真菌细胞和发酵方法

真菌细胞和发酵方法
【专利摘要】本发明提供了能够产生一种或更多种生物质降解酶并且表现出编码PtaB样蛋白之多核苷酸的表达或拷贝数提高或降低的分离的真菌细胞。还提供了用于产生一种或更多种生物质降解酶的发酵方法，其包括表现出编码PtaB样蛋白之多核苷酸的表达或拷贝数提高或降低的真菌细胞。由本发明的分离的真菌细胞和发酵方法所产生的生物质降解酶可用于从生物质产生可溶性糖的方法。
【专利说明】真菌细胞和发酵方法
[0001]本申请要求2011年12月14日提交的美国临时专利申请N0.61/570,545的优先权,其内容在此通过引用全文并入本文。
【技术领域】
[0002]本发明涉及用于产生生物质降解酶的真菌细胞和发酵方法。
【背景技术】
[0003]丝状真菌用于产生用于多种工业生物技术应用的酶和蛋白。在用于产生酶的真菌中，里氏木霉(Trichoderma reesei)(红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的无性型(asexual anamorph))的菌株特别突出，原因在于它们分泌大量(> 50g/L)可用于工业发酵之酶的能力。不同的团队已经开发出了不同的高产率(和“超产的(hyperpiOductive) ”)木霉属(Trichoderma)菌株系，几乎都来源于QM6a,其为“野生型”环境菌株(Bailey和Nevalainen, 1981, Enzyme Microb.Technol.3: 153 ;Vitikainen等，2010,BMC Genomicsll:441，以及其中的参考文献)。报道的高产率菌株的实例包括QM9414(Mandels和Andreotti，1978,Process Biochemistryl3:6)，Rut_C30 (Eveleigh 和 Montenecourt,1979, Adv.App1.Microbiol.25:57)，CL847(Durand等，1988，Enzyme Microb.Technol.10:341)和M2C38 (美国专利N0.6，015，703)。高产率菌株用于表达生物体的内源性酶以及异源性表达和分泌的蛋白质。这样的酶和蛋白包括纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、漆酶(Iaccase)和酯酶——所有这些均已经被表达用于商业目的。仍在继续努力以鉴定调节蛋白质产率的因素，从而可以作出进一步改进(Le Crom 等，2009，P.N.A.S.USA106:16151)。
[0004]高产率取决于多种因素。根据特定的菌株，碳源和给料速率(feed rate)将确定何种分泌酶的基因被诱导和/或抑制，以及所观察到的生长和酶产生速率。碳源通过转录因子及其在特定给料条件下被激活或抑制的同源启动子来发挥作用。蛋白质的表达通常由主要纤维素酶和半纤维素酶的启动子(例如，Cel6A, Cel7A, XynlIB)或其杂合体(例如Cel7A和XynllB启动子区域和分泌信号的杂合体(美国专利N0.6，015，703))来启动。调节这些启动子的转录因子已经部分地被鉴定和表征。一旦启动转录和翻译，分泌依赖于特定的信号序列和细胞的分泌机构(secretion apparatus),这两者均被操控以提高生产率。可以操控从碳源到分泌的所有步骤以通过鉴定和改变调节蛋白和控制功能级联的网络来提闻生广率。
[0005] 通过选择碳源可以部分地控制纤维素酶和半纤维素酶的表达(Ι?πι?η等，1997, Appl.Environ.Microbiol.63:1298 ；Mach 和 Zeilinger,2003, Appl.Microbiol.Biotechnol.60:515 ;Schmoll 和 Kubicek, 2003, Acta Microbiologica et ImmunologicaHungarica50:125 ；Ahamed 和 Vermette,2009, Bioresources TechnologylOO:5979)。通常来说，纤维素和β -连接的葡寡糖(gluco-oligosaccaride)(例如纤维二糖、槐糖、龙胆二糖、昆布二糖、乳糖)诱导纤维素酶及其辅助酶的表达(Mandels等，1962，J.Bacteriology83:400 ；Sternberg 和 Mandels，1979, J.Bacteriology139:761 ；Foreman 等，2003，J.Biol.Chem.278:31988)。类似地，木聚糖、木糖、木寡糖(xylo-oIigosaccharide)将诱导半纤维素酶及其辅助酶(Royer 和 Nakas, 1990, Appl.Environ.Microbiol.56:2535 ；Zeilinger 等，1996，J.Biol.Chem.271:25624)。葡萄糖抑制T具有功能crel基因的细胞的(半)纤维素酶表达(Ilmen等，1996,Mol.Gen.Genet.251:451) ο氮对细胞繁殖和形态具有公知的作用(Steyaert等，2010a，Fungal Biologyll4:179 ;2010b，Microbiologyl56:2887)，其进而又实现了大规模生产结果(Ahamed和Vermette，2009，Bioresources TechnologylOO:5979)。氮还在纤维素酶生产中起作用。例如，有报道称，在含有组成性激活的氮调节因子AreA的黑曲霉(A.niger)菌株中，提高了纤维素酶的产生，而在釆用铵作为氮源的纤维素诱导培养物中培养的AreA丧失功能的突变体中，纤维素酶的产生降低(Lockinton 等，2002，Fungal Genet.Biol.37:190)。
[0006]已经鉴定了数种与纤维素酶和半纤维酶基因的启动子区域相互作用并调节其表达的主要转录因子(Mach 和 Zeilinger, 2003，Appl.Microbiol.Biotechnol.60:515 ；Schmoll 和 Kubicek，2003， Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica50:125 ；Kubicek 等，2009，Biotechnology for Biofue I s2:19 以及其中的参考文献)。当细胞培养于葡萄糖和其他非诱导性碳水化合物中时，Crel(分解代谢物抑制，cataboliterepression)介导 碳分解代谢物抑制并阻断纤维素酶的表达(Ilmen等，1996，Mol.Gen.Genet.251:451)。Crel的基因在高生产率菌株中通常是有缺陷或缺失的(Seidl等，2008，BMC Genomics9:327 ; NakaH-SetSlS 等，2009，Appl.Environ.Microbiol.75:4853)。然
