包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物的制作方法

包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物的制作方法
【专利摘要】通过形成包含含有两个以上抗原结合单元(表位)的抗原和两分子以上的抗原结合分子(例如抗体)的大的免疫复合体，可以加速含有两个以上抗原结合单元的抗原从血浆中消失，还发现通过利用该特征，并使用还具备离子依赖性抗原结合活性的抗原结合分子，由此进一步加速该抗原的消失，从而可以解决上述课题。
【专利说明】包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物

【技术领域】
[0001]本发明提供:用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的应用；使抗原从血浆中消失的方法，该方法包括给予抗原结合分子；药物组合物，该组合物包含可以使抗原从血浆中消失的抗原结合分子；用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的筛选方法；以及用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的制备方法。

【背景技术】
[0002]抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因此作为药品而受到关注。其中，有多种IgG型抗体药物已上市，目前还有多种抗体药物正在开发中(非专利文献I和非专利文献2)。另一方面，作为可适用于第二代抗体药物的技术，人们开发了各种技术，有人报道了提高效应子功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性的技术、或者降低免疫原性风险的技术等(非专利文献3)。认为课题在于:由于抗体药物的给药量通常非常大，所以难以制备皮下给药制剂；以及制造成本高等。作为减少抗体药物的给药量的方法，人们在考虑提高抗体的药物动力学的方法和提高抗体与抗原的亲和力的方法。
[0003]作为提高抗体的药物动力学的方法，有人报道了恒定区的人工氨基酸取代(非专利文献4和5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，有人报道了亲和力成熟技术(非专利文献6)，通过向可变区的CDR区等的氨基酸中导入突变，可以增强与抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以提高在体外的生物活性、或者可以减少给药量，还可以进一步提高在体内(生物体内)的药效(非专利文献7)。
[0004]另一方面，每I分子的抗体所能中和的抗原量取决于亲和力，通过增强亲和力，可以用少量的抗体中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和力(非专利文献6)。而且，只要与抗原进行共价键结合、并使亲和力达到无限大，就可以用I分子的抗体中和I分子的抗原(抗体为二价时，中和两分子的抗原)。但是，在现有方法中，I分子的抗体与I分子的抗原(抗体为二价时，与两分子的抗原结合)结合成为界限。另一方面，最近据报道，通过使用与抗原进行PH依赖性结合的抗原结合分子，可以实现一分子的抗原结合分子与多个分子的抗原结合(专利文献1、非专利文献8)。pH依赖性抗原结合分子在血浆中的中性条件下与抗原强力结合，而在核内体内的酸性条件下解离抗原。而且，在解离抗原后，该抗原结合分子通过FcRn再循环到血浆中时可以再次与抗原结合，因此可以利用一个pH依赖性抗原结合分子与多个抗原反复结合。
[0005]而且，有报道称:改变成增强中性条件下(pH7.4)的FcRn结合的pH依赖性抗原结合分子具有可以与抗原反复结合的效果、以及使抗原从血浆中消失的效果，因此通过给予这样的抗原结合分子，可以从血浆中除去抗原(专利文献2)。普通的包含IgG抗体Fe区的PH依赖性抗原结合分子，在中性条件下几乎看不到其与FcRn结合。因此，认为该抗原结合分子与抗原的复合体被摄入细胞内主要是非特异性摄入。根据该报告，与普通的包含IgG抗体Fe区的pH依赖性抗原结合分子相比，改变成增强中性条件下(pH7.4)的FcRn结合的pH依赖性抗原结合分子可以进一步加速该抗原的消失(专利文献2)。
[0006]与具有由FcRn介导的循环机制的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短，所以抗原通过在血浆中与具有该循环机制(该结合是PH非依赖性的)的抗体结合，其血浆中滞留性通常会变长，血浆中抗原浓度上升。例如还认为:当血浆中抗原具有多种生理功能时，即使假设一种生理活性被抗体的结合所阻断，该抗原的血浆中浓度也会因抗体的结合而加重以其他生理功能作为病因的症状。从这样的观点考虑，在存在优选使血浆中的抗原消失的情形时，为了加速抗原的消失，有人报道了对增强如上所述的与FcRn的结合的Fe区进行改变的方法，但利用除此以外的方法来加速抗原消失的方法迄今未见报道。
[0007]需要说明的是，本发明中的现有技术文献如下所示。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1:国际公开第W02009/125825号；
[0011]专利文献2:国际公开第TO2011/122011号；
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献 1:Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice MReichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew CDewitz, Nat.B1technol.(2005)23,1073-1078 ；
[0014]非专利文献2:Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to2008.,Eur.J.Pharm.B1pharm.(2005)59 (3), 389-396 ；
[0015]非专利文献3:Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.，Mol.Cells.(2005) 20 (I)，17-29 ;非专利文献 4:Hinton PR, X1ng JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N, J.1mmunol.(2006)176(1)，346-356 ；
[0016]非专利文献5:Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, OberRJ, Ward ES.，Nat.B1technol.(1997) 15 (7)，637-640 ；
[0017]非专利文献6:Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, YeeH, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Cr eaR., Pr o c.Natl.Acad.Sc 1.USA.(2005) 102(24)，8466-8471 ；
[0018]非专利文献7:ffu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, WhiteWI, Young JF, Kiener PA.，J.Mol.B1l.(2007) 368，652-665 ；
[0019]非专利文献8:Igawa T 等人，Nat.B1technol.(2010)28, 1203-1207。


【发明内容】

[0020]发明所要解决的课题
[0021]本发明鉴于上述状况而设，其目的在于提供:用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的应用；使抗原从血浆中消失的方法，该方法包括给予抗原结合分子；药物组合物，其包含可以使抗原从血浆中消失的抗原结合分子；用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的筛选方法；以及用于使抗原从血浆中消失的抗原结合分子的制备方法。
[0022]用于解决课题的方法
[0023]本发明人为了达到上述目的而进行深入研究时，研制出一种可形成免疫复合体的抗原结合分子，该抗原结合分子包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域中的至少一个对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化，所述免疫复合体包含(a)两分子以上的所述抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，该抗原包含两个以上的抗原结合单元。另外，本发明人还发现该抗原结合分子可用于使抗原从血浆中消失。而且，本发明人发现该抗原结合分子作为药物组合物有效，同时还研制了使该抗原从血浆中消失的方法，该方法包括给予该抗原结合分子。另外，本
【发明者】人还发现了具有上述性质的抗原结合分子的筛选方法，同时研发了它的制备方法，完成了本发明。
[0024]SP，本发明提供以下的[I]~[29]。
[0025][I]可形成免疫复合体的抗原结合分子在使该抗原从血浆中消失中的应用，是指包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化；
[0026]所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。
[0027][2] [I]所述的应用，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。
[0028][3] [2]所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0029][4] [I]~[3]中任一项所述的应用，其中，离子浓度条件为pH条件。
[0030][5] [4]所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围内对抗原的结合活性低于在PH中性范围条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0031][6] [I]~[5]中任一项所述的应用，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为多聚体。
[0032][7] [6]所述的应用，其中，所述抗原为⑶F、⑶F-1、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5(BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌肉生成抑制素)、⑶ F-9、⑶ F-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-a β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAIL Αρο-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6) ,TNFSFIA (TNF-a肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC,p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPl)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMl、MD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体CD153)、TNFSF9(4-1BB 配体 CD 137 配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF_ α ,TGF-β、泛特异性的TGF-β或IL-8中的任一种。
[0033][8] [I]~[5]中任一项所述的应用，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为单体。
[0034][9] [I]~[8]中任一项所述的应用，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。
[0035][10] [I]~[9]中任一项所述的应用，其中，所述Fe区分别为SEQ ID N0:13、14、15或16中任一个所表示的Fe区。
[0036][11] [I]~[9]中任一项所述的应用，其中，所述Fe区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
[0037][12] [11]所述的应用，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQ ID N0:13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439位、440位、442位或447位的氨基酸。
[0038][13] [12]所述的应用，其中，所述Fe区为SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表不的Fe区的氨基酸序列中以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0039]238位氨基酸为Leu ；
[0040]244位氨基酸为Leu ；
[0041 ] 245位氨基酸为Arg ；
[0042]249位氨基酸为Pro ；
[0043]250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者
[0044]251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；
[0045]252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；
[0046]254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；
[0047]255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；
[0048]256 位氛基酸为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0049]257 位氨基酸为 Ala、lie、Met、Asn、Ser 或 Val 中的任一个；
[0050]258位氨基酸为Asp ；
[0051]260位氨基酸为Ser;
[0052]262位氨基酸为Leu ；
[0053]270位氨基酸为Lys ；
[0054]272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；
[0055]279 位氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0056]283 位氛基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一个；
[0057]285位氨基酸为Asn ；
[0058]286位氨基酸为Phe ；
[0059]288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；
[0060]293位氨基酸为Val ；
[0061]307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；
[0062]311 位氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser> Val 或 Trp 中的任一个；
[0063]309位氨基酸为Pro ；
[0064]312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；
