被加工为发酵木糖和阿拉伯糖的啤酒酵母的遗传修饰菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供微生物能将阿拉伯糖发酵为期望的产物诸如乙醇。在一些实施方式中，生物也能发酵木糖。在一些实施方式中，生物能发酵阿拉伯糖和木糖，及表达一种或更多纤维素酶。
【专利说明】被加工为发酵木糖和阿拉伯糖的啤酒酵母的遗传修饰菌株
【【背景技术】】
[0001]能量转变，利用及获取成为我们的时代的许多大挑战(包括与可持续性，环境质量，安全及贫困关联的那些)的基础。需要新出现技术的新应用，以应对这些挑战。生物技术，最有力的新出现技术之一，可引起重要新能量转变过程。植物生物质和其衍生物是将能量生物学转变为对人道有用的形式的资源。
[0002]在植物生物质形式之中，木质纤维素生物质(“生物质”)特别良好适合于能量应用，因为其大规模利用度，低成本和环境上良性生产。尤其是，基于纤维素生物质的许多能量产生和利用循环在整个生命周期具有接近O的温室气体排放。阻碍自生物质原料更广泛产生能量的主要障碍是克服反抗生物质物质转变为有用的产物的低-成本技术的一般性缺失。木质纤维素生物质含有碳水化合物级分(例如，纤维素和半纤维素)包括戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)，其可转变为乙醇或其他产物诸如乳酸和乙酸。为了转变木质纤维素级分，必需将纤维素，半纤维素和戊糖最终转变为单糖；此转变步骤历来是个问题。
[0003]涉及酶促或微生物水解的生物质处理方案通常涉及4个生物学介导的转化:(I)产生解糖酶(纤维素酶和半纤维素酶)；(2)将存在于预处理的生物质中的碳水化合物组分水解为糖；(3)发酵己糖(例如，葡萄糖，甘露糖和半乳糖)；及(4)发酵戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)。这4个转化在被称为巩固生物处理(CBP)的工艺配置中在单步骤发生，其区别于其他欠高度整合的配置在于其不涉及用于纤维素酶和/或半纤维素酶产生的专门的加工步骤。
[0004]CBP提供相 比特征为专门的纤维素酶产生的过程更低成本和更高效率的潜力。益处部分来自避免的资本成本，底物和其他原材料，及与纤维素酶产生关联的实用性。此外，几个因素支持使用CBP更高速度的水解的实现，及因此减少的反应器体积和资本投资，包括酶-微生物协同和嗜热生物和/或复合的纤维素酶系统的使用。而且，纤维素-附着的解纤维素微生物是可能与非-粘附的微生物，例如，混杂物成功地就纤维素水解的产物进行竞争。期望微生物的成功的竞争基于微生物纤维素利用增加工业过程的稳定性。开发致使CBP的微生物中的进展通过以下2个策略进行:加工天然存在的解纤维素微生物，以改善产品-相关的性质，诸如产率和滴度；及加工呈现高产物产率和滴度的非-解纤维素生物，以表达致使纤维素和半纤维素利用的异源纤维素酶和半纤维素酶系统。
[0005]应对乙醇生产的需求的一种方式转变生物质，即，材料诸如农业废弃物，玉米壳，玉米芯，纤维素材料，等中发现的糖而产生乙醇。大规模工业应用中的有效生物质转变需要能耐受高浓度的糖和乙醇，且能同时发酵多于一种糖的微生物。
[0006]戊糖在自然界极其丰富。多至40%的木质纤维素材料可包含戊糖(Ladisch etal., “Process considerat1ns in the enzymatic hydrolysis of b1mass.，’Enz.Microb.Technol., 5:82-100.(1983))。通过发酵，戊糖可转化为可用作液体燃料或化学原料的乙醇。尽管许多微生物具有发酵简单己糖的能力，戊糖，木糖和阿拉伯糖是生物质中最难代谢的糖。一些微生物可将戊糖发酵为乙醇和其他副产物，且已遗传加工具有改善的自戊糖产生乙醇的微生物。但 是，已在敏感于低pH和高浓度的乙醇的细菌中进行许多这些研究。因此，发酵中它们的使用相关于不期望的副产物形成，及它们能产生的乙醇水平仍低。
[0007]面包酵母(啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae))是产生乙醇的优选的微生物
(Hahn-Hagerdal, B.,等人，Adv.B1chem.Eng.B1technol.73, 53 - 84 (2001))。此微
生物的有利属性是(i)接近理论产率的高产率(0.51g产生的乙醇/g使用的葡萄糖)，(ii)高渗透-及乙醇耐受性，(iii)工业加工中天然的稳健性，也(iv)由于其长期与葡萄酒及面包制造，及啤酒酿造相关而通常被认为安全(GRAS)。此外，啤酒酵母(S.cerevisiae)对通常在自生物质预处理的得到的水解产物中发现的抑制物呈现耐受性。但是，啤酒酵母(S.cerevisiae)天然地不断裂纤维素组分,也不有效使用戍糖。
[0008]已在加工啤酒酵母(S.cerevisiae)而致使其表达断裂纤维素的异源酶中获得进展。(见例如美国申请N0.13/130，549和PCT/US2011/039192，在本文通过引用以它们的整体合并)。但是，未在酵母中展示为工业产乙醇发酵而利用阿拉伯糖。此外，对也能断裂纤维素的能有效利用阿拉伯糖和木糖的产乙醇生物有需求。当全部纤维素和半纤维素断裂为单体糖及发酵为期望的产物时获得最高产物产率。