而，近来的数据表明Crel还可以通过在纤维素酶和半纤维素酶表达中所涉及的其他因子在上调中起作用(Portnoy等，2011 ,Eukaryotic CelllO:262)。Xyrl (木聚糖酶调节因子，lllanase regulator)为启动纤维素酶和半纤维素酶表达的必需转录激活因子(Sticker等，2006，Eukaryotic Cell5:2128 ;Stricker 等，2007，FEBS Letters581:3915 ；Stricker等，2008，Appl.Microbiol.Biotechnol.78:211) oAcel (纤维素酶表达激活因子，activatorof cellulase expression)已经被鉴定为纤维素酶和木聚糖酶抑制因子(Aro等，2003，Appl.Environ.Microbiol.69:56)。相反，Ace2表现为在特定条件下纤维素酶表达的激活因子(Aro等，2001，J.Biol.Chem.276:24309)。Hap复合物(血红素活化蛋白(hemeactivator protein)，根据在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中最先鉴定的同源蛋白而命名)已经显示与表达所需的纤维素酶启动子中的调节区域相互作用(Zeilinger等，2001，Mol.Genet.Genom.266:56)。不能被诱导产生高于基础水平的纤维素酶的木霉属菌株已经被分离出来，推测是由于纤维素酶表达的这些全局调节因子中的一种或更多种的缺陷所导致(Nevalainen 和 Palva, 1978，Appl.Environ.Microbiol.35:11 ；Torigoi 等，1996，Genel73:199)。
[0007]尽管与诱导和抑制相关的给料选择和转录因子将确定被转录的特定mRNA的水平，但是给料速率和特定菌株的分泌能力将确定料中有多少碳进入了所分泌的蛋白而不是转化成了生物质，以及在反馈信号导致分泌速率消失之前有多少和多长的蛋白质可以从细胞中分泌。提高给料速率将提高蛋白质生产率，直至某一点，超过该点，生产率将陡然降低，料将主要用于制造生物质(Pakula等，2005，Microbiologyl51:135)。在导致高生产率的条件下发酵的菌株可能受到分泌途径能力的限制。真菌细胞对分泌途径组分的表达提高产生天然响应(Saloheimo 等，1999，Mol.Gen.Genet.262:35 ;2004，Appl.Environ.Microbiol.70:459)。通过分泌途径中所涉及的基因有意地过表达，可以实现分泌的提高(Kruszewska 等，1999, Appl.Environ.Microbiol.65:2382 ；2008, Acta BiochimicaPolonica55:447)。最后，分泌应激可以导致分泌途径中的蛋白错误折叠，其将激活未折叠的蛋白响应(unfolded protein response, UPR),进而下调分泌蛋白的表达(Saloheimo等，2003, Molecular Microbiology 47:1149 ;Valkonen 等，2004, Mol.Genet.Genom.272:443)。木霉属中的另外的响应(分泌应激下的抑制(repression under secretion stress,RESS))进一步下调分泌蛋白的表达(Pakula 等，2003, Mol.Genet.Genom.272:443)。
[0008]文献中已经报道了由突变引起的、不能产生纤维素酶的木霉属分离物。Torigoi等(1996)先前已经表征了通过对QM6a进行UV辐照获得的四种纤维素酶缺陷的木霉菌属突变体(QM9136、QM9977、QM9978和QM9979) ((Mandels等，1971)。当用槐糖或纤维素诱导时，所有所描述的突变体都无法产生可检出的cel5A、cel6A、cel7A和cel7B转录物。这些突变体中的一种(QM9979)无法产生纤维素，这与其不能摄取纤维素酶二糖诱导剂相关，并且通过功能分析假设其携带缺陷/突变的β_糖苷通透酶(Kubicek等，1993)。然而，没有描述所涉及的特定基因的身份和所涉及突变的性质。
[0009]本发明基于对编码多肽之基因的鉴定，所述多肽参与对丝状真菌长时间发酵之后出现的可遗传的纤维素酶缺陷表型的发生进行调节。所鉴定的基因还调节该真菌耐受能够实现高生产率之不利(aggressive)发酵环境的能力。本文中所公开的是用于修饰或调整真菌细胞的手段，以通过降低或提高基因的表达来满足不同酶产生条件的特定要求。
[0010]发明概述
[0011]本发明涉及用于产生生物质降解酶的真菌细胞和发酵方法。
[0012]第一方面， 本发明提供了能够产生一种或更多种生物质降解酶并且包含拷贝数或表达提高的编码多肽之多核苷酸的分离的真菌细胞，所述多肽与该所述分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞相比表现出与SEQ ID NO:1具有约40%至100%的同一性或者与SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 11 或 SEQID NO:14的氨基酸序列具有约50%至约100%的同一性。
[0013]在一个实施方案中，所述真菌细胞与所述分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞相比包含拷贝数或表达提高的多核苷酸，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下任意一种杂交:(i)SEQ ID NO:2的多肽编码序列；(ii)包含SEQ ID NO:2之多肽编码序列的基因组DNA序列；和(iii)⑴或(ii)的全长互补链，其中高严格条件是在5XSSPE、0.3% SDS、200 μ g/mL经剪切和变性的鲑精DNA和50%甲醛胺中在42°C下预杂交和杂交12至24小时，杂交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分钟。
