3-羟基异丁酸的生物技术制备方法
【专利摘要】本发明涉及方法，其包括以下步骤：a）提供异丁酸，b）使异丁酸与异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或异丁酸辅酶A转移酶的组合接触，c）使步骤a）的产物与异丁酰辅酶A脱氢酶接触，d）使步骤b）的产物与甲基丙烯酰辅酶A水合酶接触，和e）水解步骤d）的产物以形成3-羟基异丁酸，其中至少一种所述酶以细胞的形式使用，其相比于它的野生型，包含降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性；本发明还涉及细胞，其具有至少一种选自异丁酰辅酶A合成酶/连接酶、异丁酸辅酶A转移酶、异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A脱氢酶、甲基丙烯酰辅酶A水合酶和3-羟基异丁酰辅酶A水解酶的酶，和相比于它的野生型降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性，其中所述细胞此外优选具有单加氧酶，更优选AlkBGT型的单加氧酶或其变体；本发明进一步涉及此类细胞用于制备3-羟基异丁酸的用途。
【专利说明】3-羟基异丁酸的生物技术制备
[0001]本发明涉及方法，其包括以下步骤:a)提供异丁酸，b)使异丁酸与异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶(Phosphotransisobutyrylase)和/或异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或异丁酸辅酶A转移酶的组合接触，c)使步骤b)的产物与异丁酰辅酶A脱氢酶接触，d)使步骤
c)的产物与甲基丙烯酰辅酶A水合酶接触，和e)水解步骤d)的产物以形成3-羟基异丁酸，其中至少一种所述酶以细胞的形式使用，其相比于它的野生型，具有降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性；本发明还涉及细胞，其具有至少一种选自异丁酰辅酶A合成酶/连接酶、异丁酸辅酶A转移酶、异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A脱氢酶、甲基丙烯酰辅酶A水合酶和3-羟基异丁酰辅酶A水解酶的酶，和相比于它的野生型降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性，其中所述细胞此外优选具有单加氧酶，更优选AlkBGT型的烷羟化酶或其变体；本发明进一步涉及此类细胞用于制备3-羟基异丁酸的用途。
[0002]甲基丙烯酸是最重要的工业生产化学品之一。以它的单体甲酯形式，需要它作为聚合反应物用于制备聚甲基丙烯酸甲酯，其对于公众已知为商品名称Plexiglas，并且在许多应用领域中是不可或缺的。聚甲基丙烯酸酯使用的实例包括:口腔医学，其中将它用于假体；汽车工业，其中将它用作指示仪和尾灯的玻璃；光学，尤其作为隐形眼镜和眼镜玻璃的材料；建筑行业，其中将 它用作聚合物混凝土和还作为双组分粘合剂；纺织工业，作为聚丙烯纤维的组分；和在日常居家中，作为用于诸如盘和刀叉餐具的物品的材料。
[0003]甲基丙烯酸通常从化石原材料诸如油开始制备。例如，异丁烯和叔丁醇可以转化为甲基丙烯醒，其随后进一步氧化为甲基丙烯酸酯(William Bauer, Jr."MethacrylicAcid and Derivatives",在 Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002,ffiley-VCH, Weinheim中)。或者，甲基丙烯酸的酰胺硫酸酯/盐，其可以从相应的2_羟基腈开始产生，可以被水解来形成甲基丙烯酸。然而，使用此类方法的甲基丙烯酸的工业生产不仅依赖于化石原料的持续供应，还会消耗相当大量的侵蚀性的、环境有害的化学品。例如，通过水解甲基丙烯酸的酰胺硫酸酯/盐生产I kg的甲基丙烯酸需要1.6 kg的硫酸。
[0004]为了克服作为工业合成的能源和反应物来源的化石原材料的依赖，目前进行了多种努力，其旨在基于可再生原材料通过生物技术产生工业上需要的精细化学品。在甲基丙烯酸及甲基丙烯酸甲酯的情况下，提供有关于3-羟基异丁酸的生物技术合成途径(其可以容易地化学或酶促脱水以形成甲基丙烯酸)(William Bauer, Jr."Methacrylic Acid andDerivatives"在Ullmann’ s Encyclopedia of Industrial Chemistry 2002, ffiley-VCH,Weinheim中)。现有技术教导使用细菌和酵母的野生型分离群从异丁酸制备3-羟基异丁酸(Hasegawa 等，1981; Hasegawa 等，1982，WO 2007/141208 A2 和 TO 2008/119738Al) ο异丁酸唯一地用作用于通过合适的菌株例如通过裙皱假丝酵母rwgosa)制备3-羟基异丁酸的底物。上述专利申请WO 2007/141208 A2和WO 2008/119738 Al描述了用于从碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲醇、L-缬氨酸、L-谷氨酸、CO、合成气体、甲烷等制备3-羟基异丁酸，以及它进一步化学转化为甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的遗传修饰细胞和方法。
