利用新o-磷酸丝氨酸巯解酶生产半胱氨酸或其衍生物的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用新O-磷酸丝氨酸巯解酶来生产半胱氨酸或其衍生物的方法。根据本发明提供一种利用新O-磷酸丝氨酸巯解酶以O-磷酸丝氨酸为底物生产半胱氨酸的方法，从而具有可利用该方法用简便的方法以高收率容易地生产环保的半胱氨酸的优点。
【专利说明】利用新O-磷酸丝氨酸巯解酶生产半胱氨酸或其衍生物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用新O-磷酸丝氨酸巯解酶(ο-phosphoserine sulfhydrylase)生产半胱氨酸或其衍生物的方法。
【背景技术】
[0002]半胱氨酸是所有生物体的硫代谢中重要的氨基酸，不仅用于头发的角蛋白等生物体内蛋白质、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸及其它含硫代谢产物的合成，而且用作辅酶A生物合成的前体物质。此外，半胱氨酸的生物合成被认为与丝氨酸、甘氨酸、蛋氨酸等其它氨基酸的生物合成有密切的关系。工业上，半胱氨酸及其衍生物用于制药领域(支气管疾病治疗)、化妆品领域(洗发水及烫发液的成分)及食品领域(抗氧化剂、增味剂及和面助剂)。
[0003]目前为止主要以人的头发或动物的羽毛等为原料用化学的酸-水解工序生产半胱氨酸。但是，从头发提取的半胱氨酸的生成收率为7~8%，非常低，并且由于提取过程中使用的盐酸和硫酸，产生过量的环境污染废弃物。此外，由于将头发用作原材料，会使消费者产生厌恶感。由于这种问题，对环保的半胱氨酸生产工艺的开发要求提高，由此开发出了利用微生物来生产半胱氨酸的方法。
[0004]作为利用微生物来生产半胱氨酸的方法，已知有I)首先，对D，L-ATC利用微生物以生物学转换的方法。但是，该方法由于前体D，L-ATC的溶解度低而在产业化上存在困难。2)另一方法已知有以利用大肠杆菌的直接发酵法生产半胱氨酸的方法。该方法在微生物内过量堆积半胱氨酸的情况下会显示细胞内毒性，因此利用微生物来生产高浓度的半胱氨酸时存在限制。
[0005]仔细研究微生物及植物的半胱氨酸生物合成路径之一，O-乙酰丝氨酸(0-acety 1-serine, 0AS)作为半胱氨酸的碳骨架的中间前体起作用。OAS是作为载硫剂利用硫化氢(Hydrogen sulfide)通过O-乙酰丝氨酸巯解酶(O-acetyl-serinesulfhydrylase, 0ASS)被转换成半胱氨酸。从而可利用OASS从累积OAS的微生物和多种载硫剂生产半胱氨酸(美国授权专利US6，579，705)。
[0006]本发明发明人在寻找与此不同的新的半胱氨酸生产方法的过程中发现特定微生物中存在利用O-磷酸丝氨酸(ο-phospho-serine, OPS)来合成半胱氨酸的酶(0-phosphoserine sulfhydrylase, 0PSS)。OPS 是丝氨酸(L-serine)的中间前体，因此与OAS相比代谢路径短，在利用OPS的情况下相比利用OAS的情况会对前体生产有利。尤其是，源自阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)的OPSS与源自结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的OPSS不同，不需要如mec+及cysO那样的传递硫的辅酶,与敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)的OPSS不同，在37°C下显示最佳活性。
【发明内容】
(一)要解决的技术问题[0007]本发明人为了开发以高收率生产半胱氨酸的方法努力研究的结果，从多种微生物中识别具有以OPS为底物合成半胱氨酸的具有活性的新0PSS，并且确认所述新OPSS与以往已知的阴道毛滴虫的OPSS相比半胱氨酸合成活性增加，从而完成了本发明。
(二)技术方案
[0008]本发明的目的在于提供一种半胱氨酸或其衍生物的生产方法，包括:在新O-磷酸丝氨酸巯解酶或表达其的微生物的存在下，使O-磷酸丝氨酸与硫化物反应，从而制备半胱氨酸或其衍生物的步骤。
(三)有益效果
[0009]根据本发明提供一种利用新O-磷酸丝氨酸巯解酶以O-磷酸丝氨酸为底物生产半胱氨酸的方法，从而具有可利用该方法用简便的方法以高收率容易地生产环保的半胱氨酸的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1表示利用三种OPSS在10分钟、30分钟及60分钟测定半胱氨酸的转换率的结
果O
[0011]图2表示为了确认Dal-OPSS的pH敏感性而测定不同pH下的半胱氨酸转换率的
结果。
[0012]图3表示以OPS的发酵液和硫化物为底物利用三种OPSS在10分钟、30分钟及60