[0009]因此，本领域对能以对于商业可应用性足够的量发酵戊糖的产乙醇生物有需求。也需要将有效 戊糖利用与纤维素消化组合，以便最大化纤维素原料使用效率及产生产物的
最高产率。
[0010]【发明概述】
[0011]本发明提供能将阿拉伯糖发酵为期望的产物诸如乙醇的微生物。在一些实施方式中，生物也能发酵木糖。在一些实施方式中，生物能发酵阿拉伯糖和木糖，及表达一种或更多纤维素酶。
[0012]在一些实施方式中，本发明提供重组真核生物宿主细胞，其包含:编码阿拉伯糖转运子(AraT)的异源多核苷酸，编码阿拉伯糖异构酶(Al)的异源多核苷酸，编码核酮糖激酶(RK)的异源多核苷酸和编码核酮糖5-磷酸差向异构酶(R5PE)的异源多核苷酸。
[0013]在一些实施方式中，本发明提供重组真核生物宿主细胞，其包含:编码阿拉伯糖异构酶(Al)的异源多核苷酸，编码核酮糖激酶(RK)的异源多核苷酸和编码核酮糖5-磷酸差向异构酶(R5PE)的异源多核苷酸，其中Al，RK和R5PE之一种或更多源于多形拟杆菌(B.theta1tamicron)的 Al, RK 和 R5PE。
[0014]在一些实施方式中，重组真核生物宿主含有源于选自下列的生物的AraT的AraT:单抱神食酵母(Ambros1zyma monospora) (LAT2)，阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans),单抱神食酵母(Ambros1zyma monospora)(LATl)，马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus) (LATl)，季也蒙氏毕赤酵母(Pichiagui I lermondii) (LATl)，季也蒙氏毕赤酵母(Pichia gui I lermondii) (LAT2)，具柄毕赤酵母(Pichia stipites),单抱神食酵母(Ambros1zyma monospora) (LAT2),汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hensenii),黄曲霉(Apergillus flavus), 土曲霉(Aspergillusterreus),费希新萨托菌(Neosartorya fischeri),黑曲霉(Aspergillus niger),马尼弗氏青霉(Penicillium marneffei),波萨达球抱子菌(Coccid1ides posadasii),玉米赤霉(Gibberella zeae)，稻梨抱(Magnaporthe oryzae)，裂裙菌(Schizophyllum commune)，具柄毕赤酵母(Pichia stipites),糖酵母属(Saccaharomyces)HXT2,棒曲霉(Aspergillusclavatus)(ACLA_032060)，油菜核盘菌(Sclerotinia sclerot1rum)(SS1G_01302)，苯黑米节皮菌(Arthroderma benhamiae) (ARB—03323)，马发癣菌(Trichophytonequinum) (TEQG—03356)，削断发癣菌(Trichophyton tonsurans) (G—04876)，粗球抱子菌(Coccid1ides immitis) (CIMG—09387)，波萨达球抱子菌(Coccid1ides posadasii)(CPSG—03942)，波萨达球孢子菌(Coccid1ides posadasii) (CPC735—017640)，富氏葡萄抱盘菌(Botryotinia fuckeliana) (BC1G—08389)，偃麦草核腔菌(Pyrenophoratr it ic1-repent is) (PTRG—10527)，玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis) (UM03895.1)，葡萄牙棒抱酵母(Clavispora lusitaniae) (CLUG—02297)，季也蒙氏毕赤酵母(Pichiagui I lermondii) (LATl)，季也蒙氏毕赤酵母(Pichia gui I lermondii) (LAT2)，汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii) (DEHA2E01166g)，具柄毕赤酵母(Pichia stipites)，白色假丝酵母(Candida albicans)，汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)(DEHA2B16082g)，马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus) (LATl)，乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) (KLLA-0RF10059)，耐热克鲁维酵母(Lachanceathermotolerans)(KLTH0H13728g)，多抱范氏酵母(Vanderwaltozyma