[0065]314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；
[0066]316位氨基酸为Lys;
[0067]317位氨基酸为Pro;
[0068]318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；
[0069]332 位氨基酸为 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个；
[0070]339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；
[0071]341位氨基酸为Pro;
[0072]343 位氨基酸为 Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0073]375位氨基酸为Arg ；
[0074]376 位氨基酸为 Gly、lie、Met、Pro、Thr 或 Val 中的任一个；
[0075]377位氨基酸为Lys ；
[0076]378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；
[0077]380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；
[0078]382 位氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0079]385 位氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0080]386 位氛基酸为 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0081]387 位氨基酸为 Ala、Arg、His、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0082]389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；
[0083]423位氨基酸为Asn ；
[0084]427位氨基酸为Asn ；
[0085]428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；
[0086]430 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val或Tyr中的任一个；
[0087]431位氨基酸为Hi s或Asn中的任一个；
[0088]433 位氨基酸为 Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro 或 Ser 中的任一个；
[0089]434 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0090]436 位氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一个；
[0091]438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；
[0092]440位氨基酸为Lys ;或者
[0093]442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个。
[0094][14] [I]~[9]中任一项所述的应用，其中，所述Fe区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
[0095] [15] [14]所述的应用，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
[0096][16] [15]所述的应用，其中，所述Fe区为在SEQ ID NO: 13、14、15、或16中任一个所表不的Fe区的氨基酸序列中，以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0097]237位氨基酸为Met ；
[0098]248位氨基酸为lie;
[0099]250 位氨基酸为 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0100]252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；
[0101]254位氨基酸为Thr;
[0102]255位氨基酸为Glu;
[0103]256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；
[0104]257 位氛基酸为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 中的任一个；
[0105]258位氨基酸为His;
[0106]265位氨基酸为Ala;
[0107]286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；
[0108]289位氨基酸为His;
[0109]297位氨基酸为Ala;
[0110]303位氨基酸为Ala;
[0111]305位氨基酸为Ala;
[0112]307 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0113]308 位氨基酸为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0114]309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；
[0115]311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；
[0116]312位氨基酸为Ala或His中的任一个；
[0117]314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；
[0118]315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；
[0119]317位氨基酸为Ala;
[0120]332位氨基酸为Val;
[0121]334位氨基酸为Leu;
[0122]360位氨基酸为His;
[0123]376位氨基酸为Ala;
[0124]380位氨基酸为Ala;
[0125]382位氨基酸为Ala;
[0126]384位氨基酸为Ala;
[0127]385位氨基酸为Asp或Hi s中的任一个；
[0128]386位氨基酸为Pro;
[0129]387位氨基酸为Glu;
[0130]389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；
[0131]424位氨基酸为Ala;
[0132]428 位氛基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0133]433位氨基酸为Lys;
[0134]434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者
[0135]436 位氛基酸为 His、lie、Leu、Phe、Thr 或 Val。
[0136][17] [I]~[13]中任一项所述的应用，其中，所述Fe区包含对Fe Y受体的结合活性比天然型人IgG的Fe区对Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
[0137][18] [17]所述的应用，其中，所述Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG 的Fe区的氨基酸不同的氨基酸:以EU编号表示的221位、
222位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、
280位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位或440位。
[0138][19] [18]所述的应用，其中，所述Fe区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0139]221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；
[0140]222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0141]223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0142]224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0143]225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0144]227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0145]228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0146]230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0147]231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0148]232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0149]233 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0150]234 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0151]235 位氛基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0152]236 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0153]237 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0154]238 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0155]239 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0156]240位氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；
[0157]241 位氨基酸为 Asp、Glu、Leu、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0158]243 位氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0159]244位氨基酸为His ；
[0160]245位氨基酸为Ala;
[0161]246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0162]247 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0163]249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0164]250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0165]251位氨基酸为Phe ；
[0166]254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0167]255位氨基酸为G lu、Leu或Tyr中的任一个；
[0168]256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0169]258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0170]260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0171]262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
[0172]263位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0173]264 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0174]265 位氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0175]266位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0176]267 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0177]268 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一个；
[0178]269 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0179]270 位氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或Tyr中的任一个；
[0180]271 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0181]272 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0182]273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0183]274 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0184]275位氨基酸为Leu或Trp 中的任一个；
[0185]276 位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0186]278 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0187]279位氨基酸为Ala;