[0005]然而，上述的经生物技术方法制备3-羟基异丁酸目前是不经济的。其中明显的缺点是对于异丁酸的高原材料费用和同时在它们转化或使用合适的微生物过程中有时的低产率。
[0006]针对这一背景，本发明的目的是开发3-羟基异丁酸生物技术制备的改进方法，其在产率、纯度和所需资源方面优于在现有技术中描述的方法。
[0007]此外，本发明的目的在于开发从未取代的、尤其是不含杂原子的烷烃开始制备
3-羟基异丁酸的生物技术方法。
[0008] 此外，本发明的目的是开发从可再生原材料开始和/或在不使用或较少使用有害健康的反应物、中间体、催化剂或副产物的情况下获得3-羟基异丁酸的生物技术方法。
[0009]这些和其他目的通过本发明的主题和尤其还通过所附的独立权利要求的主题来实现，其中从从属权利要求中得到具体实施方案。
[0010]本发明的目的在第一方面通过包括以下步骤的方法实现:
a)提供异丁酸，
b)使异丁酸与
异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或 异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或 异丁酸辅酶A转移酶的组合，
c)使步骤b)的产物与异丁酰辅酶A脱氢酶接触，
d)使步骤c)的产物与甲基丙烯酰辅酶A水合酶接触，和
e)水解步骤d)的产物以形成3-羟基异丁酸，
其中以细胞的形式使用至少一种在步骤b)、c)和d)中使用的选自异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和异丁酸辅酶A转移酶的酶，优选地所有的酶均以细胞的形式使用，所述酶具有相比于其野生型降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性。
[0011]在第一方面的第一个实施方案中，通过使异丁烷与单加氧酶，优选烷羟化酶，更优选AlkBGT型或其变体的一种接触来形成异丁酸。
[0012]在第一方面的第二个实施方案中，其还构成第一个实施方案的一个实施方案，步骤e)中的水解通过使步骤d)的产物与3-羟基异丁酰辅酶A水解酶接触来实现。
[0013]在第一方面的第三个实施方案中，其还构成第一个和第二个实施方案的一个实施方案，细胞具有步骤c)中的异丁酰辅酶A脱氢酶和步骤d)中的甲基丙烯酰辅酶A水合酶，和
异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或 异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或 异丁酸辅酶A转移酶的组合。
[0014]在第一方面的第四个实施方案中，其还构成第一个至第三个实施方案的一个实施方案，细胞还具有烷羟化酶，优选AlkBGT型或其变体的一种。
[0015]在第一方面的第五个实施方案中，其还构成第一个至第四个实施方案的一个实施方案，3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。
[0016]根据本发明的第二方面中的目的通过这样的细胞来实现，所述细胞具有至少一种选自异丁酰辅酶A合成酶/连接酶、异丁酸辅酶A转移酶、异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A脱氢酶、甲基丙烯酰辅酶A水合酶和3-羟基异丁酰辅酶A水解酶的酶，和相比于它的野生型降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性。
[0017]在第二方面的第一个实施方案中，除了异丁酰辅酶A脱氢酶和除了甲基丙烯酰辅酶A水合酶之外，细胞具有
异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或 异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或 异丁酸辅酶A转移酶的组合，
优选还有3-羟基异丁酰CoA水解酶。
[0018]在第二方面的第二个实施方案中，其还构成第一个实施方案的一个实施方案，细胞还包含烷羟化酶，优选AlkBGT型或其变体的一种。
[0019]在第二方面的第三个实施方案中，其还构成第一个实施方案的一个实施方案，