[0014]在另一实施方案中，所述真菌细胞是以下的物种:木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、键刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)、脉抱菌属(Neurospora)、毛壳菌属(Chaetomium)、枝顶抱菌属(Acremonium)、小丛壳属(Glomerella)、毁丝霉属(Myceliophthora)、侧抱霉属(Sporotrichum)、梭抱壳属(Thielavia)、金孢子菌属(Chrysosporium)、棒囊壳属(Corynascus)、木节霉属(Ctenomyces)、轮枝抱菌属(Verticillium)、虫草属(Cordyceps)、丛赤壳属(Nectria)或大角间座壳属(Magnaporthe)。例如，所述真菌细胞可以是:里氏木霉(T.reesei)、红褐肉座菌(H.jecorina)、黑曲霉(A.niger)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.0rzyae)、构巢曲霉(A.nidulans)、尖孢镰刀菌(F.0xysporum)、粗糙脉孢菌(N.crassa)、嗜热毛壳菌(C.thermophilum)、嗜热枝顶抱菌(A.thermophilum)、禾生小丛壳菌(G.graminicola)、嗜热毁丝霉(M.thermophila)、嗜热侧孢霉(S.thermophile)、太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica)、嗜热金孢子菌(C.thermophile)、大丽花轮枝孢菌(V.dahlia)、蛹虫草(C.militaris)、红球丛赤壳菌(N.heamatococca)或稻痕病菌(M.0rzyae)。
[0015]另一方面，本发明提供用于产生一种或更多种生物质降解酶的发酵方法，其包括提供如上所述的分离的真菌细胞，将所述分离的真菌细胞在浸没的液体补料分批(fed-batch)或连续培养物中培养；以及为该补料分批或连续培养物提供包含碳源的给料液。与利用亲本真菌细胞的等同方法相比，这样的发酵方法导致真菌细胞群的cel-表型降低 50%。
[0016]在一个实施方案中，如上所述的发酵方法的特征在于，其持续生产率与利用所述分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞的等同方法相比，提高了至少50%。
[0017]第三方面，本发明涉及能够产生一种或更多种生物质降解酶的分离的真菌细胞，其包含与所述分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞相比拷贝数或表达降低的编码多肽之多核苷酸，所述多肽表现出与SEQ ID NO:1具有约40%至100%的同一性；或者与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ IDNO:14的氨基酸序列具有约50%至约100%的同一性。
[0018]在一个实施方案中， 所述真菌细胞包含与该分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞相比拷贝数或表达降低的多核苷酸的，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下任意一种杂交:(i)SEQ ID NO:2的多肽编码序列；(ii)包括SEQ ID NO:2之多肽编码序列的基因组DNA序列；和(iii)⑴或(ii)的全长互补链，其中高严格条件是在5XSSPE、0.3% SDS、200 μ g/mL经剪切和变性的鲑精DNA和50%甲醛胺中在42°C下预杂交和杂交12至24小时，杂交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分钟。
[0019]在另一个实施方案中，所述真菌细胞是以下的物种:木霉属、肉座菌属、曲霉属、镰刀菌属、青霉菌属、脉孢菌属、毛壳菌属、枝顶孢菌属、小丛壳属、毁丝霉属、侧孢霉属、梭孢壳属、金孢子菌属、棒囊壳属、栉霉属、轮枝孢菌属、虫草属、丛赤壳属或大角间座壳属。例如，所述真囷细胞可以是:里氏木霉、红揭肉座囷、黑曲霉、烟曲霉、米曲霉、构桌曲霉、尖抱镰刀菌、粗糙脉孢菌、嗜热毛壳菌、嗜热枝顶孢菌、禾生小丛壳菌、嗜热毁丝霉、嗜热侧孢霉、太瑞斯梭孢壳霉、异梭孢壳霉、嗜热金孢子菌、大丽花轮枝孢菌、蛹虫草、红球丛赤壳菌或稻瘟病菌。
[0020]第四方面，本发明提供用于产生一种或更多种生物质降解酶的发酵方法，其包括:提供第三方面的分离的真菌细胞；将所述分离的真菌细胞在浸没的液体补料分批或连续培养物中培养；以及为该补料分批或连续培养物提供包含碳源的给料液。这样的发酵方法与利用亲本真菌细胞的等同方法相比，表现出最大单位生产率(specific productivity, qp)提高至少约50%。在该发酵方法的一个实施方案中，以每升每小时至少0.4克碳的碳添加速率提供所述给料液。在另一实施方案中，以每升每小时至少0.8克碳的碳添加速率提供所述给料液。
[0021]在上述任一发酵方法的另一实施方案中，培养步骤期间所提供的给料液中的碳源由以下组成:一种或更多种纤维素酶诱导性碳水化合物(例如纤维素、乳糖、纤维二糖、槐糖、龙胆二糖，及其组合)、一种或更多种来自于半纤维素的碳水化合物(例如木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、D-木糖、木二糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖，及其组合)、一种或更多种非诱导碳水化合物(例如葡萄糖、右旋糖、鹿糖、糖蜜(molasses)、果糖，及其任意组合)；纤维素酶诱导和来自于半纤维素的碳水化合物的混合物，纤维物酶诱导和非诱导性碳水化合物的混合物，来自于半纤维素和非诱导性碳水化合物的混合物，或纤维素酶诱导、来自于半纤维素和非诱导性碳水化合物的混合物。
[0022]本发明的分离的真菌细胞和发酵方法产生一种或更多种生物质降解酶。在一些实施方案中，所述一种或更多种生物质降解酶选自:纤维素酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纤维素酶增强蛋白、木聚糖酶、木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、β -甘露聚糖酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、木质素降解酶及其任意组合。
[0023]在一些实施方案中，一种或更多种生物质降解酶中的至少一种为真菌细胞内源性的。在另一些实施方案中，一种或更多种生物质降解酶中的至少一种是真菌细胞异源性的。