polyspora) (Kpol—281p3)，鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii) (ZYR00E03916g)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(0.1833)，阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans) (0.1378)，单抱神食酵母(Ambros1zyma monospora) (LATl)，棒曲霉(Aspergillus clavatus) (ACLA—044740)，费希新萨托菌(Neosartorya fischeri) (NFIA—094320)，黄曲霉(Aspergillus flavus)(AFLA—116400)，土曲霉(Aspergillus terreus) (ATEG—08609)，黑曲霉(Aspergillusniger) (ANI—I—1064034)，密集踝节菌(Telaromyces stipitatus) (TSTA—124770)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum) (Pc20g01790)，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)(Pc20g01790) #2，玉米赤霉(Gibberella zeae) (FG10921.1)，赤球丛赤壳菌(Nectriahematococco)及禾生病霉(Glomerellagraminicola) (GLRG—10740)。
[0015]在一些实施方式中，重组真核生物宿主细胞包含编码与SEQ ID N0:9~20的氨基酸序列之任一个具有至少80%同一性的氨基酸序列的AraT。在一些实施方式中，重组真核生物宿主包含异源Al，RK和R5PE，其中Al，RK和R5PE之一种或更多源于多形拟杆菌(B.theta1tamicron)的 Al，RK 和 R5PE。
[0016]在其他实施方式中，本发明包含表达阿拉伯糖异构酶(Al)，核酮糖激酶(RK)和核酮糖-5-磷酸差向异构酶(R5PE)的重组真核生物宿主细胞，其中Al包含与SEQ IDN0:6的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；RK包含与SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列 '及，R5PE包含与SEQ ID N0:8的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。在进一步实施方式中，本发明的重组宿主细胞还包含编码木糖异构酶(XI)的异源多核苷酸。
[0017]在一些实施方式中，一种或更多异源多核苷酸的表达给重组宿主细胞赋予发酵阿拉伯糖的能力。在一些实施方式中，重组真核生物宿主细胞还包含编码木糖异构酶(XI)的异源多核苷酸。在进一步实施方式中，XI源于多形拟杆菌(B.theta1tamicron)的XI。在一些实施方式中，XI包含与SEQ ID NO: 24或SEQ ID NO: 26的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
[0018] 在一些实施方式中，宿主细胞是选自下列的酵母细胞:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizzosaccharomyces pombe)，白色假丝酵母(Candidaalbicans),巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),具柄毕赤酵母(Pichia stipitis),解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)，产月元假丝酵母(Candida utilis)，Arxula adeninivorans,汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方许旺氏酵母(Schwann1mycesoccidentalis)。
[0019]在一些实施方式中，酵母细胞包含编码下列酶的异源序列:木酮糖激酶，核酮糖5-磷酸异构酶，核酮糖5-磷酸差向异构酶，转酮酶和转醛醇酶，及酵母细胞不表达能催化木糖向木糖醇的转变的醛糖还原酶。
[0020]在一些实施方式中，本发明涉及生产发酵产物的方法，包括:
[0021](a)将本发明的重组真核生物宿主细胞与底物组合；
[0022](b)使宿主细胞发酵该底物；及，
[0023](C)回收一种或更多发酵产物，
[0024]其中底物选自:纤维素底物，生物质原料和其组合。
[0025]在一些实施方式中，本发明涉及包含碳源和重组真核生物宿主细胞的组合物。
[0026]在一些实施方式中，本发明涉及培养基上清液，其通过使宿主细胞与含有碳源的
培养基温育而产生。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0027]图1描绘蛋白序列的相似性与阿拉伯糖转运子活性的种系发生图。
