/量还可经由功能性或 基于活性的测定法来检查。例如，如果生物标志物是酶，可以进行本领域中已知的测定法来 测定或检测给定的酶活性在组织或细胞样品中的存在。
[0112] 在某些实施方案中，针对测定的生物标志物的量中的差异和使用的样品质量中的 可变性，以及测定轮数之间的变异性两者将样品标准化。这类标准化可通过检测并纳入特 定标准化生物标志物（包括公知的看家基因如ACTB)水平来实现。或者，标准化可基于所有 测定基因或其较大子集的均值或中值信号（全局标准化办法）。在一个基因接一个基因的 基础上，将受试者肿瘤mRNA或蛋白质的测量的经标准化的量与在参照集中发现的量比较。 每种mRNA或蛋白质每份测试肿瘤每位受试者的经标准化表达水平可表示为在参照集中测 量的表达水平的百分数。在要分析的特定受试者样品中测量的存在和/或表达水平/量将 落在该范围内的某个百分数处，这可通过本领域中公知的方法来测定。
[0113] 在某些实施方案中，如下测定基因的相对表达水平：
[0114] 相对表达基因1样品1 = 2exp(Ct看家基因-Ct基因1)，Ct在样品中测定。
[0115] 相对表达基因1参照RNA = 2exp (Ct看家基因-Ct基因1)，Ct在参照样品中测 定。
[0116] 标准化的相对表达基因1样品1 =(相对表达基因1样品1/相对表达基因1参 照 RNA)xl00
[0117] Ct是阈值循环。Ct是反应中生成的荧光与阈值线相交的循环数。
[0118] 将所有实验均对参照RNA标准化，参照RNA是来自各种组织来源的RNA的广泛混 合物（例如参照RNA#636538,来自Clontech, Mountain View, CA)。将等同的参照RNA包含 在每次qRT-PCR运行中，从而允许在不同的实验轮之间比较结果。
[0119] 在一个实施方案中，所述样品是临床样品。在另一个实施方案中，所述样品用在诊 断性测定法中。在一些实施方案中，所述样品从原发性或转移性肿瘤获得。经常使用组织 活组织检查（biopsy)来获得肿瘤组织的代表性的片/块。或者，可以以已知或认为含有感 兴趣肿瘤细胞的组织或流体的形式间接获得肿瘤细胞。例如，可通过切除、支气管镜检、细 针抽吸、支气管刷检、或从痰、胸膜液或血液获得肺癌损伤的样品。在一些实施方案中，所述 样品包括循环的肿瘤细胞；例如血液、尿液或痰中的循环癌细胞。可从癌症或肿瘤组织或从 其他身体样品如尿液、痰、血清或血浆检测基因或基因产物。上文论述的用于检测癌性样品 中靶基因或基因产物的相同技术可应用于其他身体样品。癌细胞可能从癌损伤脱落并出现 在这类身体样品中。通过筛选这类身体样品，可实现对这些癌症的简单的早期诊断。另外， 通过测试这类身体样品中的靶基因或基因产物能更容易地监测治疗的进展。
[0120] 在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组 织是来自同一受试者或个体的单一样品或组合的多重样品，其在不同于获得测试样品时的 一个或多个时间点获得。例如，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照 组织在早于获得测试样品时的时间点从同一受试者或个体获得。如果参照样品在癌症的初 始诊断期间获得而测试样品在癌症变成转移性时的更晚时候获得，那么这类参照样品、参 照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织可以是有用的。
[0121] 在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组 织是来自一个或多个并非该受试者或个体的健康个体的组合的多重样品。在某些实施方案 中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自患有疾病或病症 (例如癌症）的、并非该受试者或个体的一个或多个个体的组合的多重样品。在某些实施方 案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自并非该受试者 或个体的一个或多个个体的正常组织的合并RNA样品或合并的血浆或血清样品。在某些实 施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自患有疾病 或病症（例如癌症）的、并非该受试者或个体的一个或多个个体的肿瘤组织的合并RNA样 品或合并的血浆或血清样品。
[0122] 在本发明的方法中，组织样品可以是体液或排泄物如血液、尿液、唾液、粪、胸膜 液、淋巴液、痰、腹水、前列腺液、脑脊髓液（CSF)、或任何其他的身体分泌物或其衍生物。血 液意为包括全血液、血浆、血清或血液的任何衍生物。在其中侵入性取样方法不适宜或不方 便的情况下，有时可优选在这类体液或排泄物中评估肿瘤上皮或间充质生物标志物。
[0123] 在本发明的方法中，肿瘤细胞可以是肺癌肿瘤细胞（例如非小细胞肺癌 (NSCLC))、胰腺癌肿瘤细胞、乳腺癌肿瘤细胞、头和颈癌肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、结肠癌肿 瘤细胞、卵巢癌肿瘤细胞、或来自如下文中描述的多种其他癌症中任一种的肿瘤细胞。所述 肿瘤细胞优选为已知或预期表达EGFR的类型，来自实体肿瘤的所有肿瘤细胞均如此。EGFR 激酶可以是野生型或突变体形式。
[0124] 在本发明的方法中，肿瘤可以是肺癌肿瘤（例如非小细胞肺癌（NSCLC))、胰腺癌 肿瘤、乳腺癌肿瘤、头和颈癌肿瘤、胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、或来自如下文中描 述的多种其他癌症中任一种的肿瘤。所述肿瘤优选为其细胞已知或预期表达EGFR的类型， 如所有实体肿瘤均如此。EGFR可以是野生型或突变体形式。