[0024]最后一方面，本发明提供用于用生物质降解酶处理生物质底物的方法，所述酶由上文所述的发酵方法 或分离的真菌细胞产生。在一些实施方案中，生物质底物为木素纤维素原料。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1的显示了用于从分离的里氏木霉细胞缺失PtaB基因的pJET-ptaB-delta_ura3 载体图。PptaB-ptaB 启动子和 5’ 侧翼序列；TptaB_ptaB 终止子和3’侧翼序列；ura3-编码里氏木霉乳清酸核苷-5'- 一磷酸脱羧酶的真菌选择标记盒；AmpR-赋予氨节青霉素抗性的细菌选择标记；rep(pMBl)-复制起始点；pLacUV5_LacUV5启动子。
[0026]图2描述了用PCR证实从里氏木霉转化体缺失了 PtaB基因。A-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶，采用PtaB启动子和终止子特异性引物以及从亲本M2C38aux株(泳道2)和推定PtaB缺失株(泳道4-10)分离的基因组DNA。泳道3为空白。在泳道I上加载了 DNA大小标记物(Fermentaslkb plus ladder)。每个DNA标记物片段的大小在左边显示。右边的黑色箭头表示缺失了 PtaB的、对应于预期大小片段的条带。B-在ptaB缺失的菌株中的基因组ptaB座位(顶部)和完整ptaB座位(底部)的示意图。PptaB-ptaB启动子和5’侧翼序列、TptaB-ptaB终止子和3’侧翼序列、ptaB_PtaB蛋白编码序列、ura3_编码里氏木霉乳清酸核苷-5'-—磷酸脱羧酶的真菌选择标记盒。PCR扩增中使用的引物用杂交位点处的线箭头表示；PCR产物用点线表示，每个片段的大小在每条线的顶部表示。
[0027]图3显示了 ptaB缺失菌株⑷及其亲本菌株⑶的试验性发酵曲线(profile)。如实施例5中所述实施补料分批发酵，碳添加速率为每升每小时约I克碳。发酵开始后每24小时测量生物质(短划线、空心符号)和总蛋白质(实线、实心符号)的积累。作为每克生物质每小时产生的分泌蛋白的mg数测量单位生产率(点线和实心三角形)。
[0028]图4显示了 ptaB缺失菌株⑷及其亲本菌株⑶的试验性发酵曲线。如实施例5中所述实施补料分批发酵,碳添加速率为每升每小时~0-4克碳。发酵开始后每24小时测量生物质(点线，空心菱形)和总蛋白质(实线、实心圆形)的积累。作为每克生物质每小时所分泌的蛋白mg数测量单位生产率(点线和实心三角形)。
[0029]图5显示了在ptaB缺失菌株及其亲本菌株的补料分批发酵结束时不产生纤维素酶(cel-)表型的累积。发酵开始后165小时收集生物质样品。按照实施例6所述，评价纤维素酶产生表型。
[0030]图6 的显示了含有 ptaB 过表达盒的 pTrbxll-ptaB-7at_ura3 载体图。Pbxll-bxll启动子；Tcel7a_cel7a 终止子，ptaB cds-PtaB 编码序列；Pura3, ura3cds, Tura3_ 编码里氏木霉乳清酸核苷-5'-—磷酸脱羧酶的真菌选择标记盒(分别为启动子、编码序列和终止子)；AmpR-赋予氨苄青霉素抗性的细菌选择标记。
[0031]图7显示了 ptaB过表达菌株(A)及其亲本菌株(B)的试验性发酵曲线。如实施例5中所述实施补料分批发酵，碳添加速率为每升每小时~1.0g碳，使用纤维素酶诱导和来自于半纤维素的碳水化合物的混合物。发酵开始后每24小时测量生物质(点线，空心菱形)和总蛋白质(实线、实心圆形)的积累。作为每小时每g真菌细胞产生的蛋白质的mg数测量单位生产率(点线和实心三角形)。
[0032]图8显示了 ptaB过表达菌株(A)及其亲本菌株(B)的试验性发酵曲线。如实施例5中所述实施补料分批发酵，碳添加速率为每升每小时~0.4g碳，使用纤维素酶诱导和来自于半纤维素的碳水化合物 的混合物。发酵开始后每24小时测量生物质(点线，空心菱形)和总蛋白质(实线、实心圆形)的积累。作为每小时每克真菌细胞产生的蛋白质的mg数测量单位生产率(点线和实心三角形)。
[0033]图9显示了在ptaB过表达菌株㈧及其亲本菌株⑶的补料分批发酵结束时不产生纤维素酶(cel-)表型的累积。分别从高和低CAR发酵开始后的168小时和144小时收集生物质样品。按照实施例6所述，评价纤维素酶产生表型。
[0034]图10显示了 SEQ ID NO:1与其他真菌物种的同源氨基酸序列的比对。总体同一性为42.77%。用框显示相同的氨基酸，在比对下显示一致的序列。采用DNAman程序进行比对，空位罚分为3，K串(K-tuple)为2。
[0035]图11显示了十三种真菌PtaB样蛋白的氨基酸序列彼此之间的同一性矩阵。
[0036]发明详述
[0037]本发明涉及用于产生生物质降解酶的真菌细胞和发酵方法。
[0038]更特别地，本发明涉及分离的真菌细胞和利用所述分离的真菌细胞产生一种或更多种生物质降解酶的发酵方法，所述真菌细胞表现出由SEQ ID NO:1编码之多肽的表达或活性的提高或降低。
[0039]以下描述仅仅是通过举例的一个优选实施方案，其对实施本发明所必需特征的组合没有限制。所提供的标题并不意味着对本发明不同实施方案的限制。术语例如“包含”和“包括”并不旨在限制。此外，没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种，并且“或”意味着“和/或”，除非另有说明。数值范围包括了限定该范围的数值。
[0040]除非本文另有说明，否则本发明的实施涉及分子生物学、发酵、微生物学和相关领域中常用的、本领域技术人员知晓的常规技术。尽管在本发明的实施或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但是本文描述了一些合适的方法和材料。除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则核酸从左向右按照5’向3’的方向书写；氨基酸序列从左向右按照氨基端向羧基端的方向书写。
[0041]本文中提及的所有专利和出版物(包括所述专利和出版物中所公开的所有序列)明确地通过引用并入本文。
[0042]分离的真菌细胞
[0043]本文中使用的“分离的真菌细胞”是已经经过修饰以与其来源的亲本真菌细胞相t匕，表现出编码PtaB样蛋白之多核苷酸的表达或拷贝数提高或降低或者PtaB样蛋白的表达提高或降低的真菌细胞。