[0028]图2描绘蛋白序列的相似性与可能的阿拉伯糖转运子活性的种系发生图。
[0029]图3描绘自阿拉伯糖摄取测定的结果。将啤酒酵母(S.cerevisiae)株用表达源于指示的物种的阿拉伯糖转运子的质粒转化。将阴性对照株用空载体质粒转化。在接种之前和接种后48小时测量阿拉伯糖浓度。
[0030]图4描绘用来编译阿拉伯糖利用通路的组分及使组件靶向用于重组进酵母基因组的rDNA位点的DNA构建体组件(即阿拉伯糖转运子(AraT)，阿拉伯糖异构酶(Al)，核酮糖激酶(RK)和核酮糖5-磷酸差向异构酶(R5PE)，共同地，阿拉伯糖-利用构建体)。
[0031]图5描绘电泳凝胶图像，其描绘共转化进酵母而组装为图4中描绘的阿拉伯糖-利用构建体，及整合进酵母基因组的个体扩增子。
[0032]图6描绘向转化添加阿拉伯糖-利用构建体的DNA组分或不向转化添加DNA的酵母转化的结果。在含有阿拉伯糖作为唯一糖的培养基上选择转化体。集落仅在成功的转化和阿拉伯糖-利用构建体整合进祖先细胞的基因组时生长。
[0033]图7描绘在使用含有阿拉伯糖-利用构建体的啤酒酵母(S.cerevisiae)株(2874+ara)对比对照株(2874)的发酵实验中的经时阿拉伯糖和乙醇水平。对照株不使用阿拉伯糖及不产生乙醇，然而含有阿拉伯糖-利用构建体的株使用阿拉伯糖和能将阿拉伯糖发酵为乙醇。
[0034]图8描绘使用含有阿拉伯糖-利用构建体的啤酒酵母(S.cerevisiae)株(2874+ara)对比对照株(2874)的发酵实验中经时阿拉伯糖，木糖和乙醇水平。对照株不使用阿拉伯糖，但可自存在于培养基中的木糖产生乙醇。含有阿拉伯糖-利用构建体(2874+ara)的株能将阿拉伯糖发酵为乙醇，其解释相比对照株增加的乙醇产生。
[0035]图9描绘使用含有阿拉伯糖-利用构建体(2874+ara)的啤酒酵母(S.cerevisiae)株对比对照株(2874)的发酵实验中经时阿拉伯糖,葡萄糖和乙醇水平。对照株不使用阿拉伯糖，但可自存在于培养基中的葡萄糖产生乙醇。含有阿拉伯糖-利用构建体(2874+ara)的株能将阿拉伯糖发酵为乙醇，其解释相比对照株增加的乙醇产生。
[0036]图10描绘使用含有阿拉伯糖-利用构建体(2874+ara)的啤酒酵母(S.cerevisiae)株对比对照株(2874)的发酵实验中经时阿拉伯糖,木糖,葡萄糖和乙醇水平。对照株不使用阿拉伯糖，但可自存在于培养基中的葡萄糖和木糖产生乙醇。含有阿拉伯糖-利用构建体(2874+ara)的株能将阿拉伯糖发酵为乙醇，其解释相比对照株增加的乙醇产生。
[0037]图11~13描绘获自在表达本发明的阿拉伯糖利用基因和也表达来自梨囊鞭菌属(Pyromyces)物种的木糖异构酶的啤酒酵母(S.cerevisiae)株中的阿拉伯糖利用测定的结果。使酵母株在YPX上预生长，洗涤及用来接种含25ml培养基的150ml密封的瓶，将其用N2冲洗及于35°C以250RPM温育。将培养物采样用于在0，24和48小时HPLC。未在YPA上观察到生长。在YPAXD中克隆I消耗3.TgY1阿拉伯糖。当木糖和葡萄糖已被耗竭时，其一半以上(2.1gr1)在24和48h之间被消耗。图标:0(亲本株)，1(亲本株+ara基因，克隆I)，2 (亲本株+ara基因，克隆2)。
[0038]【发明详述】 [0039]此说明书公开合并本发明的特征的一个或更多实施方式。公开的实施方式仅例示本发明。本发明的范围不限于公开的实施方式。本发明被随附的权利要求定义。
[0040]在以下说明中，为解释的目的，设置特定数，材料和配制，以便提供本发明的充分理解。但是，本领域普通技术人员明晰，本发明可脱离这些特定细节而实行。在一些实例中，熟知的特征可被忽略或简化，只要不使本发明难以理解。
[0041]说明书中描述及参照实施方式为“一实施方式”，“一实施方式”，“一例实施方式”，等，指示描述的实施方式可包括特定特征，结构或特征，但每个实施方式可不必然包括特定特征，结构或特征。而且，该短语不是必然指称相同的实施方式。而且，当关联一实施方式描述特定特征，结构或特征时，需知，在本领域技术人员的知识之内的是，对于其他实施方式也影响该特征，结构或特征，无论是否明确地描述。
[0042]描述“a”或“an”物品在本文可指称单物品或多物品。需知，无论何处在本文用语言“包含”描述实施方式，也提供以术语“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的另外类似实施方式。
[0043]【定义】
[0044]术语“异源”当参照多核苷酸，基因，多肽，或酶使用时，指称未正常见于宿主生物中的多核苷酸，基因，多肽，或酶。“异源”也包括以不同于对应天然基因，例如，不在生物的基因中的其天然的位置组或具有不同调控序列的形式再导入源生物的天然编码区，或其部分。可将异源多核苷酸或基因由，例如，基因转移导入宿主生物。异源基因可包括天然编码区，其包括再导入天然宿主的非-天然调控区的部分嵌合基因。外源基因可包含插入非-天然生物的天然基因，或嵌合基因。异源多核苷酸，基因，多肽，或酶可源于任何源，例如，真核生物，原核生物，病毒或合成多核苷酸片段。[0045]本文所用的术语“启动子”是辅助特定基因的转录的DNA区。启动子一般位于接近它们所调控的基因，在相同的链上和上游(向正义链的5’区)。术语“启动子”或“替代启动子”旨在包括可转录控制其不天然转录控制的目标基因的多核苷酸。在特定实施方式中，替代启动子的转录控制导致目标基因的表达增加。在特定实施方式中，替代启动子被放置在目标基因的5’侧。替代启动子可用于取代天然的启动子，或可在天然的启动子之外使用。替代启动子可对于使用其的宿主细胞为内源性的，或其可为导入宿主细胞的异源多核苷酸序列，例如，对于使用其的宿主细胞是外源的。