分钟测定半胱氨酸的转换率的结果。
[0013]图4表示Dal-OPSS的不同温度下半胱氨酸转换率的测量结果。
最佳实施方式
[0014]作为一个实施方式，本发明提供一种半胱氨酸或其衍生物的生产方法，包括:在具有SEQ IDNo:1或2所示的氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶或表达其的微生物存在的情况下，使O-磷酸丝氨酸与硫化物反应，从而制备半胱氨酸或其衍生物的步骤。
[0015]本发明中术语“O-憐酸丝氨酸疏解酶(0-phosphoserine sulfhydrylase,以下简称0PSS) ”是指具有对O-磷酸丝氨酸(ο-phosphoserine,以下简称OPS)提供硫醇基(th1lgroup, SH基)来使OPS转换成半胱氨酸的活性的酶。
[0016]在本发明中所述OPSS可以是SEQ ID No:1或2所示的氨基酸序列，其是由本发明发明人新识别的0PSS。所述SEQ ID No:1或2所示的氨基酸序列具有OPSS的活性，并且只要维持其活性，则可进行一定程度的变形。本领域的技术人员容易理解，通过这种人为的变形而维持70%以上，优选为80%以上，更优选为90%以上，最优选为95%以上的同源性的氨基酸序列只要保留本发明所要的活性则与本发明的所述氨基酸序列等同。
[0017]本发明的具体的一个实施例中，通过对利用具有SEQ ID No:1的氨基酸序列的Dac-OPSS及具有SEQ ID No:2的氨基酸序列的Dal-OPSS将纯化的OPS及OPS发酵液为底物的半胱氨酸合成活性进行评价的结果，确认了与对照组Tva-OPSS相比显示出高的半胱氨酸转换率，从而确认了具有所述SEQ ID No:1或2的氨基酸序列的OPSS能够以高收率生产半胱氨酸(图1、图3、表3及表4)。
[0018]本发明中术语“同源性”是指两个多肽部分(polypeptide moiety)之间的序列相似性的百分比。可通过已知的技术决定从一个部分到另一个部分的序列相似性。例如，可对序列信息进行排列并利用可容易获得的计算机程序来直接排列两个多肽分子间的序列信息并决定同源性。此外，可通过在同源区域间构成稳定的双链的条件下对多核苷酸进行杂交后，用单链特异性核酸酶使其分解，并且确定被分解的片段大小来决定同源性。
[0019]本发明中术语“序列相似性”是指可共有或不共有共同进化起源的蛋白质的碱基序列或氨基酸序列之间的同一性或相似性程度。在一个具体例中，两个氨基酸序列的对于氨基酸序列的规定长度的多肽匹配至少为21% (优选为至少约50%，最优选为约75%、90%、95%、96%、97%或99%)时，“实质上同源”或“实质上相似”。实质上同源的序列可使用在数据银行中使用的标准软件，或例如可通过为特定的系统定义的严格条件下使用过的杂交实验比较序列来进行确认。被定义的适当的杂交条件是对应的技术范围内(例，参照 Sambrook 等人 1989 年的 infra)。
[0020]本发明中术语“半胱氨酸转换”是指通过OPSS的催化作用由底物OPS转换成产物半胱氨酸的反应，即将OPS转换成半胱氨酸来得到半胱氨酸的反应。此外，术语“半胱氨酸转换率”意味着OPS转换成半胱氨酸的比例。在最佳反应条件下I摩尔OPS转换成I摩尔半胱氨酸时，例如由100摩尔OPS经过转换反应得到100摩尔半胱氨酸时，半胱氨酸转换率是100%。本发明的OPSS经过将OPS转换成半胱氨酸的过程，因此具有如下优点，即比利用OAS的代谢路径要短，不仅对前体生产有利，而且与现有的OPSS不同，在没有用于传递硫的辅酶(结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的mec+及cysO)的条件下,用OPSS自身生产半胱氨酸。
[0021]本发明的OPSS可以是由具有SEQ ID No:9至SEQ ID No: 12的碱基序列的多核苷酸编码的。本发明的具有SEQ ID No:1或2的氨基酸序列的OPSS可以是分别由具有SEQ IDNo:9或10的碱基序列的多核苷酸编码的，更优选的，为了提高不同蛋白质在大肠杆菌中的表达，可以是由下述多核苷酸编码的，所述多核苷酸具有密码子使用频率(codon usage)对大肠杆菌最佳化的SEQ ID No:11或12的碱基序列。
[0022]本发明的表达所述OPSS的微生物可以是固有的表达本发明的OPSS的微生物，或编码本发明的OPSS的碱基序列以载体形式或以插入到染色体内的形式导入的微生物。所述表达OPSS的微生物，其活性还可进一步强化。强化OPSS活性的方法有:通过将包含具有编码OPSS的碱基序列的多核苷酸的载体导入到所述微生物来增加拷贝数的方法、将所述碱基序列的密码子使用频率根据在所述微生物中主要利用的密码子使用频率进行最佳化的方法、将表达所述OPSS的微生物中的编码所述OPSS的基因的启动子替换成强启动子的方法、对所述启动子导入变异的方法以及对编码所述新分离的OPSS的基因导入变异使得所述OPSS的活性被强化的方法等。