[0188]280 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0189]281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0190]282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0191]283 位氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0192]284 位氨基酸为 Asp、Glu、Leu、Asn、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0193]285 位氨基酸为 Asp、Glu、Lys、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0194]286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0195]288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0196]290 位氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0197]291 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0198]292 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Pro、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0199]293 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0200]294 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0201]295 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0202]296 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0203]297 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0204]298 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0205]299 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0206]300 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一个；
[0207]301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0208]302位氨基酸为Ile ；
[0209]303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0210]304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0211]305位氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0212]311 位氨基酸为 Ala、Asp、Asn、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0213]313位氨基酸为Phe;
[0214]315位氨基酸为Leu ；
[0215]317位氨基酸为Glu或Gln ；
[0216]318 位氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0217]320 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个；
[0218]322 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0219]323位氨基酸为Ile ；
[0220]324 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个；
[0221]325 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0222]326 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0223]327 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0224]328 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0225]329 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0226]330 位氨基酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0227]331 位氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0228]332 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0229]333 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个；
[0230]334 位氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0231]335 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0232]336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0233]337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0234]339 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0235]376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0236]377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0237]378位氨基酸为Asp ；
[0238]379位氨基酸为Asn ；
[0239]380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0240]382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0241]385位氨基酸为Glu;
[0242]392位氨基酸为Thr ；
[0243]396位氨基酸为Leu ；
[0244]421位氨基酸为Lys ；
[0245]427位氨基酸为Asn ；
[0246]428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0247]429位氨基酸为Met ；
[0248]434位氨基酸为Trp ；
[0249]436位氨基酸为Ile ;或者
[0250]440位氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0251][20] [I]~[16]中任一项所述的应用，其中，所述Fe区为对抑制型Fe Y受体的结合活性比对活性型Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
[0252][21] [20]所述的应用，其中，所述抑制型Fe Y受体为人FcyRIIb。
[0253][22] [20]或[21]中任一项所述的应用，其中，所述活性型Fe Y受体为人Fe Y RIa、人 Fe YRIIa(R)、人 Fe YRIIa(H)、人 Fe YRIIIa(V)或人 Fe YRIIIa(F)。
[0254][23] [20]~[22]中任一项所述的应用，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位或328位的氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸。
[0255][24] [23]所述的应用，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。
[0256][25] [23]或[24]所述的应用，其中，所述Fe区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0257]233位氨基酸为Asp ；
[0258]234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；
[0259]237 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0260]239位氨基酸为Asp ；
[0261 ] 267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；
[0262]268位氨基酸为Asn、Asp或Glu中的任一个；
[0263]271位氨基酸为Gly ；
[0264]326 位氨基酸为 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0265]330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；
[0266]323位氨基酸为lie、Leu或Met中的任一个；或者
[0267]296位氨基酸为Asp。
[0268][26]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下的步骤(a)~⑴:
[0269]步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[0270]步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因；
[0271]步骤(C)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fe区的基因进行有效连接；
[0272]步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞包含在上述步骤(C)中进行了有效连接的基因;
[0273]步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子；
[0274]步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；
[0275]步骤(g)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成。
[0276][27]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)~⑷:
[0277]步骤(a)，使包含Fe区和两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[0278]步骤(b)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；
[0279]步骤(C)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码在上述步骤(b)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因；
[0280]步骤(d)，从上述步骤(C)中得到的培养液中分离抗原结合分子。
[0281][28]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)~⑴:
[0282]步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[0283]步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因；
[0284]步骤(C)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fe区的基因进行有效连接；
[0285]步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞包含在上述步骤(C)中进行了有效连接的基因;
[0286]步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子；
[0287]步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触；
[0288]步骤(g)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；
[0289]步骤(h)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码在上述步骤(g)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因；
[0290]步骤(i)，从上述步骤(h)中得到的培养液中分离抗原结合分子。
[0291][29]具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)~(e)，还包括如下步骤:使通过该制备方法得到的抗原结合分子与抗原接触，以评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成；
[0292]步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[0293]步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因；
[0294]步骤(C)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fe区的基因进行有效连接；
[0295]步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞包含在上述步骤(C)中进行了有效连接的基因;
[0296]步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子。
[0297]需要说明的是，上述的[I]~[25]可以换成以下的另一种表达方式:
[0298][I’]包含可形成免疫复合体的抗原结合分子的、用于使该抗原从血浆中消失的药物组合物，该药物组合物是包含(i)Fc区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[0299]所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。
[0300][2’ ] [1 ]所述的药物组合物，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。
[0301][3’ ] [2’ ]所述的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。
[0302][4’ ] [1 ]~[3’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，离子浓度条件为pH条件。
[0303][5’] [4’]所述的药物组合物，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围对抗原的结合活性比在PH中性范围条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。
[0304][6’ ] [1 ]~[5’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为多聚体。
[0305][7 ’] [6 ’]所述的药物组合物，其中，所述抗原为⑶F、GDF-1、GDF-3 (Vgr_2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP—13、CDMP—2)、⑶F_7 (BMP—12、CDMP—3)、⑶F—8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-a β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配体、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMl、IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配体 CD 137 配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL, TGF- α、TGF- β、泛特异性的TGF- β或IL-8中的任一种。