[0125] 抑制剂和药物组合物
[0126] 适用于本发明的例示性EGFR激酶抑制剂包括，例如喹唑啉EGFR激酶抑制剂、 吡啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂、嘧啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂、吡咯并嘧啶EGFR激酶抑制 齐[J、吡唑并嘧啶EGFR激酶抑制剂、苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制剂、羟吲哚EGFR激酶抑 制剂、indolocarbazole EGFR激酶抑制剂、酞嗪EGFR激酶抑制剂、异黄酮EGFR激酶抑制 齐[J、quinalone EGFR激酶抑制剂、和tyrphostin EGFR激酶抑制剂，如记载于以下专利公 开文本的那些，和EGFR激酶抑制剂的所有药学可接受的盐和溶剂合物：国际专利公开文 本 No. TO 96/33980、TO 96/30347、TO 97/30034、TO 97/30044、TO 97/38994、TO 97/49688、 TO 98/02434、TO 97/38983、TO 95/19774、TO 95/19970、TO 97/13771、TO 98/02437、TO 98/02438,W0 97/3288UW0 98/33798,W0 97/32880,W0 97/3288,W0 97/02266,W0 97/27199, TO 98/07726、TO 97/34895、TO 96/31510、TO 98/14449、TO 98/14450、TO 98/14451、TO 95/09847、TO 97/19065、TO 98/17662、TO 99/35146、TO 99/35132、TO 99/07701 和 TO 92/20642 ;欧洲专利申请 No. EP 520722、EP 566226、EP787772、EP 837063 和 EP 682027 ; 美国专利 No. 5, 747, 498、5, 789, 427、5, 650, 415 和 5, 656, 643 ;和德国专利申请 No. DE 19629652。低分子量EGFR激酶抑制剂的其他非限制性例子包括Traxler，P.，1998, Exp. Opin. Ther. Patents8 (12) : 1599-1625 中描述的任何 EGFR 激酶抑制剂。
[0127] 可依照本发明使用的低分子量EGFR激酶抑制剂的特定优选的例子包括[6, 7-二 (2-甲氧基乙氧基）-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基）胺（亦称为0SI-774、厄洛 替尼或 TARCEVA?(厄洛替尼 HC1) ;OSIPharmaceuticals/Genentech/Roche)(美国专 利 No. 5, 747, 498 ;国际专利公开文本 No. WO 01/34574 和 Moyer, J. D.等（1997) Cancer Res. 57:4838-4848) ;CI-1033 (之前已知为 PD183805 ;Pfizer) (Sherwood 等，1999，卩1'〇。· Am.Assoc.Cancer Res. 40:723) ；PD-158780 (Pfizer) ；AG-1478 (University of California) ;CGP-59326(Novartis) ;PKI-166(Novartis) ;EKB-569(Wyeth) ;GW-2016(亦 称为GW-572016或二甲苯磺酸拉帕替尼（lapatinib ditosylate) ;GSK);和吉非替尼 (亦称为 ZD1839 或 IRESSA? ;Astrazeneca) (Woodburn 等，l"7, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633)。可依照本发明使用的一种特别优选的低分子量EGFR激酶抑制剂是[6, 7-二 (2-甲氧基乙氧基）-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基）胺（即厄洛替尼）、其盐酸盐（即 厄洛替尼HC1，TARCEVA?)、或其他盐形式（例如甲磺酸（mesylate)厄洛替尼）。
[0128] 基于抗体的EGFR激酶抑制剂包括任何抗EGFR抗体或抗体片段，其能部分或 完全地阻断EGFR通过其天然配体的活化。基于抗体的EGFR激酶抑制剂的非限制性 例子包括记载于 Modjtahedi, H.，等，1993, Br. J. Cancer67:247-253 ;Teramoto, T.， 等，1996, Cancer77:639-645;Goldstein 等，1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318; Huang, S. Μ·，等，1999, Cancer Res. 15:59(8) : 1935-40 ;和 Yang, Χ·，等，1999, Cancer Res. 59:1236-1243的那些。如此，EGFR激酶抑制剂可以是单克隆抗体Mab Ε7· 6. 3 (Yang, X. D.等（1999) Cancer Res. 59:1236-43)、或 MabC225 (ATCC 登录号 HB-8508)，或具有其结合特 异性的抗体或抗体片段。适宜的单克隆抗体EGFR激酶抑制剂包括但不限于頂C-C225 (亦 称为西妥昔单抗或 ERBITUX? ; Imclone Systems)、ABX-EGF (Abgenix)、EMD 72000 (Merck KgaA，Darmstadt)、RH3 (York Medical Bioscience Inc.)和MDX-447 (Medarex/Merck KgaA)。