[0044]本文中使用的“亲本真菌细胞”是指没有经过修饰以表现出编码PtaB样蛋白之多核苷酸的表达或拷贝数提高或降低或者PtaB样蛋白的表达提高或降低的真菌细胞。亲本真菌细胞可以是见于自然界的、没有经过任何突变或遗传修饰的“野生型”或“天然”真菌细胞，或者其可以是包含一种或更多种遗传修饰的真菌细胞，包括但不限于重组真菌细胞。例如，亲本真菌细胞可以包含一个或更多个突变，其在诱导条件或在例如葡萄糖的抑制性碳水化合物存在(包括例如ere基因的突变)的情况下或在分泌应激(包括例如hacl或irel基因的突变)下允许生物质降解酶之产生提高。
[0045]亲本真菌细胞还可以被修饰从而使一种或更多种生物质降解酶的产生提高或降低，或降低蛋白酶的产生。因此，“分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞”基本上与分离的真菌细胞相同，只是编码PtaB样蛋白的多核苷酸的表达或拷贝数提高或降低，或者PtaB样蛋白的表达提高或降低。
[0046]本文中使用的“重组真菌细胞”是通过故意的人为干预或“重组手段”将一个或更多个多核苷酸引入其中的真菌细胞。
[0047]本文中使用的“遗传修饰”或“突变”包括但不限于，(a)例如通过随机突变和选择、适应或表观遗传(epigenetic)改变而对真菌细胞的基因组DNA序列或结构的可遗传改变，和(b)使用重组手段将多核苷酸序列引入真菌细胞的遗传修饰。
[0048]对于本文中所述目的而言，术语“拷贝数提高”是指，与分离的真菌细胞所来源于的亲本真菌细胞的相同基因的拷贝数相比，分离的真菌细胞中存在给定基因的至少多肽编码序列的至少一个额外拷贝。例如，与亲本真菌细胞的相同基因的拷贝数相比，分离的真菌细胞可以含有给定基因的至少多肽编码序列的1、2、3、4、5、10或更多个的额外拷贝数。给定基因的额外拷贝可以被整合至分离的真菌细胞的基因组，或者可以存在于分离的真菌细胞中的一个或更多个独立复制的载体或质粒中。
[0049]对于本文中所述目的而言，术语“拷贝数降低”是指，与分离的真菌细胞所来自于的亲本真菌细胞的相同基因的拷贝数相比，分离的真菌细胞的基因组中给定基因的至少多肽编码序列的拷贝至少少一个。
[0050]本领域普通技术人员可以通过公知的手段测量基因拷贝数的调节，例如对基因组DNA 进行比较基因组杂交(comparative genomic hybridization, CGH)、Southern 印迹杂交或定量实时PCR(qRT-PCR)。
[0051] 对于本文中所述目的而言，术语“表达提高”或“过表达”意味着，与在培养基组成、温度、pH、细胞密度和培养时间的相同或几乎相同条件下生长的亲本真菌细胞相比，分离的真菌细胞在给定基因所编码的转录物或多肽水平或者所得到的多肽活性表现出至少约1.2倍的提高。例如，与在相同或几乎相同的培养条件下生长或培养的亲本真菌细胞相比，分离的真菌细胞给定基因所编码的转录物或多肽水平或者所得到的多肽的活性至少提高1.3、1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0 或 10 倍或更多。
[0052]对于本文中所述目的而言，术语“表达降低”意味着，与在培养基组成、温度、pH、细胞密度和培养时间相同或几乎相同条件下生长的亲本真菌细胞相比，分离的真菌细胞在给定基因所编码的转录物或多肽水平或者所得到的多肽的活性表现出至少约20%的降低。例如，与在相同或基本相同的培养条件下生长或培养的亲本真菌细胞相比，分离的真菌细胞中给定基因所编码的转录物或多肽水平或者所得到的多肽的活性表现出可至少降低20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或其间的任意量。
[0053]本领域普通技术人员还可以通过公知手段对选定mRNA或转录水平进行分析，从而测量基因表达的调节，例如定量实时PCR(qRT-PCR)、Northern印迹杂交、或使用cDNA或寡阵列杂交进行全基因表达谱测定。
[0054]可以用例如免疫化学方法例如使用单个酶特异抗体的ELISA (Van ffeemen,B.K.等(1971)FEBS Lettersl5:232-236)或者通过特异性检测和测量多肽活性的测定来测量给定基因的多妝广生的提闻。
[0055]在本发明的至少某些实施方案中，分离的真菌细胞中编码PtaB样蛋白的基因拷贝数或表达的提高或降低可以通过大量的随机突变和选择技术来产生。例如，亲本真菌细胞可以经受辐射或者化学诱变以产生突变细胞文库，然后对其筛选以获得期望的经改变的表型或基因型。随机突变和选择技术还包括“适应进化技术”或“进化工程技术”。本文中使用的术语“适应进化技术”是指采用的通过应用暴露于环境挑战而影响真菌细胞或生物体的表型或遗传谱的任何方法或程序，之后选择经修饰和/或分离的真菌细胞，其具有期望的经改变的表型 和对应的经改变的遗传谱。
[0056]本文中使用的“随机突变和选择”是指通过天然或人工手段(包括使真菌细胞接受辐射或化学诱变)产生突变株文库的过程，之后筛选所需的经改变的表型。适应，也称为“适应进化”或“进化工程”，是指采用的通过应用暴露于环境挑战而影响真菌细胞表型或遗传谱的任何方法或程序，之后选择具有期望的经改变表型的经修饰真菌细胞。“表观遗传改变”定义为改变生物体一个或更多个基因表达的染色质结构的可遗传改变，包括但不限于:组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、泛素化(ubiquitination)、磷酸化或苏素化(sumoylation)和DNA甲基化。
[0057]在本发明的至少一些实施方案中，可以通过多种遗传工程技术或重组手段中的任何一种实现分离的真菌细胞中编码PtaB样蛋白的基因的拷贝数或表达的提高或降低。本文中使用的“遗传工程技术”是指直接操控生物体基因或基因组的数种公知技术中的任意一种。例如，基因敲除(将不起作用的DNA序列插入生物体的染色体中，通常替换或中断内源性的起作用序列)、基因敲入(将编码蛋白质的DNA序列插入生物体的染色体)、和基因敲低(插入编码反义RNA或小干扰RNA (即RNA干扰(RNAi))的DNA序列)技术是本领域中公知的。