[0306][8’ ] [1 ]~[5’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为单体。
[0307][9’ ] [1 ]~[8’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。
[0308][10’ ] [1 ]~[9’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fe区分别为SEQ IDNO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区。
[0309][11’ ] [1 ]~[9’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fe区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
[0310][12，] [11，]所述的药物组合物，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254 位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283位、285 位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314位、316 位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375位、376 位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413位、415 位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438位、439位、440位、442位或447位。
[0311][13，] [12，]所述的药物组合物，其中，所述Fe区为在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0312]238位氨基酸为Leu;
[0313]244位氨基酸为Leu ；
[0314]245位氨基酸为Arg ；
[0315]249位氨基酸为Pro ；
[0316]250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者
[0317]251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；
[0318]252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；
[0319]254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；
[0320]255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；
[0321]256 位氨基酸为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0322]257 位氨基酸为 Ala、lie、Met、Asn、Ser 或 Val 中的任一个；
[0323]258位氨基酸为Asp ；
[0324]260位氨基酸为Ser ；
[0325]262位氨基酸为Leu ；
[0326]270位氨基酸为Lys ；
[0327]272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；
[0328]279 位氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0329]283 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一个；
[0330]285位氨基酸为Asn ；
[0331]286位氨基酸为Phe;
[0332]288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；
[0333]293位氨基酸为Val ；
[0334]307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；
[0335] 311 位氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser> Val 或 Trp 中的任一个；
[0336]309位氨基酸为Pro ；
[0337]312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；
[0338]314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；
[0339]316位氨基酸为Lys;
[0340]317位氨基酸为Pro ；
[0341]318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；
[0342]332 位氨基酸为 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个；
[0343]339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；
[0344]341位氨基酸为Pro ；
[0345]343 位氨基酸为 Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0346]375位氨基酸为Arg ；
[0347]376 位氨基酸为 Gly、lie、Met、Pro、Thr 或 Val 中的任一个；
[0348]377位氨基酸为Lys ；
[0349]378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；
[0350]380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；
[0351]382 位氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0352]385 位氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0353]386 位氨基酸为 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0354]387 位氨基酸为 Ala、Arg、His、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0355]389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；
[0356]423位氨基酸为Asn ；
[0357]427位氨基酸为Asn ；
[0358]428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；
[0359]430 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val或Tyr中的任一个；
[0360]431位氨基酸为Hi s或Asn中的任一个；
[0361]433 位氨基酸为 Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro 或 Ser 中的任一个；
[0362]434 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0363]436 位氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一个；
[0364]438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；
[0365]440位氨基酸为Lys ;或者
[0366]442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个。
[0367][14’ ] [1' ]~[9’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fe区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
[0368][15’] [14’]所述的药物组合物，其中，所述Fe区是下述Fe区:在SEQ ID NO: 13、
14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258 位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311位、312 位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385位、386 位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
[0369][16，] [15，]所述的药物组合物，其中，所述Fe区为在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0370]237位氨基酸为Met ；
[0371]248位氨基酸为lie;
[0372]250 位氨基酸为 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0373]252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；
[0374]254位氨基酸为Thr ；
[0375]255位氨基酸为Glu ；
[0376]256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；
[0377]257 位氛基酸为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 中的任一个；
[0378]258位氨基酸为His;
[0379]265位氨基酸为Ala ；
[0380]286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；
[0381]289位氨基酸为His;
[0382]297位氨基酸为Ala ；
[0383]303位氨基酸为Ala ；
[0384]305位氨基酸为Ala ；
[0385]307 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0386]308 位氛基酸为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0387]309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；
[0388]311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；
[0389]312位氨基酸为Ala或His中的任一个；
[0390]314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；
[0391]315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；
[0392]317位氨基酸为Ala;
[0393]332位氨基酸为Val ；
[0394]334位氨基酸为Leu ；
[0395]360位氨基酸为His ；
[0396]376位氨基酸为Ala ；
[0397]380位氨基酸为Ala ；
[0398]382位氨基酸为Ala ；
[0399]384位氨基酸为Ala ；
[0400]385位氨基酸为Asp或Hi s中的任一个；
[0401 ]386位氨基酸为Pro ；
[0402]387位氨基酸为Glu ；
[0403]389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；
[0404]424位氨基酸为Ala ；
[0405]428 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0406]433位氨基酸为Lys ；
[0407]434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者
[0408]436 位氛基酸为 His、lie、Leu、Phe、Thr 或 Val。
[0409][17’ ] [1' ]~[13’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fe区包含对Fe Y受体的结合活性比天然型人IgG的Fe区对Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
[0410][18’ ] [17’ ]所述的药物组合物，其中，在所述Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸:以EU编号表示的 221 位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234位、235 位、236 位、23 7 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247位、249 位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265位、266 位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278位、279 位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292位、293 位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428位、429位、434位、436位或440位。
[0411][19’] [18’]所述的药物组合物，其中，在所述Fe区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0412]221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；
[0413]222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0414]223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0415]224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0416]225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0417]227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0418]228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0419]230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0420]231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0421]232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0422]233 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0423]234 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0424]235 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0425]236 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0426]237 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0427]238 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0428]239 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0429]240位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0430]241 位氨基酸为 Asp、Glu、Leu、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0431]243 位氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0432]244位氨基酸为His ；