[0129] 本发明的方法可扩展至抑制EGFR和其他靶物的那些化合物。这些化合物在本 文中称为"双特异性抑制剂"。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是双特异性HER3/ EGFR、EGFR/HER2、EGFR/HER4或EGFR c-Met抑制剂。在一个实施方案中，所述双特异性抑 制剂是双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是包含特异性结合EGFR 和第二靶物的抗原结合域的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是 包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述 双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含两个等同抗原结合域的双特异性抗体。这类抗体记载 于 US 8, 193, 321、20080069820、TO2010108127、US20100255010 和 Schaefer 等，Cancer Cell，20:472-486(2011)。在一个实施方案中，所述双特异性HER2/EGFR是拉帕替尼/ GW572016。
[0130] 可依照已知方法产生另外的基于抗体的抑制剂，其通过将适宜的抗原或表位施用 给选定的宿主动物，例如猪、牛、马、家兔、山羊、绵羊和小鼠等。可将本领域中已知的各种佐 剂用于增强抗体生成。
[0131] 尽管可用于实践本发明的抗体可以是多克隆的，但优选单克隆抗体。可使 用通过培养连续细胞系提供抗体分子生成的任何技术来制备并分离单克隆抗体。用 于生成和分离的技术包括但不限于，最初由Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术 (Nature, 1975, 256:495-497);人 B-细胞杂交瘤技术（Kosbor 等，1983, Immunology Today4:72;Cote等，1983，Proc·Nati·Acad·Sci·USA80:2026-2030) ;和EBV-杂 交 瘤技术(Cole 等,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R. Liss, Inc.，ρρ· 77-96) 〇
[0132] 或者，可将针对单链抗体生产所描述的技术（参见例如美国专利No. 4, 946, 778) 改为适应于产生具有期望特异性的单链抗体。可用于实践本发明的基于抗体的抑制剂还包 括抗体片段，包括但不限于F(ab'）. sub. 2片段，其可通过对完整抗体分子的胃蛋白酶消化 生成，和Fab片段，其可通过还原F(ab'）. sub. 2片段的二硫桥生成。或者，可构建Fab和/ 或scFv表达库（参见例如Huse等，1989, Science246:1275-1281)以允许快速鉴定出具有 期望特异性的片段。
[0133] 用于生产和分离单克隆抗体和抗体片段的技术是本领域中公知的，且记载于 Harlow 和 Lane, 1988, Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 和 J. W. Goding, 1986,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press, London。人源化的抗EGFR抗体和抗体片段还可依照已知的技术来制备，如记载于 Vaughn, T.J.等，1998, Nature Biotech. 16:535-539的那些和其中引用的参考文献，而且这 类抗体或其片段也可用于实践本发明。
[0134] 或者，用于本发明的抑制剂可基于反义寡核苷酸构建体。反义寡核苷酸，包括反 义RNA分子和反义DNA分子，将作用于通过对其结合来直接阻断靶mRNA的翻译，并如此预 防蛋白质翻译或提高mRNA降解，如此降低细胞中靶蛋白的水平，如此降低活性。例如，可 合成至少约15个碱基且与编码EGFR或HER2的mRNA转录本序列的独特区域互补的反义 寡核苷酸，例如通过常规的磷酸二酯技术，并通过例如静脉内注射或输注施用。用于使用 反义技术来特异性抑制其序列已知的基因的基因表达的方法是本领域中公知的（例如参 见美国专利 No. 6, 566, 135 ;6, 566, 131 ;6, 365, 354 ;6, 410, 323 ;6, 107, 091 ;6, 046, 321 ;和 5, 981，732)。
[0135] 小抑制性RNA(siRNA)还可充当用于本发明的抑制剂。可通过以下来降低靶基因 表达：使肿瘤、受试者或细胞与小双链RNA(dsRNA)或导致小双链RNA产生的载体或构建体 接触，从而使靶基因的表达受到特异性抑制（即RNA干扰或RNAi)。针对其序列已知的基因， 用于选择适宜dsRNA或dsRNA编码载体的方法是本领域中公知的（例如参见Tuschi, T.， 等（1999)Genes Dev. 13(24) :3191-3197 ;Elbashir，S.M.等（2001)Nature411:494-498; Hannon，G.J. (2002) Nature418 :244-251 ;McManus，M.T.和 Sharp，P. A. (2002) Nature Reviews Genetics3:737-747;Bremmelkamp，T.R.等（2002) Science296:550-553;美国 专利 No. 6, 573, 099 和 6, 506, 559 ;和国际专利公开文本 No. WOO 1/36646, W099/32619 和 W001/68836)〇