3-羟基异丁酸脱氢酶是Yali0F02607g (XP_504911)或其变体。
[0020]在第三方面中，本发明的目的通过使用权利要求7-10中任一项的用于制备3-羟基异丁酸的细胞来实现。
[0021]在第三方面的一个实施方案中，3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。
[0022]在第一、第二或第三方面的进一步的实施方案中，细胞是细菌或低等真核细胞。
[0023]在第一、第二或第三方面的进一步的实施方案中，细胞是选自耶罗维亚酵母属(Jarrowia)、假丝酵母属{Candida)、酵母属iSaccharomyces')、裂殖酵母属(.Schizosaccharomyces)和毕赤酵母属iPichia)的属的酵母细胞,并且优选是解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia Iipolytica)。
[0024]在第四方面中，本发明的目的通过包含根据第二方面的细胞和异丁烷或异丁酸的反应混合物来实现。
[0025]本发明的发明人已令人惊奇地确定了在微生物中失活的编码鉴定为3-羟基异丁酸脱氢酶的酶的基因导致3-羟基异丁酸产率的增加。
[0026]本发明人还已令人惊奇地发现可以从烷反应物尤其是异丁烷开始，通过生物技术制备3-羟基异丁酸。
[0027]实施本发明的方法首先需要准备异丁酸。首先，存在使用市售的异丁酸的选择。第二，存在使用具有合适的催化能力的分离的酶或完整的生物从其他反应物开始制备异丁酸的选择，例如通过培养天然产生异丁酸的生物。在一个优选的实施方案中，通过使异丁烷或另一个合适的烷前体与合适的单加氧酶，优选烷羟化酶(其在一个尤其优选的实施方案中为Alk-BGT型或其变体的烷羟化酶)接触来制备异丁酸。在一个优选的实施方案中，将如本文所用的术语“烷羟化酶”理解为表示氧化还原酶，其具有氧化饱和烃，尤其异丁烷或3-羟基异丁烷的能力，以产生羧酸，优选在末端碳原子上的羧酸。现有技术公开了一系列合适的微生物和酶。例如，Patel 等(Journal of Applied Biochemistry, 1983, 5 (1 - 2),107 - 120)描述了 16中新的细菌菌株，其具有氧化具有C2-C4的链长的气态烷烃的能力，以产生相应的甲基酮、仲醇和伯醇和醛。Grant等(2011)描述了通过AlkB烷羟化酶将烷烃氧化为相应的酸(Grant, C，Woodley, J & Baganz, F 2011, ' Whole-cell bio-oxidationof n—dodecane using th e alkane hydroxylase system of P.putida GPol expressedin E.coli', Enzyme and Microbial Technology, vol 48, n0.6-7, pp.480-486)。[0028]另一方面，存在使用合适的微生物菌株制备异丁酸的选择，所述微生物天然地或通过遗传修饰被赋予包括通过用合适的碳源(例如葡萄糖)补料生产异丁酸的代谢途径。微生物的实例包括例如解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica )、裙皱假丝酵母(Candida rugosa )、法尔皮有抱汉生酵母 iHanseniaspora valbyensi51)、异常汉逊氏酵 ^iHansenula anomala)> Trichosporon aculeatum、Trichosporon fennicum.、Endomyces reessi1、Geotrichum loubier1、黄色微球 1?(#icrococcusflavus)> 藤黄色微球菌iMicrococcus luteus)^ {Micrococcus lysodeikticum)> 近平滑假丝酵母菌(Candi da parapsi 1si 51)、膜酸毕赤酵母 iPi chi a membranaefaci ens )、白球拟酵母(Torulopsi s candi da)、Cocci di oi des posadasi 1、粗球抱子菌(Cocci di oi des immi tis\大丽轮枝菌(Ver ticiIlium dahliae )、玉米赤霉(bberella zeae )、太瑞斯梭孢壳^ {Thielavia terrestris、、Metarhizium acridum、Magnaporthe oryzae.、Sordariamacrospora.、Metarhizium nisopJiae^(A jel lomyces derma ti ti dis)^毛壳菌iChaetomium g1bosum)、巴西类球抱子菌{Paracoccidioides brasiIiensis)^il球丛赤壳(Afeciria haematococca)> 四抱脉抱菌 iNeurospora嗜热毛壳菌(Chae tomium thermophi7a? )和粗糖链抱霉 iNeurospora crassa )。