[0433]245位氨基酸为Ala ；
[0434]246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0435]247 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0436]249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0437]250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0438]251位氨基酸为Phe ；
[0439]254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0440]255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
[0441 ] 256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0442]258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0443]260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0444]262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
[0445]263位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0446]264 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0447]265 位氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0448]266位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0449]267 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0450]268 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一个；
[0451]269 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0452]270 位氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或Tyr中的任一个；
[0453]271 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0454]272 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0455]273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0456]274 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0457]275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
[0458]276 位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0459]278 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0460]279位氨基酸为Ala ；
[0461]280 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0462]281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0463]282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0464]283 位氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0465]284 位氨基酸为 Asp、Glu、Leu、Asn、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0466]285 位氨基酸为 Asp、Glu、Lys、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0467]286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0468]288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0469]290 位氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0470]291 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0471]292 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Pro、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0472]293 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0473]294 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0474]295 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0475]296 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0476]297 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0477]298 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0478]299 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0479] 300 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val 或 Trp 中的任一个；
[0480]301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0481]302位氨基酸为Ile ；
[0482]303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0483]304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0484]305位氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0485]311 位氨基酸为 Ala、Asp、Asn、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0486]313位氨基酸为Phe ；
[0487]315位氨基酸为Leu ；
[0488]317位氨基酸为Glu或Gln ；
[0489]318 位氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0490]320 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、VaK Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0491]322 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0492]323位氨基酸为Ile ；
[0493]324 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个；
[0494]325 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0495]326 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0496]327 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0497]328 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0498]329 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0499]330 位氨基酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、SerΛThr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0500]331 位氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0501]332 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0502]333 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个；
[0503]334 位氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0504]335 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0505]336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0506]337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0507]339 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0508]376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0509]377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0510]378位氨基酸为Asp;
[0511]379位氨基酸为Asn;
[0512]380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0513]382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0514]385位氨基酸为Glu;
[0515]392位氨基酸为Thr;
[0516]396位氨基酸为Leu;
[0517]421位氨基酸为Lys;
[0518]427位氨基酸为Asn;
[0519]428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0520]429位氨基酸为Met ；
[0521 ]434位氨基酸为Trp ；
[0522]436位氨基酸为Ile ;或者
[0523]440位氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0524][20’] [I]~[16’]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fe区为对抑制型Fe Y受体的结合活性比对活性型Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
[0525][21’ ] [20’ ]所述的药物组合物，其中，所述抑制型Fe Y受体为人Fe YRIIb。
[0526][22’ ] [20’ ]或[21’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，所述活性型Fe Y受体为人 Fe Y RIa, A Fe y RIIa(R)、人 Fe Y RIIa(H)、人 Fe Y RIIIa(V)或人 Fe y RIIIa(F)。
[0527][23’ ] [20’ ]~[22’ ]中任一项所述的药物组合物，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位或328位氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸。
[0528][24’ ] [23’ ]所述的药物组合物，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。
[0529][25’ ] [23’ ]或[24’ ]所述的药物组合物，其中，在所述Fe区的氨基酸序列中，为以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0530]233位氨基酸为Asp ；
[0531 ]234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；
[0532]237 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0533]239位氨基酸为Asp ；
[0534]267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；
[0535]268位氨基酸为Asn、Asp或Glu中的任一个；
[0536]271位氨基酸为Gly ；
[0537] 326 位氨基酸为 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0538]330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；
[0539]323位氨基酸为lie、Leu或Met中的任一个；或者
[0540]296位氨基酸为Asp。
[0541]上述的[I]~[25]还可以换成以下的另外一种表达形式:
[0542][1〃]用于使抗原从对象的血浆中消失的方法，该方法是包含⑴Fe区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的该抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；
[0543]该方法包括向对象给予可形成免疫复合体的抗原结合分子，所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。