[0058]降低或减低基因表达的方法是本领域中公知的，可以使用本领域中多种已知方法中的任意一种进行。例如，可以对基因进行修饰以破环转录或翻译启动序列，或在编码多肽的转录物中引入移码突变。其他降低基因表达的方法包括转录后RNA沉默法，例如反义RNA和RNA干扰(RNAi)。反义技术涉及引入与靶基因的转录产物互补的核苷酸序列，从而所述互补反义核苷酸序列与靶基因转录杂交，由此降低或消除可以被翻译成蛋白质的转录产物的数目。表达反义 RNA 的实例在 Ngiam 等(2000) Appl.Environ.Microbiol.66 (2):775-82 ;和 Zrenner 等(1993)Planta.190(2):247-52 中公开。RNAi 方法包括本领域人员知晓的双链RNA(dsRNA)、短发夹RNAs (shRNAs)和小干扰RNA (siRNA)，例如Fire等(1998)Nature391:806-11 ；Paddison 等(2002)Genes Dev.16:948-58 ；和 Miyagishi 等(2002)Nat.Biotechnol.20:497-500 的技术。
[0059]降低或减低基因表达的方法还包括部分或完全缺失该基因、破坏或替换该基因的启动子从而大大降低或甚至抑制该基因的转录。例如，该基因的启动子可以被弱启动子替换，例如美国专利N0.6，933，133中所举例的。这样，当弱启动子与内源性多肽的编码序列可操作连接时，该基因的转录将被大大降低或甚至抑制。
[0060]在一些实施方案中，分离的真菌细胞已经经过遗传修饰从而至少部分地缺失编码PtaB样蛋白的一个或更多个基因。本文中使用的基因缺失或缺失突变是组成该基因的一个或更多个核苷酸丢失的突变。因此，缺失是遗传材料的丢失或替换，其导致构成该基因的DNA序列的全部或部分破坏。可以缺失任意数量的核苷酸，从一个碱基到整个染色体。在一些实施方案中，考虑完全 或接近完全缺失基因序列。例如，基因的缺失可以是缺失至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100% 的基因。
[0061]在一些实施方案中，分离的真菌细胞经过遗传修饰以提高PtaB样蛋白的表达。PtaB样蛋白可以是与真菌细胞同源或异源的。对于本文中的目的而言，同源PtaB样蛋白由与真菌细胞相同或分类学上等同的分类物种天然的多核苷酸序列编码，或者从其分离或从其得到。而且，正如本领域技术人员所认识的，同源蛋白可以含有一个或更多个插入、缺失和替换，仍然被认为是“来自于”与分离的真菌细胞相同的物种。所述一个或更多个插入、缺失和替换可以导致同源PtaB样蛋白的表达或活性的提高或降低。类似地，编码同源PtaB样蛋白的多核苷酸可以含有一个或更多个插入、缺失和替换(包括优化密码子使用而不改变所编码蛋白的序列的替换)。
[0062]异源PtaB样蛋白由与真菌细胞不同的分类物种天然的多核苷酸序列编码，或者从其分离或从其得到。而且，正如本领域技术人员所认识的，异源蛋白可以含有一个或更多个插入、缺失和替换，仍然被认为是“来自于”与分离的真菌细胞不同的分类学物种。所述一个或更多个插入、缺失和替换可以导致异源PtaB样蛋白的表达或活性的提高或降低。类似地，编码异源PtaB样蛋白的多核苷酸可以含有一个或更多个插入、缺失和替换(包括优化密码子使用而不改变所编码蛋白的序列的替换)。
[0063]本文中使用的就多核苷酸序列而言的“来自于”是指使用本领域技术人员知晓的一种或更多种分子生物学技术将靶多核苷酸序列分离出来，包括但不限于:多肽或氨基酸序列的逆翻译、克隆、亚克隆、PCR扩增、体外合成等。而且，正如本领域技术人员所认识的，来自于靶多核苷酸序列的多核苷酸序列可以通过一个或更多个插入、缺失和替换而修饰，其仍然被认为“来自于”靶核苷酸序列。所述一个或更多个插入、缺失和替换可以导致该多核苷酸序列所编码的目标蛋白的表达或活性提高或降低，并且可以位于启动子序列、5’或3’未翻译区内，或者位于目标蛋白的编码区内。[0064]本文中就多核苷酸序列而言的“分离的”或“分离”意指通过将该核酸序列从与其自然缔合的某些或全部天然核酸序列中分离出来而从其天然状态发生改变。
[0065]在另一些实施方案中，可以用PtaB遗传构建体转化真菌细胞从而对真菌细胞进行遗传修饰。本文中使用的“PtaB遗传构建体”是指分离的多核苷酸，其包含使PtaB样蛋白表达提高或降低所必需的元件。这些元件可以包括但不限于:编码PtaB样蛋白的多核苷酸序列(编码序列)、与编码序列可操作连接并且包含引导编码序列转录和翻译之多核苷酸序列的启动子。
[0066]本发明的分离的真菌细胞可以进一步包含一个或更多个遗传构建体，其引导一种或更多种同源或异源生物质降解酶的产生。所述构建体包含多核苷酸要素，其包括但不限于:生物质降解酶的编码序列、与编码序列可操作连接并且包含引导编码区转录之多核苷酸序列的启动子、和编码与编码序列可操作连接的分泌信号肽的序列、以及引导将构建体同源重组到真菌细胞基因组中的靶多核苷酸序列。术语“分泌信号肽”、“分泌信号”和“信号肽”是指可以参与所分泌蛋白的成熟或前体形式的分泌的任意核苷酸和/或氨基酸序列。该信号序列相对于真菌细胞可以是内源性或外源性的。该信号序列可以通常与目标蛋白或编码另一分泌蛋白的基因连接。该信号序列还可以是含有编码分泌蛋白的两个或更多个基因的部分序列的“杂交信号序列”。
[0067]正如本领域普通技术人员所理解的，编码序列、启动子和/或分泌信号可以来自于亲本真菌细胞、不同的生物体，和/或体外合成。例如，启动子和分泌信号可以来自于编码蛋白质的一个或更多个基因，当亲本细胞在以下所限定的发酵方法中生长时所述蛋白质高表达和分泌例如编码纤维素酶、β -葡糖苷酶、纤维素酶增强蛋白、半纤维素酶及其组合的基因。相对于天然多核苷酸，这些多核苷酸元件还可以通过替代、替换、添加或消除一个或更多个核酸而改变或改造。然而，应当理解的是，本发明的实施并不限于PtaB遗传构建体的启动子的选择或者不限于表达生物质降解酶的遗传构建体的启动子和分泌信号的选择。
[0068]如上所述的遗传构建体可以含有用于鉴定被转化宿主细胞的选择标记。该选择标记可以存在于遗传构建体上，或者选择标记可以是与遗传构建体共转化的单独的分离的多核苷酸。选择标记的选择是本领域技术人员所公知的，并且包括这样的基因(合成或天然的)，所述基因向被转化细胞赋予利用通常不能被微生物代谢的代谢物的能力(例如，编码乙酰胺酶并赋予在作为唯一氮源的乙酰胺中生长的能力的构巢曲霉amdS基因)或抗生素抗性(例如，编码潮霉素-β -磷酸转移酶并赋予抗潮霉素抗性的大肠杆菌hph基因)。或者，如果真菌细胞表达很少或不表达所选择的标记物活性，那么可以将对应的基因用作标记物。所述标记物的实例包括trp、pyr4、pyrG、argB、Ieu等。对应的宿主株由此必须缺少对应于所选择的标记物的功能基因，即缺少trp、pyr4、pyrG、argB、leu等的表达。
[0069]遗传构建体可以含有在真菌细胞中有功能的转录终止子，正如本领域技术人员所知晓的。转录终止子可以位于编码序列的正下游。本发明的实施不受制于足以引导宿主细胞中转录终止的转录终止子 的选择。