[0029]在一个优选的实施方案中，通过来自恶臭假单胞菌putida)饱AlkBGT系统或其变体的氧化还原酶AlkB氧化异丁烷来提供异丁酸。AlkB是来自恶臭假单胞菌的AlkBGT系统的氧化还原酶，其已知它的烷羟化酶活性。这依赖于另两个多肽AlkG和AlkT0将AlkT表征为FAD依赖 性红素氧还蛋白还原酶，其从NADH向AlkG转移电子。AlkG是红素氧还蛋白，一种含铁的氧化还原蛋白，其功能为AlkB的直接电子供体。在一个优选的实施方案中，将如本文所用的术语“AlkBGT型的烷羟化酶”理解为表示膜结合的烷单加氧酶。在进一步优选的实施方案中，将同一术语“AlkBGT型的烷羟化酶”理解为表示与恶臭假单胞菌Gpol的AlkB序列(数据库代码:CAB54050.1)具有至少75、80、85、90、92、94、96、98或99 % (优先渐增)的序列同源性的多肽。在进一步优选的实施方案中，将所述术语理解为表示不依赖于细胞色素的单加氧酶。在进一步优选的实施方案中，将术语“AlkBGT型的烷羟化酶”理解为表示不依赖于细胞色素的单加氧酶，其使用至少一种红素氧还蛋白或同源物作为电子供体。在一个尤其优选的实施方案中，将该术语理解为表示与恶臭假单胞菌Gpol的AlkB的序列具有至少60、70、80、80、85、90、92、94、96、98或99 % (优先渐增)的膜结合的、不依赖于细胞色素的烷单加氧酶，其需要至少AlkG (CAB54052.1)作为电子供体，但优选AlkG与还原酶AlkT (CAB54063.1)的组合，其中AlkG和/或AlkT还可以是各种多肽的同源物。如本文所用的术语“序列”可以指多肽的氨基酸序列和/或其核酸编码序列。在进一步优选的实施方案中，如本文所用的“AlkB型的氧化还原酶”是不依赖于细胞色素的氧化还原酶，即不包括细胞色素作为辅因子的氧化还原酶。
[0030]对于该目的，存在使AlkBGT系统的纯化组分与异丁烷接触的选择，尤其是AlkB。在一个优选的实施方案中，使异丁烷与含有AlkBGT的全细胞催化剂接触；在一个最优选的实施方案中，用异源AlkBGT的重组大肠杆菌菌株表达。
[0031]本发明的教导不仅仅可以通过使用本文描述的生物大分子的准确的氨基酸或核酸序列来实现，还可以通过使用此类大分子的变体(其可以通过缺失、添加或取代一个或多于一个的氨基酸或核酸来获得)来实现。在一个优选的实施方案中，如本文所用的核酸序列或氨基酸序列的术语“变体”(下文中与术语“同源物”同义地且可互换使用)表示另一条核酸或氨基酸序列，其具有与对应的原始野生型核酸或氨基酸序列70、75、80、85、90、92、94、96、98、99 %或更高百分比的同源性(此处可同义使用同一性)，其中优选除形成催化活性中心或对于结构或折叠必需的氨基酸之外的氨基酸被取代或缺失，或后者仅被保守取代，例如谷氨酸代替天冬氨酸，或亮氨酸代替缬氨酸。现有技术描述了可用于计算两条序列同源性程度的算法，例如 Arthur Lesk (2008), Introduction to Bioinformatics,第 3 版。在本发明进一步更优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体，优选除上述序列同源性之外，具有与野生型分子或原始分子基本上相同的酶活性。例如，有酶活性的蛋白酶多肽的变体具有与多肽酶相同或基本上相同的蛋白水解活性，即催化肽键水解的能力。在一个具体的实施方案中，术语“基本上相同的酶活性”表示这样的对于野生型多肽的底物而言的活性，其明显高于本底活性和/或与野生型多肽对于相同底物展示出的Km和/或kMt值相差少于3个、优选2个、更优选I个数量级。在进一步优选的实施方案中，术语核酸或氨基酸序列的“变体”包括核酸或氨基酸序列的至少一个活性部分/或片段。在进一步优选的实施方案中，如本文所用的术语“活性部分”表示氨基酸序列或核酸序列，其具有少于氨基酸序列全长的序列和/或编码少于氨基酸序列全长的序列，其中比野生型氨基酸序列长度短的氨基酸序列或编码的氨基酸序列基本上具有与野生型多肽或其变体相同的酶活性，例如醇脱氢酶、单加氧酶或转氨酶。在一个具体的实施方案中，术语核酸的“变体”包括其互补链的核酸，优选在严格条件下与野生型核酸结合的核酸。杂交反应的严格性可以由本领域技术人员容易地确定，并通常依赖于探针的长度、洗涤温度和盐浓度。通常，更长的探针需要更高的杂交温度 ，而更短的样品在低的温度下操作。杂交是否发生通常依赖于变性DNA与其环境(即低于解链温度(Schmelztemperatur))中存在的互补链成环的能力。杂交反应的严格性和相应的条件更详细地描述于Ausubel等1995。在一个优选的实施方案中，如本文所用，术语核酸的“变体”包含编码与原始核酸相同的氨基酸序列的或在遗传密码简并性的情况下该氨基酸序列的变体的任何核酸序列。