[0023]本发明中术语“载体”是指利用宿主细胞用于碱基的克隆和/或转移的任意媒介物。载体可以是其他DNA片段结合而可引起结合的片段的复制的复制子(replicon)。“复制子”是指在生物体内起到DNA复制的自身单元，即可通过自身的调节进行复制的任意遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。
[0024]本发明中表达所述OPSS的微生物可以是通过转化包含所述OPSS的载体的方法得到的微生物，而所述转化方法包括将碱基导入到细胞内的任何方法，可选择本领域中公知的适合的标准技术进行。所述方法的例子有电穿孔(electroporat1n)、碳酸钙共沉淀(calcium phosphate co-precipitat1n)、转录病毒感染(retroviral infect1n)、微注身寸法(microinject1n)、DEAE_ 葡聚糖(DEAE-dextran)、阳离子脂质体(cat1nic liposome)法等，但不限于此。
[0025]表达所述OPSS的微生物是原核细胞或真核细胞均可，优选的是肠杆菌科微生物或棒状杆菌型微生物等，更优选的是埃希式杆菌属微生物、沙雷氏菌属微生物等，最优选的是大肠杆菌。
[0026]通过本发明培养表达上述新分离的OPSS的微生物，并可从该培养液分离OPSS。本领域中通常已知的方法都可使用，在本发明的具体实施例中，采用了利用PET表达系统手册(Novagen股份有限公司)培养微生物并用镍柱亲和层析(N1-NTA columns)分离的方法。
[0027]在本发明中，作为新OPSS的底物使用的OPS既可以使用市售的纯化0PS，也可以使用通过发酵制备的OPS发酵液。所述纯化的OPS可购买例如西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司的产品号为P0878的OPS或和光(Wako)公司的产品号为CAS407-41-0的0PS。此外，所述OPS发酵液可通过培养具有OPS生产能力的微生物，例如以保藏号 KCCMl 1103P (CA07-0022/pCL-prmf-serA* (G336V) -serC ；参照韩国公开专利第10-2012-0041115号)保藏的微生物来制备。
[0028]本发明中术语“硫化物(sulfide) ”是指硫与比硫更加阳性的元素的化合物的总称，是为本发明的目的而制备半胱氨酸或其衍生物时所使用的化合物。所述硫化物不仅可利用本领域中通常使用的固体，而且只要是因pH、压力或溶解度的差异而以液体或气体形态提供，从而能够以硫化物(sulfide, S2_),硫代硫酸盐(th1sulfate, S2O32O等形态转换成硫醇基的所有硫化物都可使用。优选地，可利用Na2S、H2S、NaSH、(NH4)2S及S203。在本发明的具体的一个实施例中将Na2S用作硫源。本发明的反应是在一个OPS反应器中提供一个硫醇基来制备一个半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的反应，所述反应时硫化物的添加量不限于此，但优选反应时所添加的OPS 摩尔浓度的0.1倍至3倍，更优选I倍至2倍。本发明的使OPSS能够进行最佳的酶转换的方法可适用本领域中众所周知的多种方法。其方法的例子有掌握OPSS酶的特性的方法，优选地掌握OPSS酶最佳的活性温度、pH、是否阻碍底物及浓度，以及OPSS酶自身的热稳定性等，掌握酶转换反应的最佳条件的方法，特别是掌握酶转换反应时所使用的最佳的OPSS酶浓度及所使用的底物的最佳平衡浓度、对除OPS底物以外酶转换反应时所使用的硫化物的偏好、转换反应时所使用的缓冲液偏好和由此产生的离子影响性以及是否存在辅酶及最佳浓度的掌握等，但不限于此。
[0029]在本发明的具体的一个实施例中，利用Dal-OPSS确认不同pH及温度下半胱氨酸转换率的结果，确认了 pH在7.0至7.4显示出最佳活性(图2)，温度在37°C下显示出最佳活性(图4)。
[0030]在本发明中，半胱氨酸转换反应时作为额外的辅助因子(cofactor)可添加PLP (吡哆醛-5’ -磷酸)、DTT (二硫苏糖醇)或同时添加PLP及DTT。所述辅助因子在半胱氨酸转换反应中能够使其效率增加，在本发明的具体的一个实施例中添加0.2mM PLP、25mMDTT或同时添加两种辅助因子时确认了半胱氨酸转换率增加(表5)。所述PLP不限于此，但可优选添加0.0OlmM至2mM,更优选添加0.01mM至ImM。此外,所述DTT不限于此,但可优选添加0.0OlmM至10mM,更优选添加0.01mM至50mM。
[0031]本发明的方法还可包括对通过所述反应步骤生产的半胱氨酸或其衍生物进行分离及纯化的步骤。所述步骤中，可利用本领域中公知的适合的方法来从反应液分离及纯化目标半胱氨酸并收集。