[0046]如本文所用，术语“终止子”或“转录终止子”是在用于转录的基因组DNA上标记基因或操纵子的末端的遗传序列部分。适合于在本发明中使用的启动子和终止子包括，例如，见于表1的那些。
[0047] 表1.例示实施方式中使用的启动子和终止子的序列
[0048]
【权利要求】
1.重组真核生物宿主细胞，其包含: 编码阿拉伯糖转运子(AraT)的异源多核苷酸， 编码阿拉伯糖异构酶(Al)的异源多核苷酸， 编码核酮糖激酶(RK)的异源多核苷酸，和 编码核酮糖5-磷酸差向异构酶(R5PE)的异源多核苷酸。
2.权利要求1的重组真核生物宿主细胞，其中AraT源于选自下列的生物的AraT:乳克鲁维酵母(Kluveromyces Iactis)、耐热克鲁维酵母(Kluveromyces thermotolerans)、鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、多抱范氏酵母(Vanderwaltozyma polyspora)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、季也蒙氏毕赤酵母(Pichia gui Iermondii)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、白色假丝酵母(Candidaalbicans) (SC5314)、马克思克鲁维酵母(Kluveromyces marxianus)、具柄毕赤酵母(Pichia stipites)及阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)。
3.权利要求1或2的重组真核生物宿主细胞，其中AraT包含与SEQID NO:9~22的氨基酸序列之任一个具有至少80%同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1~3之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中Al、RK和R5PE之一种或更多源于多形拟杆菌(B.theta1tamicron)的Al、RK和R5PE。
5.重组真核生物宿主细胞，其包含编码阿拉伯糖异构酶(Al)的异源多核苷酸，编码核酮糖激酶(RK)的异源多核苷酸和编码核酮糖5-磷酸差向异构酶(R5PE)的异源多核苷酸，其中A1、RK和R5PE之一种或更多源于多形拟杆菌(B.theta1tamicron)的A1、RI^PR5PE。
6.权利要求4或5的重组真核生物宿主细胞，其中 (a)Al包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列； (b)RK包含与SEQID NO: 7的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列；以及 (c)R5PE包含与SEQID NO:8的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1~6之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中异源多核苷酸的表达给重组宿主细胞赋予发酵阿拉伯糖的能力。
8.权利要求1~7之任一项的重组真核生物宿主细胞，其还包含编码木糖异构酶(XI)的异源多核苷酸。
9.权利要求8的重组真核生物宿主细胞，其中XI源于多形拟杆菌(B.theta1tamicron)的 XI。
10.权利要求8或9的重组真核生物宿主细胞，其中XI包含与SEQID NO: 24或SEQ IDNO: 26的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
11.权利要求1~10之任一项的重组真核生物宿主细胞,其中宿主细胞是酵母细胞。
12.权利要求11的重组真核生物宿主细胞、其中酵母细胞选自:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白色假丝酵母(Candida alb icans)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、具柄毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)、多形汉逊酵母(HansenulapoIymorpha)、红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)、产 I元假丝酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和西方许旺氏酵母(Schwann1myces occidentalis)。