[0544][2"] [1"]所述的方法，其中，所述离子浓度条件为钙离子浓度条件。
[0545][3"] [2"]所述的方法，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性比在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。
[0546][4"][1”]~[3"]中任一项所述的方法，其中，所述离子浓度条件为pH条件。
[0547][5"] [4"]所述的方法，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围条件下对抗原的结合活性比在PH中性范围条件下对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。
[0548][6〃] [1〃]~[5〃]中任一项所述的方法，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为多聚体。
[0549][7〃] [6〃]所述的方法，其中，所述抗原为⑶F、⑶F-1、⑶F_3 (Vgr_2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP—13、CDMP—2)、⑶F_7 (BMP—12、CDMP—3)、⑶F—8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-a、TNF-α β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配体、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMl、IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配体 CD 137 配体)、VEGF、IgE, IgA、IgG, IgM,RANKL, TGF- a、TGF- β、泛特异性的TGF- β或IL-8中的任一种。
[0550][8〃] [1〃]~[5〃]中任一项所述的方法，其中，包含两个以上的抗原结合单元的所述抗原为单体。
[0551][9〃] [1〃]~[9〃]中任一项所述的方法，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。
[0552][10"] [I"]~[9〃]中任一项所述的方法，其中，所述Fe区分别为SEQ ID NO: 13,14、15或16中任一个所表示的Fe区。
[0553][11"] [1"]~[9"]中任一项所述的方法，其中，所述Fe区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
[0554][12〃] [11〃]所述的方法，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQ ID N0:13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439位、440位、442位或447位。
[0555][13〃] [12〃]所述的方法，其中，所述Fe区为在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表不的Fe区的氨基酸序列中，以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0556]238位氨基酸为Leu ；
[0557]244位氨基酸为Leu ；
[0558]245位氨基酸为Arg ；
[0559]249位氨基酸为Pro ；
[0560]250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者
[0561]251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个；
[0562]252位氨基酸为Phe、Ser、Thr或Tyr中的任一个；
[0563]254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个；
[0564]255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个；
[0565]256 位氛基酸为 Ala、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0566]257 位氨基酸为 Ala、lie、Met、Asn、Ser 或 Val 中的任一个；
[0567]258位氨基酸为Asp ；
[0568]260位氨基酸为Ser ；
[0569]262位氨基酸为Leu ；
[0570]270位氨基酸为Lys ；
[0571 ] 272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；
[0572]279 位氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr> Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0573]283 位氛基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一个；
[0574]285位氨基酸为Asn ；
[0575]286位氨基酸为Phe ；
[0576]288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个；
[0577]293位氨基酸为Val ；
[0578]307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个；
[0579]311 位氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser> Val 或 Trp 中的任一个；
[0580]309位氨基酸为Pro ；
[0581]312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个；
[0582]314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个；
[0583]316位氨基酸为Lys;
[0584]317位氨基酸为Pro;
[0585]318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个；
[0586]332 位氨基酸为 Phe、His、Lys、Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个；
[0587]339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；
[0588]341位氨基酸为Pro ；
[0589]343 位氨基酸为 Glu、His、Lys、Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0590]375位氨基酸为Arg ；
[0591]376 位氨基酸为 Gly、lie、Met、Pro、Thr 或 Val 中的任一个；
[0592]377位氨基酸为Lys ；
[0593]378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一个；
[0594]380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个；
[0595]382 位氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个；
[0596]385 位氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0597]386 位氨基酸为 Arg、Asp、lie、Lys、Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0598]387 位氨基酸为 Ala、Arg、His、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0599]389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；
[0600]423位氨基酸为Asn ；
[0601]427位氨基酸为Asn;
[0602]428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个；
[0603]430 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val或Tyr中的任一个；
[0604]431位氨基酸为Hi s或Asn中的任一个；
[0605]433 位氨基酸为 Arg、Gin、His、lie、Lys、Pro 或 Ser 中的任一个；
[0606]434 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0607]436 位氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys、Met 或 Thr 中的任一个；
[0608]438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个；
[0609]440位氨基酸为Lys ;或者
[0610]442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个。
[0611][14"] [1'']~[9"]中任一项所述的方法，其中，所述Fe区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
[0612][15〃] [14〃]所述的方法，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQ ID N0:13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
[0613][16〃] [15〃]所述的方法，其中，所述Fe区为在SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表不的Fe区的氨基酸序列中，以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0614]237位氨基酸为Met;
[0615]248位氨基酸为lie;
[0616]250 位氛基酸为 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0617]252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个；
[0618]254位氨基酸为Thr;
[0619]255位氨基酸为Glu;
[0620]256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个；
[0621]257 位氛基酸为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser> Thr 或 Val 中的任一个；
[0622]258位氨基酸为His;
[0623]265位氨基酸为Ala ；
[0624]286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个；
[0625]289位氨基酸为His ；
[0626]297位氨基酸为Ala ；
[0627]303位氨基酸为Ala ；
[0628]305位氨基酸为Ala ；
[0629]307 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0630]308 位氛基酸为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0631]309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个；
[0632]311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个；
[0633]312位氨基酸为Ala或His中的任一个；
[0634]314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个；
[0635]315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个；
[0636]317位氨基酸为Ala;
[0637]332位氨基酸为Val ；
[0638]334位氨基酸为Leu ；
[0639]360位氨基酸为His;
[0640]376位氨基酸为Ala ；
[0641]380位氨基酸为Ala;
[0642]382位氨基酸为Ala ；
[0643]384位氨基酸为Ala ；
[0644]385位氨基酸为Asp或Hi s中的任一个；
[0645]386位氨基酸为Pro ；
[0646]387位氨基酸为Glu ；
[0647]389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个；
[0648]424位氨基酸为Ala ；
[0649] 428 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0650]433位氨基酸为Lys ；
[0651]434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser、Trp或Tyr中的任一个；或者
[0652]436 位氨基酸为 His、lie、Leu、Phe、Thr 或 Val。
[0653][17〃] [1〃]~[13〃]中任一项所述的方法，其中，所述Fe区包含对Fe Y受体的结合活性比天然型人IgG的Fe区对Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
[0654][18〃] [17〃]所述的方法，其中，在所述Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸:以EU编号表示的221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、 296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位或440位。
[0655][19〃] [18〃]所述的方法，其中，在所述Fe区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0656]221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；