[0032]提供异丁酸后，根据本发明，使其与具有将它转化为异丁酰CoA的能力的酶或酶系统接触。可以使异丁酸与异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶的组合接触。将如本文所用的术语“异丁酸激酶”理解为表示具有水解ATP来磷酰基化异丁酸能力的酶。在一个尤其优选的实施方案中，将如本文所用的术语“磷酸转异丁酰酶”理解为表示使用辅酶A催化磷酰基化的丁酸转化为异丁酰CoA的酶。本领域技术人员可以发现现有技术中的合适的酶，例如:
【权利要求】
1.方法，其包括以下步骤: a)提供异丁酸， b)使异丁酸与 异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或 异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或 异丁酸辅酶A转移酶的组合， c)使步骤b)的产物与异丁酰辅酶A脱氢酶接触， d)使步骤c)的产物与甲基丙烯酰辅酶A水合酶接触，和 e)水解步骤d)的产物以形成3-羟基异丁酸， 其中以细胞的形式提供至少一种在步骤b)、c)和d)中使用的选自异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和异丁酸辅酶A转移酶的酶，优选地所有的酶均以细胞的形式提供，所述酶具有相比于它的野生型降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性。
2.权利要求1的方法，其中通过使异丁烷与单加氧酶，优选烷羟化酶，更优选AlkBGT型或其变体的一种接触来形成异丁酸。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中步骤d)中所述的水解通过使步骤d)的产物与3-羟基异丁酰辅酶A水解酶接触来实现。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细胞具有步骤c)中的异丁酰辅酶A脱氢酶和步骤d)中的甲基丙烯酰辅酶A水合酶，和 异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或 异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或 异丁酸辅酶A转移酶的组合。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述细胞另外具有烷羟化酶，优选AlkBGT型或其变体中的一种。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。
7.细胞，其具有至少一种选自异丁酰辅酶A合成酶/连接酶、异丁酸辅酶A转移酶、异丁酸激酶、磷酸转异丁酰酶、异丁酰辅酶A脱氢酶和甲基丙烯酰辅酶A水合酶的酶，和相比于它的野生型，降低的3-羟基异丁酸脱氢酶或其变体的活性。
8.权利要求7的细胞，其中除了异丁酰辅酶A脱氢酶和除了甲基丙烯酰辅酶A水合酶之外，所述细胞具有 异丁酸激酶和磷酸转异丁酰酶和/或 异丁酰辅酶A合成酶/连接酶和/或 异丁酸辅酶A转移酶的组合， 优选还有3-羟基异丁酰辅酶A水解酶。
9.权利要求7-8中任一项的细胞，其进一步包含烷羟化酶，优选AlkBGT型或其变体中的一种。
10.权利要求6-8中任一项的细胞，其中所述3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。
11.权利要求7-10中任一项的细胞用于制备3-羟基异丁酸的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述3-羟基异丁酸脱氢酶是XP_504911.1或其变体。
13.权利要求1-6中任一项的方法，权利要求7-10中任一项的细胞或权利要求11-12中任一项的用途，其中所述细胞是细菌细胞或低等真核细胞。
14.权利要求1-5或13中任一项的方法，权利要求7-10或13中任一项的细胞或权利要求11-13中任一项的用途，其中涉及选自耶罗维亚酵母属(Zarr0Wa)、假丝酵母属(6?/?t/it/a)、酵母属裂殖酵母属(^chizosacchaTomyces')和毕赤酵母属{Pi chi a')的属的酵母细胞,并且优选涉及解脂耶罗维亚酵母(Jarrowia Iipolytica) 0
15.反应混合物，其包含权利要求7-10或13-14中任一项的细胞以及异丁烷或异丁酸。
【文档编号】C12N15/52GK103958691SQ201280059674
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年11月14日 优先权日:2011年12月5日
【发明者】T.哈斯, S.沙费尔, M.珀特, M.维泽尔, J.C.普费弗, C.格林, N.基尔希纳, E.M.维特曼 申请人:赢创德固赛有限公司