[0136] 核酶也可充当用于本发明的抑制剂。核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶性 RNA分子。核酶作用机制牵涉核酶分子对互补性靶RNA的序列特异性杂交，继之以内切核苷 酸切割。由此，特异且有效地催化mRNA序列的内切核苷酸切割的工程化的发夹或锤头状基 序核酶分子在本发明的范围内可用。初始通过扫描靶分子中的核酶切割位点来鉴定任何潜 在RNA靶物内的特异性核酶切割位点，所述位点通常包括以下序列：GUA、GUU和⑶C。一旦鉴 定出来，即可评估对应于含切割位点的靶基因区域的约15至20个核糖核苷酸的短RNA序 列中的使得该寡核苷酸序列不适宜的预测性结构特征，如二级结构。还可通过测试候选靶 物对与互补性寡核苷酸杂交的可达性来评估其适宜性，使用例如核糖核酸酶保护测定法。
[0137] 可通过已知方法来制备可用作抑制剂的反义寡核苷酸和核酶两者。这些包括用于 化学合成的技术，如例如通过固相亚磷酰胺化学合成。或者，反义RNA分子可通过编码该 RNA分子的DNA序列的体外或体内转录生成。这类DNA序列可掺入很多种载体中，所述载 体掺有适宜的RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子。可引入对本发明寡核苷酸的 各种修饰作为增加胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于向分子的5'和 /或3'端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或在寡核苷酸主链内使用硫代磷 酸酯或2' -0-甲基而非磷酸二酯连接。
[0138] 在本发明治疗方法的背景中，将抑制剂（如EGFR抑制剂）作为包含药学可接受载 体和非毒性治疗有效量的EGFR激酶抑制剂化合物（包括其药学可接受的盐）的组合物使 用。
[0139] 术语"药学可接受的盐"指从药学可接受的非毒性碱或酸制备的盐。当本发明的 化合物是酸性时，其相应的盐可从药学可接受的非毒性碱方便地制备，包括无机碱或有机 碱。从这类无机碱衍生的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐（二价铜和一价铜）、铁盐、亚铁盐、 锂盐、镁盐、锰盐（三价锰和二价锰）、钾盐、钠盐、锌盐等盐。特别优选的是铵盐、钙盐、镁 盐、钾盐和钠盐。源自药学可接受的有机非毒性碱的盐包括伯胺、仲胺或叔胺，以及环胺和 经取代胺如天然存在的和合成的经取代胺的盐。其他可从其形成盐的药学可接受的有机非 毒性碱包括离子交换树脂如例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、Ν'，Ν' -联苄基乙撑二胺、 二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙撑二胺、Ν-乙基吗啉、Ν-乙基 哌陡、葡糖胺（glucamine)、葡糖胺（glucosamine)、组氨酸、hydrabamine、异丙胺、赖氨酸、 甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱（theobromine)、三乙胺 (triethylameine)、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇（tromethamine)等。
[0140] 当用于本发明的化合物是碱性时，其相应的盐可从药学可接受的非毒性酸 方便地制备，包括无机或有机酸。这类酸包括例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸 (camphorsulfonic)、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟基乙磺酸 (isethionic)、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双轻萘酸（pamoic)、泛 酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。特别优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来 酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
[0141] 包含作为活性成分的抑制剂化合物（包括其药学可接受的盐）的用于本发明的药 物组合物可包含药学可接受的载体和任选地其他治疗成分或佐剂。其他治疗剂可包括那些 细胞毒性剂、化疗剂或抗癌剂，或增强这类药剂的效果的药剂，如上文所列的。所述组合物 包括适用于口服、直肠、局部和胃肠外（包括皮下、肌内和静脉内）施用的组合物，尽管在任 意给定情况中的最适宜的路径将依赖于具体的宿主、和施用活性成分所针对的状况的性质 和严重性。药物组合物可以单位剂量形式方便地呈现并通过药学领域中公知的任何方法来 制备。