[0657]222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0658]223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0659]224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0660]225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0661]227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0662]228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0663]230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0664]231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0665]232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0666]233 位氛基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0667]234 位氛基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0668]235 位氛基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0669]236 位氛基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0670]237 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0671]238 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0672]239 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0673]240位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0674]241 位氨基酸为 Asp、Glu、Leu、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0675]243 位氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0676]244位氨基酸为His ；
[0677]245位氨基酸为Ala ；
[0678]246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0679]247 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0680]249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0681 ] 250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0682]251位氨基酸为Phe ；
[0683]254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0684]255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
[0685]256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0686]258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0687]260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0688]262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
[0689]263位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0690]264 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0691]265 位氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0692]266位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0693]267 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0694]268 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或Trp中的任一个；
[0695]269 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0696]270 位氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或Tyr中的任一个；
[0697]271 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0698] 272 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0699]273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0700]274 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0701 ] 275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
[0702]276 位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0703]278 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0704]279位氨基酸为Ala ；
[0705]280 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0706]281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0707]282位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0708]283 位氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0709]284 位氨基酸为 Asp、Glu、Leu、Asn、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0710]285 位氨基酸为 Asp、Glu、Lys、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0711]286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0712]288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0713]290 位氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0714]291 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0715]292 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Pro、Thr 或 Tyr 中的任一个；
[0716]293 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0717]294 位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0718]295 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0719]296 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0720]297 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0721]298 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0722]299 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0723]300 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一个；
[0724]301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0725]302位氨基酸为Ile ；
[0726]303位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0727]304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0728]305位氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0729]311 位氨基酸为 Ala、Asp、Asn、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0730]313位氨基酸为Phe;
[0731]315位氨基酸为Leu ；
[0732]317位氨基酸为Glu或Gln ；
[0733]318 位氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0734]320 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个；
[0735]322 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0736]323位氨基酸为Ile ；
[0737]324 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个；
[0738]325 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0739]326 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0740]327 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0741]328 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0742]329 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0743]330 位氨基酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0744]331 位氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0745]332 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0746]333 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个；
[0747]334 位氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0748]335 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0749]336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0750]337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0751]339 位氨基酸为 Aspλ Pheλ Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0752]376位氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0753]377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0754]378位氨基酸为Asp ；
[0755]379位氨基酸为Asn ；
[0756]380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0757]382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0758]385位氨基酸为Glu ；
[0759]392位氨基酸为Thr ；
[0760]396位氨基酸为Leu ；
[0761]421位氨基酸为Lys;
[0762]427位氨基酸为Asn ；
[0763]428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0764]429位氨基酸为Met ；
[0765]434位氨基酸为Trp ；
[0766]436位氨基酸为Ile ;或者
[0767]440位氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0768][20"] [I]~[16"]中任一项所述的方法，其中，所述Fe区为对抑制型Fe Y受体的结合活性比对活性型Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
[0769][21〃] [20〃]所述的方法，其中，所述抑制型Fe Y受体为人Fe yRIIb。
[0770][22〃] [20〃]或[21〃]中任一项所述的方法，其中，所述活性型Fe Y受体为人Fe Y RIa、人 Fe YRIIa(R)、人 Fe YRIIa(H)、人 Fe YRIIIa(V)或人 Fe YRIIIa(F)。
[0771][23"][20"]~[22"]中任一项所述的方法，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位或328位氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸。
[0772][24〃] [23〃]所述的方法，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。
[0773][25〃] [23〃]或[24〃]所述的方法，其中，在所述Fe区的氨基酸序列中，为以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸:
[0774]233位氨基酸为Asp ；
[0775]234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个；
[0776]237 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0777]239位氨基酸为Asp ；
[0778]267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个；
[0779]268位氨基酸为Asn、Asp、或Glu中的任一个；
[0780]271位氨基酸为Gly ；
[0781]326 位氨基酸为 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0782]330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个；
[0783]323位氨基酸为lie、Leu或Met中的任一个；或者
[0784]296位氨基酸为Asp。

【专利附图】

【附图说明】
[0785]图1是显示pH依赖性结合抗体反复与可溶型抗原结合的图。(i)抗体与可溶型抗原结合；(ii)通过胞饮作用非特异性地摄入细胞内；(iii)在核内体内，抗体与FcRn结合，可溶型抗原从抗体上解离；(iv)可溶型抗原转移到溶酶体中被分解；(V)可溶型抗原解离后的抗体通过FcRn再循环到血浆中；(vi)再循环的抗体可以再次与可溶型抗原结合。
[0786]图2是显示通过在中性条件下增强与FcRn的结合，来进一步提高pH依赖性结合抗体可以与抗原反复结合的效果的图。(i)抗体与可溶型抗原结合；(ii)经由FcRn，通过胞饮作用摄入细胞内在核内体内可溶型抗原从抗体上解离；(iv)可溶型抗原转移到溶酶体中被分解；(V)可溶型抗原解离后的抗体通过FcRn再循环到血浆中；(vi)再循环的抗体可以再次与可溶型抗原结合。