[0070]遗传构建体可以含有位于本文所述的多种序列元件之间的额外多核苷酸序列。这些序列可以是天然或合成的，可以在构建体编码的蛋白质中添加一个或更多个氨基酸。本发明的实施不受存在额外多核苷酸序列的限制，所述额外多核苷酸序列位于真菌细胞中遗传构建体的多种序列元件之间。
[0071]将遗传构建体引入真菌细胞的方法对于本领域技术人员来说是熟知的，包括但不限于:用氯化钙处理真菌原生质体从而使细胞膜变薄弱、添加聚乙二醇从而使细胞膜融合、通过电穿孔使细胞膜去极化、或使用颗粒枪通过微弹轰击(microprojectilebombardment)射出构建体使其通过细胞壁和膜。本发明的实施不受将遗传构建体引入真菌细胞的方法的限制。
[0072]在一些实施方案中，分离的真菌细胞可以是以下属之物种的丝状真菌:木霉属、肉座菌属、曲霉属、镰刀菌属、青霉菌属、脉孢菌属、毛壳菌属、枝顶孢菌属、小丛壳属、毁丝霉属、侧孢霉属、梭孢壳属、金孢子菌属、棒囊壳属、栉霉属、轮枝孢菌属、虫草属、丛赤壳属或大角间座壳属。例如，所述真菌细胞可以是以下真菌物种的菌株:里氏木霉、红褐肉座菌、黑曲霉、烟曲霉、米曲霉、构巢曲霉、尖孢镰刀菌、粗糙脉孢菌、嗜热毛壳菌、嗜热枝顶孢菌、禾生小丛壳菌、嗜热毁丝霉、嗜热侧孢霉、太瑞斯梭孢壳霉、异梭孢壳霉、嗜热金孢子菌、大丽花轮枝孢菌、蛹虫草、红球丛赤壳菌或稻瘟病菌。
[0073]应当理解的是，对于前述物种，不管它们为人所知的物种名称，本文中的分离的真菌细胞包括完全(perfect)和不完全(imperfect)状态，以及其他分类学等同物,例如无性型(anamorph)和有性型(teleomorph)。可以在例如 Cannon, Mycopathological 11:75-83，1990 ；Moustafa 等，Persoonial4: 173-175,1990 ；Stalpers, Stud.Myco1.24，1984 ； Upadhyay 等，Mycopatho1gia87:71-80,1984 ；Guarro 等，Mycotaxon23:419-427,1985 ；Awao 等，Mycotaxonl6:436-440,1983 ；von Klopotek,Arch.Microbiol.98:365-369,1974 ；和 Long 等，1994,ATCC Names of Industrial Fungi,ATCC,Rockville Md 中找到分类学等同物的其他实例。本领域技术人员将很容易识别适当等同物的身份。因此，应当理解的是，除非另有说明，在本公开内容中使用的特定种属和/或物种名称也指通过无性或有性关系而相关的属和物种，被认为是同义的属和物种，以及已经或者未来可能被重新分类成所声称的属或物种中的一种的那些。
[0074]PtaB样蛋白和PtaB多核苷酸
[0075]本文中使用的“PtaB样蛋白”(或“PtaB蛋白”或“PtaB”)是指表现出与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有约40%至100%同一性或者与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:14 的氨基酸序列具有约50%至约100%同一性的多肽。例如，Pta-B类蛋白可以表现出与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有 40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或 100% 的同一性或其间的任意％ 同一性，或者可以表现出与 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:11 或 SEQ ID NO:14 的氨基酸序列具有 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的同一性或其间的任意％同一性。
[0076]SEQ ID NO:I 的多妝表现出与 Conlon 等，2001, Molecular Microbiology40:361所鉴定的曲霉属PtaB基因所编码的多肽具有显著的序列同源性(“pta”代表“推定转录激活子(putative transcriptional activator ) ”。在选择用于抑制areA (曲霉属中氮代谢的主要调节子)突变的曲霉属菌株中，曲霉中的Pta基因被发现与areB (编码氮代谢调节子的基因)融合。基因ptaA、ptaB和ptaC被鉴定为与激活抑制表型的areB融合。正如它们的名称和历史所暗示，Pta基因的实际功能是未知的。除了曲霉属之外的属的同源物通过与曲霉属原型相比进行命名，例如木霉属和毁丝霉属。被鉴定为推定PtaB同源物的真菌多肽列表及其来源生物体见表1。
[0077]表1:真菌的PtaB样蛋白
[0078]
【权利要求】
1.能够产生一种或更多种生物质降解酶的分离的真菌细胞，所述真菌细胞与所述分离的真菌细胞所来自于的亲本真菌细胞相比，表现出编码如下多肽之多核苷酸的拷贝数或表达提高，所述多肽表现出与SEQ ID NO:1具有约40%至100%的同一性，或者与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有约50%至约100%的同一性。
2.能够产生一种或更多种生物质降解酶的分离的真菌细胞，其与所述分离的真菌细胞所来自于的亲本真菌细胞相比，包含编码如下多肽之多核苷酸的拷贝数或表达的降低，所述多肽表现出与SEQ ID NO:1具有约40%至100%的同一性，或者与SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:16 的氨基酸序列具有约50%至约100%的同一性。
3.权利要求1或2所述的真菌细胞，其中所述多肽表现出与SEQID NO:USEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 或 SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有约60%至约100%的同一性。
4.权利要求1至3中任一项所述的真菌细胞，其中所述一种或更多种生物质降解酶选自:纤维素酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β_葡糖苷酶、纤维素酶增强蛋白、木聚糖酶、β -木糖苷酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、β -甘露聚糖酶、α -葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、木质素降解酶，及其组合。