[0142] 在实践中，本发明的抑制剂化合物（包括其药学可接受的盐）可作为活性成分与 药学载体依照常规的药物复合技术组合到密切的混合物中。根据期望用于施用（例如口服 或胃肠外（包括静脉内））的制备物的形式，载体可采用很多种形式。如此，本发明的药物 组合物可呈现为适用于口服施用的离散单位，如胶囊、扁囊剂（cachet)或片剂，其各自含 有预确定量的活性成分。另外，所述组合物可呈现为粉剂、颗粒剂、溶液、水性液体中的混悬 齐U、非水性液体、水包油乳剂、或油包水液体乳剂。除了上文列出的常见剂量形式以外，抑制 剂化合物（包括其每种组分的药学可接受的盐）还可通过受控释放手段和/或投递装置施 用。所述组合组合物可通过任何药学方法来制备。一般地，这类方法包括使活性成分与构 成一种或多种必要成分的载体产生联合的步骤。一般地，所述组合物通过将活性成分与液 体载体或精细分开的固体载体或两者均一且密切混合来制备。然后，产物可方便地成形为 期望的呈现物。
[0143] 本发明中使用的抑制剂化合物（包括其药学可接受的盐）还可以与一种或多种其 他治疗活性化合物组合纳入药学组合物中。其他治疗活性化合物可包括那些细胞毒性剂、 化疗剂或抗癌剂，或增强这类药剂效果的药剂，如上文列出的。
[0144] 如此，在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物可包含与抗癌剂组合的抑制 剂化合物，其中所述抗癌剂是选自下组的成员：烷化药物、抗代谢物、微管抑制剂、鬼白毒素 (podophyllotoxin)、抗生素、亚硝基脲、激素疗法、激酶抑制剂、肿瘤细胞凋亡的激活剂、和 抗血管生成剂。
[0145] 采用的药学载体可以是例如固体、液体或气体。固体载体的例子包括乳糖、石膏粉 (terra alba)、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶（acacia)、硬脂酸镁和硬脂酸。液 体载体的例子是糖浆剂、花生油、橄榄油和水。气态载体的例子包括二氧化碳和氮气。
[0146] 在针对口服剂量形式的组合物的制备中，可采用任何方便的药学介质。例如，水、 二醇、油、醇、增味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制备物如混悬剂、酏剂和溶液； 而载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、颗粒化剂、滑润剂、结合剂、分解剂等可用于形成口 服固体制备物如粉剂、胶囊和片剂。由于其易于施用，片剂和胶囊是优选的口服剂量单位， 由此采用固体药学载体。任选地，片剂可通过标准的水性或非水性技术包被。
[0147] 含有用于本发明的组合物的片剂可通过压缩或模塑制备，任选地连同一种或多种 附属成分或佐剂。压缩的片剂可通过在合适的机器中压缩来制备，活性成分处于自由流动 形式如粉剂或颗粒剂，任选地与结合剂、滑润剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合。模 塑的片剂可通过在合适的机器中模塑来制备，将成粉状的化合物的混合物用惰性液体稀释 剂加湿。每种片剂优选含有约0. 05mg至约5g的活性成分，每种扁囊剂或胶囊优选含有约 0. 05mg至约5g的活性成分。
[0148] 例如，意图口服施用给人的配制剂可含有约0. 5mg至约5g的活性剂，其与适宜且 方便量的载体材料复合，所述载体材料的量可在总组合物的约5至约95个百分数变化。单 位剂量形式一般将含有约lmg至约2g活性成分，通常为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、 400mg、500mg、600mg、800mg、或 lOOOmg。
[0149] 用在本发明中的适用于胃肠外施用的药物组合物可制备为活性化合物在水中的 溶液或混悬剂。可纳入合适的表面活性剂，如例如羟丙基纤维素。分散体还可在甘油、液体 聚乙二醇及其混合物中，在油中制备。另外，可纳入防腐剂以阻止微生物的有害生长。
[0150] 在本发明中使用的适合注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散体。此 夕卜，组合物可以以供临场制备这类无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂的形式。在所有 情况下，最终可注射形式必须是无菌的，且必须为有效流动的从而得到容易的可注射性。所 述药物组合物在制造和存储条件下必须是稳定的；如此，优选应保存为免于微生物如细菌 和真菌的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二 醇）、植物油、及其适当混合物的溶剂或分散介质。
[0151] 本发明的药物组合物可以以适于局部使用的形式，如例如气雾剂、乳膏、软膏剂、 洗剂、粉化散剂（dusting powder)等。另外，所述组合物可以以适用于经皮装置中的形式。 这些制剂可利用抑制剂化合物（包括其药学可接受的盐）经由常规处理方法制备。例如， 乳膏或软膏剂通过将亲水性材料和水与约5wt %至约10wt %的化合物混合在一起以产生 具有期望稠度的乳膏或软膏剂来制备。
[0152] 本发明的药物组合物可以以适用于直肠施用的形式，其中载体是固体。优选混合 物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域中普遍使用的其他材料。可通过以 下便利地形成栓剂，首先将组合物与软化或熔解的载体混合，接着在模具中冷却并成形。
[0153] 除了前述载体成分外，上文描述的药物制剂在适宜时还可包含一种或多种其他载 体成分如稀释剂、缓冲剂、增味剂、结合剂、表面活性剂、增稠剂、滑润剂、防腐剂（包括抗氧 化物）等。此外，可纳入其他佐剂以使得所述制剂与意图受体的血液等渗。还可以粉剂或 液体浓缩物形式制备含有抑制剂化合物（包括其药学可接受的盐）的组合物。