13.权利要求11或12的重组真核生物宿主细胞，其中酵母细胞包含编码下列酶的异源序列:木酮糖激酶、核酮糖5-磷酸异构酶、核酮糖5-磷酸差向异构酶、转酮酶和转醛醇酶，且其中酵母细胞不表达能催化木糖向木糖醇的转变的醛糖还原酶。
14.权利要求1~13之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞能发酵木糖、阿拉伯糖或其组合。
15.权利要求1~14之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞能发酵来自纤维素底物的阿拉伯糖。
16.权利要求14或15的重组真核生物宿主细胞，其中发酵产物选自:乙醇、乳酸、氢、丁酸、丙酮和丁醇。
17.前述权利要求之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞是呈现高乙醇耐受性的工业菌株。
18.权利要求17的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞还呈现高温耐受性。
19.前述权利要求之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞在自含有20g/l木糖和21g/l阿拉伯糖的培养 基24小时的发酵后产生至少约10g/l乙醇的乙醇产率。
20.前述权利要求之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞在自含有20g/l葡萄糖和21g/l阿拉伯糖的培养基24小时的发酵后产生至少约13g/l乙醇的乙醇产率。
21.前述权利要求之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞在自含有10g/l葡萄糖，10g/l木糖和21g/l阿拉伯糖的培养基24小时的发酵后产生至少约15g/l乙醇的乙醇产率。
22.前述权利要求之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞还包含一种或更多编码纤维素酶的异源多核苷酸。
23.权利要求22的重组真核生物宿主细胞，其中一种或更多纤维素酶选自:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶。
24.权利要求23的重组真核生物宿主细胞，其中宿主细胞包含: (a)编码内切葡聚糖酶的第I异源多核苷酸； (b)编码β-葡萄糖苷酶的第2异源多核苷酸； (c)编码第I纤维二糖水解酶的第3异源多核苷酸'及 (d)编码第2纤维二糖水解酶的第4异源多核苷酸。
25.权利要求24的重组真核生物宿主细胞，其中 (a)编码内切葡聚糖酶的第I异源多核苷酸源于烟曲霉(A.fumigatus)； (b)编码β-葡萄糖苷酶的第2异源多核苷酸源于肋状复膜孢糖酵母(S.fibuliger)； (c)编码第I纤维二糖水解酶的第3异源多核苷酸源于爱默生踝节菌(T.emersonii)；及 (d)编码第2纤维二糖水解酶的第4异源多核苷酸源于Lucknowense金孢子菌(C.1ucknowense)。
26.重组酵母细胞，其包含编码阿拉伯糖转运子(AraT)的异源多核苷酸，其中酵母细胞能在24小时内摄取至少约5g/l的阿拉伯糖。
27.权利要求26的重组酵母细胞，其中AraT源于选自下列的生物的AraT:乳克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、耐热克鲁维酵母(Kluveromyces thermotolerans)及黑曲霉(Aspergillus niger)。
28.权利要求26或27的重组酵母细胞，其中AraT包含与SEQID NO:9~22的氨基酸序列之任一个具有至少80%同一性的氨基酸序列。
29.前述权利要求之任一项的重组宿主细胞，其中异源多核苷酸中的至少一种整合到宿主细胞的基因组。
30.产生发酵产物的方法，其包括: (a)使权利要求1~29之任一项的重组真核生物宿主细胞与底物组合； (b)使宿主细胞发酵该底物；及， (c)回收一种或更多发酵产物， 其中底物是纤维素底物和发酵产物的产率依靠宿主细胞发酵阿拉伯糖的能力增加。
31.组合物，其包含碳源和权利要求1~29之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中碳源是含有至少约I%阿拉伯糖的纤维素底物。
32.培养基上清液，其通过使权利要求1~29之任一项的重组真核生物宿主细胞与包含含有至少约1%阿拉伯糖的碳源的培养基温育来产生。
33.组合物，其包含至少第I和第2权利要求1~29之任一项的重组真核生物宿主细胞，其中第I和第2重组真核生物宿主细胞遗传上不同。
【文档编号】C12N1/00GK104039806SQ201280062514
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月10日
【发明者】D·A·阿基罗斯, N·卡亚萨, T·F·巴雷特, A·K·瓦内尔 申请人:马斯科马公司