5.权利要求1至4中任一项所述的真菌细胞，其中所述一种或更多种生物质降解酶中的至少一种是所述真菌细胞内源性的。
6.权利要求1至4中任一项所述的真菌细胞，其中所述一种或更多种生物质降解酶中的至少一种是所述真菌细胞异源性的。
7.权利要求1至6中任一项所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞是以下的物种:木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、键刀菌属(Fusarium)、青霉菌属(Penicillium)、脉孢菌属(Neurospora)、毛壳菌属(Chaetomium)、枝顶孢菌属(Acremonium)、小丛壳属(Glomerella)、毁丝霉属(Myceliophthora)、侧抱霉属(Sporotrichum)、梭孢壳属(Thielavia)、金孢子菌属(Chrysosporium)、棒囊壳属(Corynascus)、柿霉属(Ctenomyces)、轮枝抱菌属(Verticillium)、虫草属(Cordyceps)、丛赤壳属(Nectria)或大角间座壳属(Magnaporthe)。
8.权利要求7所述的真菌细胞,其中所述真菌细胞是:里氏木霉(T.reesei)、红褐肉座菌(H.jecorina)、黑曲霉(A.niner)、烟曲霉(A.fumigatus)、米曲霉(A.0rzyae)、构巢曲霉(A.nidulans)、尖孢镰刀菌(F.0xysporum)、粗糙脉孢菌(N.crassa)、嗜热毛壳菌(C.thermophilum)、嗜热枝顶抱菌(A.thermophilum)、禾生小丛壳菌(G.graminicola)、嗜热毁丝霉(M.thermophila)、嗜热侧孢霉(S.thermophile)、太瑞斯梭孢壳霉(T.terrestris)、异梭孢壳霉(T.heterothallica)、嗜热金孢子菌(C.thermophile)、大丽花轮枝孢菌(V.dahlia)、蛹虫草(C.militaris)、红球丛赤壳菌(N.heamatococca)或稻痕病菌(M.0rzyae)。
9.用于产生一种或更多种生物质降解酶的发酵方法，所述方法包括: (a)提供权利要求1所述的分离的真菌细胞； (b)将所述分离的真菌细胞在浸没的液体补料分批或连续培养物中培养；以及(C)为该补料分批或连续培养物提供包含碳源的给料液， 其中所述方法导致与利用所述分离的真菌细胞所来自于的亲本真菌细胞的等同方法相比，真菌细胞群中Ce 1-表型降低至少50%。
10.权利要求9所述的发酵方法，其中所述方法的特征在于持续生产率与利用所述亲本真菌细胞的等同方法相比，提高至少50%。
11.权利要求10所述的发酵方法，其中所述给料液以约0.4克碳/升/小时的碳添加速率提供。
12.用于产生一种或更多种生物质降解酶的发酵方法，所述方法包括: (a)提供权利要求2所述的分离的真菌细胞； (b)将所述分离的真菌细胞在浸没的液体补料分批或连续培养物中培养；以及 (c)为该补料分批或连续培养物提供包含碳源的给料液， 其中所述方法的特征在于最大单位生产率(qp)与利用所述分离的真菌细胞所来源的亲本真菌细胞的等同方法相比，提高至少约50%。
13.权利要求12所述的发酵方法，其中碳添加速率至少为0.8克碳/升/小时。
14.权利要求9至13中任一项所述的发酵方法，其中为培养步骤提供包含由以下组成之碳源的给料液: (a)—种或更多种纤维素酶诱导性碳水化合物； (b)一种或更多种来自于半纤维素的碳水化合物； (C) 一种或更多种非诱导性碳水化合物； (d)(a)和(b)的混合物； (e)(a)和(C)的混合物； (f)(b)和(C)的混合物；或 (g)(a)、(b)和(C)的混合物。
15.权利要求14所述的发酵方法，其中 (a)所述纤维素酶诱导性碳水化合物选自:纤维素、乳糖、纤维二糖、槐糖、龙胆二糖，及其组合； (b)所述来自于半纤维素的碳水化合物选自:木聚糖、阿拉伯木聚糖、木寡糖、阿拉伯木寡糖、D-木糖、木二糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-半乳糖，及其组合；以及 (c)所述非诱导性碳水化合物选自:葡萄糖、右旋糖、蔗糖、糖蜜、果糖、甘油、一种或更多种有机酸，及其任意组合。
16.用于水解生物质底物的方法，其包括将所述底物与由权利要求9至15中任一项所述的发酵方法产生的生物质降解酶接触。
17.用于水解生物质底物的方法，其包括将所述底物与由权利要求1至8中任一项所述的真菌细胞产生的生物质降解酶接触。
18.权利要求16或17的方法，其中所述底物为木素纤维素。
19.能够产生一种或更多种生物质降解酶的分离的真菌细胞，所述真菌细胞与所述分离的细胞所来自于的亲本真菌细胞相比，表现出多核苷酸的拷贝数或表达提高，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下任一种杂交:(i)SEQ ID NO:2的多肽编码序列，(ii)包括SEQ ID NO:2之多肽编码序列的基因组DNA序列，以及(iii)⑴或(ii)的全长互补链，其中高严格条件为在5XSSPE、0.3% SDS、200y g/mL经剪切和变性的鲑精DNA、以及50%甲酰胺中在42°C下预杂交和杂交12至24小时，杂交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分钟。
20.能够产生一种或更多种生物质降解酶的分离的真菌细胞，其与所述分离的真菌细胞所来自于的亲本真菌细胞相比，包含多核苷酸的拷贝数或表达降低，所述多核苷酸在至少高严格条件下与以下任一种杂交:(i) SEQ ID NO:2的多肽编码序列，(ii)包含SEQ IDNO:2之多肽编码序 列的基因组DNA序列，以及(iii)⑴或(ii)的全长互补链，其中高严格条件为在5XSSPE、0.3%SDS、200y g/mL经剪切和变性的鲑精DNA、以及50%甲酰胺中在42°C下预杂交和杂交12至24小时，杂交后用2XSSC、0.2% SDS在65°C下清洗3次，每次15分钟。
【文档编号】C12N9/14GK103987838SQ201280061415
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2011年12月14日
【发明者】菲利普·J·迪弗雷纳, 亚当·H·科尔维尔, 芭芭拉·弗吕祖克, 洛雷塔·古迪奈特-萨维奇, 克里斯托弗·M·D·欣德勒, 博古斯瓦夫·普洛赫, 约翰·J·托马舍克 申请人:艾欧基能源公司