[0154] 用于实践本发明的化合物的剂量水平将大概如本文中描述的，或如本领域中对这 些化合物描述的。然而，理解对任何具体患者的特定剂量水平将依赖于多种因素，包括年 龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用路径、排泄速率、药物组合和进行治疗的具 体疾病的严重性。
[0155] 本领域中已知的许多备选的实验方法可成功地取代在实践本发明时本文 中具体描述的那些，如例如记载于本发明相关【技术领域】中可获的许多优秀的手册和 教科书中的（例如 Using Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow, E.和 Lane, D. 编，1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(例如 ISBN0-87969-544-7) ;Roe B. A.等 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John Wiley&Sons.(例如 ISBN0-471-97324-0) ;Methods in Enzymology:Chimeric Genes and Proteins^, 2000, ed. J. Abelson, M. Simon, S. Emr, J. Thorner. Academic Press ；Molecular Cloning:a Laboratory Manual, 2001,3rd Edition,由 Joseph Sambrook 和 Peter MacCallum,(以前的 Maniatis Cloning manual)(例如 ISBN0-87969-577-3) ;Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M.Ausubel,等 John Wiley&Sons (例如 ISBNO-471-50338-X) ；Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley&Sons(例如 ISBNO-471-11184-8);和 Methods in Enzymology:Guide to protein Purification, 1990, Vol. 182, Ed. Deutscher, Μ. P.，Acedemic Press, Inc.(例如 ISBN0-12-213585-7))，或如致力于描述分子生物学中的实验方法的许多大学和商业性网 站上描述的。
[0156] 医学领域中的普通技术人员将领会，在诊断患者对抑制剂的可能的响应性之后， 对患者施用治疗有效量的如本文中描述的抑制剂（例如EGFR激酶抑制剂、双特异性EGFR 激酶抑制剂或HER2抑制剂）的确切方式将由主治医师的判断而定。施用的模式，包括剂 量、与其他抗癌剂的组合、施用时机和频率等可能受到患者对抑制剂的可能响应性的诊断， 以及患者的状况和病史的影响。如此，甚至诊断为患有预测对抑制剂类型相对不敏感的肿 瘤的患者仍可能受益于使用这类抑制剂治疗，特别是在与其他抗癌剂或可能改变对抑制剂 的肿瘤敏感性的药剂组合时。
[0157] 就本发明而言，抑制剂与其他抗癌剂"的共施用"和将抑制剂与其他抗癌剂"共施 用"（两种组分在后文中均称为"两种活性药剂"）指两种活性药剂的分开或一起的任何施 用，其中两种活性药剂作为设计为获得组合疗法益处的适宜剂量方案的部分施用。如此，两 种活性成分可作为同一药物组合物的部分施用，或在分别的药物组合物中施用。所述其他 药剂可在抑制剂施用之前、同时或之后施用，或以其一些组合施用。当以重复间期对患者施 用抑制剂时，例如在标准的治疗过程期间，所述其他药剂可在每次抑制剂施用之前、同时或 之后，或以其一些组合，或相对于抑制剂治疗以不同的间期，或以单一剂量在使用抑制剂的 治疗过程之前、期间任何时间、或之后施用。
[0158] 所述抑制剂通常将以对所治疗患者提供最有效癌症治疗（从功效和安全性角度 两者）的剂量方案施用给患者，如本领域中已知的，和如披露在例如国际专利公开文本 No. W0 01/34574中的。在进行本发明的治疗方法中，所述抑制剂可以本领域中已知的任何 有效方式施用，如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、皮下、鼻内、眼内、阴道、直 肠或皮内路径，根据所治疗的癌症类型、所使用的抑制剂类型（例如，小分子、抗体、RNAi、 核酶或反义构建体）、和处方医师的医学判断，如例如基于公开的临床研究结果。
[0159] 施用的抑制剂的量和抑制剂施用的时机将取决于所治疗患者的类型（种、性别、 年龄、重量等）和状况、所治疗疾病或状况的严重性、和施用路径。例如，小分子抑制剂可以 范围从0. 001至100mg/kg体重每天或每周的剂量以单一或分开的剂量或通过连续输注施 用给患者（参见例如，国际专利公开文本No. W0 01/34574)。具体地，厄洛替尼HC1可以范 围从5-200mg每天或100-1600mg每周的剂量以单一或分开的剂量或通过连续输注施用给 患者。优选的剂量是150mg/天。基于抗体的抑制剂或反义、RNAi或核酶构建体可以范围 从0. 1至100mg/kg体重每天或每周的剂量以单一或分开的剂量或通过连续输注施用给患 者。在一些情况中，在前述范围下限之下的剂量水平可以是更适宜的，而在其他情况中，可 采用仍更大的剂量而不导致任何有害的副作用，只要这类更大的剂量首先分成几个小剂量 以供在整天施用。
[0160] 所述抑制剂和其他另外的药剂可通过相同或不同路径分开或一起施用，且以很多 种不同的剂量形式施用。例如，所述抑制剂优选口服或胃肠外施用。当抑制剂是厄洛替尼 HC1(TARCEVA?)时，优选口服施用。抑制剂和其他另外的药剂均可以单一或多剂量施用。