[0032]本领域的技术人员能够用公知的化学合成方法从用本发明的方法制备的半胱氨酸容易地合成半胱氨酸衍生物。半胱氨酸与乙酰化剂(acetylat1n agent)反应而容易地合成为NAC(N-乙酰半胱氨酸，N-acetylcysteine)，在碱性条件下使其与卤乙酸(haloacetic acid)反应而合成为 SCMC (羧甲基半胱氨酸，S-Carboxymetylcysteine) ? 所述半胱氨酸衍生物主要作为制药原料用作止咳药、咳嗽缓解剂、支气管炎、支气管哮喘和咽喉炎等的治疗剂。
【具体实施方式】
[0033]下面通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是，这些实施例用于示例性地说明本发明，本发明的范围不由这些实施例所限制。
[0034]实施例1:0_磷酸丝氨酸巯解酶的酶鉴定
[0035]源自阴道毛滴虫的OPSS被报告为与除OPSS以外需要两种辅酶的源自结核杆菌的OPSS不同，没有辅酶也显示活性，与在60°C显示最佳活性的敏捷气热菌的OPSS不同，在37°C显示出最佳活性。以所述事实为背景，本发明发明人以阴道毛滴虫(T.vaginalis)的OPSS氨基酸序列为基础，确保了与其蛋白质序列相似性高的源自微生物的新0PSS。所述新OPSS分别具有SEQ ID No:1及2的氨基酸序列，命名为Dac-OPSS及Dal-OPSS。此外，具有所述SEQ ID No:1及2的氨基酸序列的新OPSS分别通过具有SEQ ID No:9及10的碱基序列的多核苷酸而编码。
[0036]所述两个OPSS不源自大肠杆菌，因此在大肠杆菌中的表达可能不容易。为了使在大肠杆菌中的表达容易，进行了所述新分离的OPSS的密码子使用频率最佳化，这利用了密码子使用频率最佳化工具Jcat (WWW.jcat.de)。由此获得了对所述多核苷酸的SEQ ID No:9及10的密码子使用频率被最佳化的SEQ ID No: 11及12。具有所述SEQ ID No: 11及12的碱基序列的多核苷酸是通过向季诺科贸(Genotech Corp.)提供所述碱基序列来合成，以通过Topo TA克隆(cloning)的载体形式供应得到。为了从各自的菌株获得OPSS酶，制作了通常用于酶表达的pET28a(novagen)载体系统。
[0037]在下述表1中显示了共三种的OPSS酶表达载体名称和用于制作载体所使用的各自的模板及引物。用NdeI和HindIII限制酶处理了(37°C，反应3小时)匹配模板和引物并通过PCR方法对各自的OPSS基因进行扩增而得到的基因片段和载体pET28a。此后使用通常的连接方法将各自的基因片段插入到pET28a载体。用测序法对各自的酶表达载体制备与否及基因序列都进行了确认。将所述制作的酶表达载体导入到具有DE3基因型的大肠杆菌来制备能够获得共三种的OPSS酶的菌株。
表1
【权利要求】
1.一种半胱氨酸或其衍生物的生产方法，其特征在于，包括:在具有SEQ ID No:1或2所示的氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶或表达其的微生物存在的情况下，使O-磷酸丝氨酸与硫化物反应，从而制备半胱氨酸或其衍生物的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述O-磷酸丝氨酸巯解酶由具有选自SEQID No:9至SEQ ID No:12组成的组中的碱基序列的多核苷酸编码。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述O-磷酸丝氨酸是纯化的O-磷酸丝氨酸或包含O-磷酸丝氨酸的微生物的发酵液。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述硫化物选自Na2S、H2S,NaSH, (NH4)2S及S2O3组成的组。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述硫化物的添加量是反应时添加的O-磷酸丝氨酸摩尔浓度的0.1倍至3倍。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，作为所述反应时的辅助因子还添加0.0OlmM至2mM 的 PLP 或 0.0OlmM 至 10mM 的 DTT。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括分离和纯化所述半胱氨酸或其衍生物的步 骤。
【文档编号】C12P13/12GK104039963SQ201280067058
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】宋秉哲, 张真淑, 赵宰贤, 金蕙园 申请人:Cj第一制糖株式会社