[0161] 所述抑制剂可与各种药学可接受的惰性载体以片剂、胶囊、锭剂（lozenge)、圆 形锭剂（troche)、硬糖（hard candies)、粉剂、喷雾剂、乳膏、软膏（salve)、栓剂、凝胶剂 (jellies)、凝胶（gel)、糊剂、洗剂、软膏剂、酏剂、糖浆剂等的形式施用。这类剂量形式的施 用可以单剂量或多剂量进行。载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有 机溶剂等。口服药物组合物可适宜地加甜和/或增味。
[0162] 所述抑制剂可以与各种药学可接受的惰性载体组合在一起以喷雾剂、乳膏、软膏 (salve)、栓剂、凝胶剂（jellies)、凝胶（gel)、糊剂、洗剂、软膏剂等的形式。这类剂量形式 的施用可以单剂量或多剂量实施。载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无 毒有机溶剂等。
[0163] 应选择所有包含蛋白质性抑制剂的制剂以避免抑制剂生物学活性的变性和/或 降解和损失。
[0164] 制备包含抑制剂的药学组合物的方法是本领域中已知的，且记载于例如国际专 利公开文本No. W001/34574。就本发明的教导而言，制备包含抑制剂的药学组合物的方 法从上文引用的公开出版物和其他已知的参考文献，如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa.，18th edition (1990)，将是显而易见的。
[0165] 对于抑制剂的口服施用，将含有一种或两种活性药剂的片剂与多种赋形剂中的任 一种例如，微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸，连同各种分解剂如淀粉（优 选玉米、马铃薯或木薯淀粉）、海藻酸和某些复合硅酸盐，与颗粒化结合剂如聚乙烯吡咯烷 酮、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶一起组合。另外，滑润剂如硬脂酸镁、月桂醇硫酸钠和滑石对于 形成片剂的目的经常极为有用。还可以采用类似类型的固体组合物作为凝胶胶囊中的填充 齐LI ;在这一点上，优选的材料还包括乳糖（lactose)或乳糖（milk sugar)以及高分子量聚 乙二醇。当期望将水性混悬剂和/或酏剂用于口服施用时，抑制剂可与各种增甜剂或增味 齐U、着色物质或染料和（若期望的）乳化剂和/或助悬剂，以及这类稀释剂如水、乙醇、聚乙 二醇、甘油和其各种类似组合一起组合。
[0166] 对于一种或两种活性剂的胃肠外施用，可采用在芝麻油或花生油或水性丙二醇中 的溶液，以及无菌水性溶液，其包含活性剂或其相应的水溶性盐。这类无菌水性溶液优选是 经过适宜缓冲的，且还优选例如用充足的盐水或葡萄糖使之为等渗的。这些具体的水性溶 液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。油性溶液适用于关节内、肌内和皮下 注射目的。所有这些溶液在无菌条件下的制备是通过本领域技术人员公知的标准药学技术 容易实现的。任何选定用于施用蛋白质性抑制剂的胃肠外制剂应选择为避免所述抑制剂生 物学活性的变性和损失。
[0167] 另外，依照标准的药学实践，可能局部施用一种或两种所述活性成分，通过例如乳 膏、洗剂、凝胶剂（jellies)、凝胶（gel)、糊剂、软膏剂、软膏（salve)等。例如，可以制备包 含约0. 1% (w/v)至约5 % (w/v)浓度的抑制剂的局部制剂。
[0168] 对于兽医用目的，可使用上文所述任何形式并通过任何路径将所述活性成分分开 或一起地施用给动物。在一个优选的实施方案中，所述抑制剂以胶囊、推注、片剂、大剂量药 液（liquid drench)的形式通过注射或作为植入物施用。一个备选方案是，所述抑制剂可与 动物饲料一起施用，而出于此目的可制备浓缩的饲料添加剂或预混合物用于正常的动物给 料。这类制剂以常规方式依照标准的兽医实践制备。
[0169] 医学领域，特别是关于诊断性测试的应用和治疗学治疗的医学领域中的技术人员 将认可生物学系统可展现出变异性且并非总是完全可预测的，如此许多较好的诊断性测试 或治疗学有时是无效的。如此，最终由主治医师基于测试结果、患者状况和病史、及其自身 经验的判断来确定个体患者的最适宜的治疗过程。甚至有以下情况，例如，当基于来自诊断 测试或来自其他标准的数据肿瘤未预测为对EGFR激酶抑制剂特别敏感时，医师会选择用 EGFR抑制剂来治疗患者，尤其是在如果所有或大多数其他明显的治疗选项已经失败，或者 预期在与另一种治疗一起施用时有一些协同性的情况下。与癌症治疗中使用的许多其他抗 癌药物如更传统的化疗剂或细胞毒性剂相比，EGFR抑制剂作为一类相对耐受较好的药物的 事实使其成为更可行的选择。
[0170] 做广告的方法
[0171] 本文中的发明还涵盖一种用于为EGFR抑制剂或其药学可接受的组合物做广告的 方法，其包括给目标受众宣传抑制剂或其药物组合物治疗患有特征为指示上皮样肿瘤的甲 基化模式的癌症类型的患者群体的用途，或给目标受众宣传抑制剂或其药物组合物不用来 治疗患有特征为指示间充质样肿瘤的甲基化模式的癌症类型的患者群体的用途。
[0172] 做广告为经由非个人媒体进行的、通常付费的通讯，其中发起人受到鉴别 且信息受到控制。为本文目的的做广告包括宣传、公共关系、产品布置、赞助、保险 (underwriting)、和促销。该术语还包括出现在任何印刷传播媒体中的赞助的信息公告，其 设计用于引起大众的兴趣以劝说、通知、宣传、激发、或以其它方式改变行为，向购买、支持、 或认可本文中发明的有利方式发展。
[0173] 本文中诊断方法的广告和宣传可通过任何手段实现。用于传递这些信息的广告媒 体的例子包括电视、电台、电影、杂志、报纸、因特网、和告示板，包括商业性的，即出现在广 播媒体中的信息。广告还包括那些在食品货车座位上、机场通道墙壁上、和公共汽车侧面上 的广告、或电话等候信息或店内布告（PA)系统中听到的广告、或可放置视觉或听觉通讯的 任何地方的广告。
[0174] 宣传或做广告手段的更特定的例子包括电视、电台、电影、因特网（诸如网络传播 和网络研讨会（webinar))、意图到达同步用户的交互式计算机网络、固定的或电子的告示 板和其它公共标牌、海报、传统的或电子的文献（诸如杂志和报纸）、其它媒体渠道、讲座 或个体接触，例如通过电子邮件、电话、即时信息、邮寄、快递、大众（mass)、或承运人邮件 (carrier mail)、亲自访问等进行。
[0175] 所使用的做广告的类型会取决于许多因素，例如待传达的目标受众的性质，例如 医院、保险公司、诊所、医生、护士、和患者，以及成本考虑和管理药物和诊断剂做广告的相 关管辖权法律和条例。可根据由服务相互作用和/或其它数据（诸如用户人口统计状况和 地理学定位）限定的用户表征使做广告个性化或用户化。
[0176] 表
[0177] 表1与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸
[0178]
【权利要求】
1. 一种测定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，其包括检测至少一种选自下组的基 因中 CpG 位点处 DNA 甲基化的存在或缺失：CLDN7、H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、ERBB2 和C20orf55,其中所述CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤细胞具有间充质表型。
2. -种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，其包括在样品肿 瘤细胞中检测至少一种选自下组的基因中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失：CLDN7、 H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、ERBB2和C20orf 55，其中所述CpG位点处甲基化的存在指 示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制为抗性。
3. -种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患者的方法，其包括在来自患 者的癌症的样品中检测至少一种选自下组的基因中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失： CLDN7、H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2 和 C20orf55,其中如果所述 CpG 位点处的 DNA 甲基 化检测为缺失，那么将患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。
4. 权利要求3的方法，其进一步包括如果患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治 疗的患者，那么对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。
5. -种在患者中治疗癌症的方法，其包括对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂， 其中所述患者在施用所述EGFR抑制剂之前诊断为患有展现出至少一种选自下组的基因中 CpG 位点处缺失 DNA 甲基化的癌症：CLDN7、H0XC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2 和 C20orf55。
6. 权利要求2-5中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼（erlotinib)、西 妥昔单抗（cetuximab)或帕尼单抗（panitumumab)。
7. -种测定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，其包括检测至少一种选自下组的基因 中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失：PCDH8、PEX5L、GALR1和ZEB2,其中所述CpG位点 处甲基化的存在指示肿瘤细胞具有上皮表型。
8. 前述权利要求中任一项的方法，其中通过焦磷酸测序检测甲基化的存在或缺失。
9. 前述权利要求中任一项的方法，其中从福尔马林固定、石蜡包埋的（FFPE)组织或新 鲜冷冻的组织分离DNA。
10. 权利要求9的方法，其中在焦磷酸测序前预扩增从组织样品分离的DNA。
11. 权利要求1或2的方法，其中所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。
12. 权利要求3-5中任一项的方法，其中所述癌症是NSCLC。
【文档编号】C12Q1/68GK104066851SQ201280058401
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】D.夏姆斯, T.M.霍尔科姆, K.沃尔特 申请人:基因泰克公司