[0787]图3是显示使用了 Biacore的显示抗人IgA抗体在1.2mM的Ca2+和3 μ M的Ca2+下与人IgA的相互作用的传感图的图。
[0788]图4是显示人IgA+GAl-1gGl抗体给药组、人IgA+GA2_IgGl抗体给药组、人IgA+GA2-Fc Y R㈠和GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[0789]图5是显示人IgA单独给药组、人IgA+GAl-1gGl抗体给药组、人IgA+GA2_IgGl抗体给药组、人IgA+GA2-Fc yR(-)抗体给药组和人IgA+GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgA的浓度变化的图。
[0790]图6是显示人IgA+GAl-1gGl抗体给药组、人IgA+GA2_IgGl抗体给药组、人IgA+GA2-Fc yR(-)抗体给药组和人IgA+GA2-N434W抗体给药组的正常小鼠血浆中非结合型人IgA的浓度变化的图。
[0791]图7是例示与多聚体抗原形成大的免疫复合体的、包含天然IgGl恒定区pH/Ca依赖性抗体的每I分子抗体的抗原消失效率的图。
[0792]图8是例示识别单体抗原中存在的两个以上表位并适合形成大的免疫复合体的多特异性PH/Ca依赖性抗体的每I分子抗体的抗原消失效率的图。
[0793]图9是显示确认到人IgE和作为pH依赖性抗IgE抗体的克隆278pH依赖性地形成大的免疫复合体的凝胶过滤层析分析结果的图。
[0794]图10是显示人IgE+克隆278给药组和人IgE+Xolair抗体给药组的正常小鼠血浆中抗体浓度变化的图。
[0795]图11是显示人IgE单独给药组、人IgE+克隆278抗体给药组和人IgE+克隆278抗体给药组的正常小鼠血浆中人IgE浓度变化的图。
[0796]图12是显示正常小鼠血浆中GA2_IgGl和GA2-F1087的抗体浓度变化的图。
[0797]图13是显示给予了 GA2_IgGl和GA2-F1087的正常小鼠血浆中hlgA的浓度变化的图。
[0798]图14是显示C57BL/6J小鼠血浆中278_IgGl和278-F1087的抗体浓度变化的图。
[0799]图15 是显示给予了 278-1gGl 和 278-F1087 的 C57BL/6J 小鼠的血浆中 hIgE(Asp6)的浓度变化的图。
[0800]图16是显示给予了 GA2-F760或GA2-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中GA2-F760或GA2-F1331的浓度变化的图。
[0801]图17是显示给予了 GA2-F760或GA2-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中人IgA的浓度变化的图。
[0802]图18是显示给予了 278-F760或278-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中278-F760或278-F1331的浓度变化的图。
[0803]图19是显示给予了 278-F760或278-F1331的人FcRn转基因小鼠的血浆中人IgE的浓度变化的图。
[0804]图20是显示在ρΗ7.4、ρΗ6.0下PHX-1gGl相对于hsIL_6R的传感图的图。
[0805]图21是通过ECL法(电化学发光法)评价Fv4_IgGl和PHX-F29能否同时与IL6R
结合的结果。
[0806]图22 是显示 hsIL6R+Fv4-1gGl 给药组和 hsIL6R+Fv4-1gGl+PHX_IgGl 给药组的正常小鼠血浆中抗IL6R抗体的浓度变化的曲线图。
[0807]图23 是显示 hsIL6R+Fv4-1gGl 给药组和 hsIL6R+Fv4-1gGl+PHX_IgGl 给药组的正常小鼠血浆中人IL6R的浓度变化的曲线图。
[0808]图24是显示使Fe Y R与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。虚线是显示与只含抗体的溶液作用的情形，实线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。
[0809]图25是使人FcRn与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。实线是显示与只含抗体的溶液作用时的情形，虚线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。
[0810]图26是使小鼠FcRn与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。虚线是显示与只含抗体的溶液作用的情形，实线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。
[0811]图27是使小鼠FcRn与只含抗体的溶液或者与抗体和抗原的混合溶液作用时的Biacore传感图。虚线是显示与只含抗体的溶液作用的情形，实线是显示与混合有抗体和抗原的溶液作用时的传感图的图。

【具体实施方式】
[0812]以下的定义和详细说明是为了容易理解本说明书中说明的本发明而提供。
[0813]氨基酸
[0814]本说明书中，以单字母码或三字母码或者该两种方式书写氨基酸，例如表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/ff, His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V。
[0815]氨基酸的修饰
[0816]为了修饰抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可以适当采用位点特异性诱变法(Kunkel 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重叠延伸 PCR 等公知的方法。另外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸修饰方法，还可以采用多种公知的方法(Annu.Rev.B1phys.B1mol.Struct.(2006) 35, 225-249 ；Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100 (11)，6353-6357)。例如，还优选采用无细胞翻译系统(CloverDirect (Protein Express))等,该系统在作为终止密码子之一的UAG密码子(琥拍密码子)的互补性琥珀抑制基因tRNA中包含结合有非天然氨基酸的tRNA。
[0817]本说明书中，表示氨基酸的修饰位点时使用的“和/或”一词的意义包括“和”与“或”适当组合的所有组合。具体而言，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸修饰的变异:
[0818](a) 33 位、(b) 55 位、(C) 96 位、(d) 33 位和 55 位、(e) 33 位和 96 位、(f) 55 位和 96位、(g)33位和55位和96位。
[0819]抗原结合单元
[0820]本说明书中，“抗原结合单元”是指“包含本发明的抗原结合分子所含的抗原结合结构域的一价结合单元所结合的表位的抗原分子在该抗原结合分子的不存在下在血浆中通常存在的形态的每一分子中存在的该表位数”。作为抗原结合单元为两单元的抗原的例子，例示包含通常以⑶F、TOGF或VEGF等同源二聚体的形式存在于血浆中的多聚体的抗原。例如，在形成同源二聚体的GDF的分子中存在两单元的抗GDF抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位，所述抗GDF抗体在其分子中包含同一序列的两个可变区(即，不是后述的双特异性抗体)。另外，作为抗原结合单元为两单元的抗原的例子，还例示IgE等免疫球蛋白分子。IgE在血浆中通常以包含重链二聚体和轻链二聚体的四聚体的形式存在，但在该四聚体中存在两单元的抗IgE抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位，所述抗IgE抗体在其分子中包含同一序列的两个可变区(即，不是后述的双特异性抗体)。IgA在血浆中通常以包含重链二聚体和轻链二聚体的四聚体、或者该四聚体经由J链进一步形成复合体的八聚体这两种形式存在，但在该四聚体中和八聚体中分别存在两单元或四单元的抗IgA抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位，所述抗IgA抗体在其分子中包含同一序列的两个可变区(即，不是后述的双特异性抗体)。另外，作为抗原结合单元为三单元的抗原的例子，例示包含通常以作为TNF超家族的TNFa、RANKL或⑶154等同源三聚体的形式存在于血浆中的多聚体的抗原。
[0821]作为抗原结合单元为一单元的抗原分子的例子，例示通常以可溶型IL-6受体(以下还称作sIL-6R)、IL-6、HMGB-l、CTGF等单体形式存在于血浆中的分子。包含IL_12p40和IL-12p35 的 IL-12、包含 IL_12p40(还称作 IL-30B)和 IL_23pl9 的 IL-23、或包含 EBI3 和IL27p28的IL-23、或包含IL_12p35和EBI3的IL-35等异源二聚体包含结构彼此不同的两分子的亚单元。由于分子中包含两个这些亚单元中的任意一个所结合的可变区(即，不是后述的双特异性抗体)的抗亚单元抗体所含的可变区的一价结合单元所结合的表位是一单元，所以这些异源二聚体的抗原结合单元是一单元。同样，TNFa-TNFP-hCG的多亚单元复合体等异源三聚体的抗原结合单元也是一单元。
[0822]需要说明的是，由于抗原结合单元是指抗原结合结构域的一价结合单元所结合的表位数，所以在抗原结合分子中的互补位存在一种和存在多种的情况下，即使这些抗原结合分子所结合的抗原是相同的抗原，但该抗原中的抗原结合单元也是不同的。例如，在上述的异源二聚体的例子中，在抗原结合分子所含的抗原结合结构域中的一价结合单元与该异源二聚体中的一种亚单元结合时，该抗原中的抗原结合单元是一单元，相对于此，在抗原结合分子为包含两个与形成异源二聚体的各亚单元结合的一价结合单元的双特异性或双互补位的抗原结合分子的情况下，该抗原中的抗原结合单元是两单元。
[0823]多聚体(mu I timer)
[0824]本说明书中，只记作两个以上的多聚体时，多聚体一词包括同源多聚体和异源多聚体两者。作为多聚体所含的亚单元间的结合方式，包括肽键或二硫键等共价键、或者离子键、范德华键或氢键等稳定的非共价键，但并不限于这些。同源多聚体包含多个相同的亚单元，而异源多聚体包含多个不同的亚单元。例如，二聚体一词包括同源二聚体和异源二聚体两者，同源二聚体包含两个相同的亚单元，而异源二聚体包含两个不同的亚单元。另外，关于表示形成多聚体的各单元的单体，当该单元为多肽时，所述单体是指通过肽键连接的连续的各结构单元。
[0825]
[0826]本说明书中，“抗原”只要包含抗原结合结构域所结合的表位即可，其结构并不限于特定的结构。从另外的意义来讲，抗原既可以是无机物，也可以是有机物。作为抗原，可例示如下所述的分子:17-从、4-比8、40(:、6-酮^^^1&、8-异^^^2&、8-氧代_dG、Al腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素 RIA ALK-2、激活素 RIB ALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2,ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS, ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、a -V/ β -1 拮抗剂、ANG、Ang, APAF-UAPE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3 整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE, BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-UBAK, Bax、BCA-U BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM, BLC,BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3 成骨蛋白(Osteogenin)、BMP_4BMP_2b、BMP-5、BMP-6Vgr-U BMP-7 (OP-1)、BMP-8 (BMP_8a、0P-2)、BMPR, BMPR-1A (ALK-3)、BMPR-1B (ALK-6)、BRK-2、RPK-U BMPR-1 I (BRK-3)、BMP、b_NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE,BPDE-DNA, BTC、补体因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、C1、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPP1、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶 X/Z/P、CBL、CC1、CCK2、CCL、CCLU CCLlU CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD 1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla, CDllb, CDllc, CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7_1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气英膜梭菌(Clostridium Perfringens)毒素、CKb8_l、CLC, CMV, CMV UL、CNTF, CNTN-U COX、C-Ret, CRG-2、CT-U CTACK, CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO,CXCLlU CXCLl2, CXCL13、CXCLl4, CXCL15、CXCL16, CXCR、CXCRU CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC, DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-1GF-1 (脑 IGF-1) > Dhh、地高辛、DNAM-U Dnase, Dpp, DPPIV/CD26、Dtk, ECAD, EDA、EDA-AU EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA, EMMPRIN、ΕΝΑ、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot, EotaxinUEpCAM, EphrinB2/EphB4、EPO, ERCC, E-选择素、ET-U因子Ila、因子VI1、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcRl、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt_3、Flt_4、促卵胞激素、断裂因子、FZDU FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF,⑶2、⑶3、⑶F、⑶F-1、⑶F_3 (Vgr-2)、⑶F_5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌肉生长抑制素)、⑶F-9、a)F-15(MIC-l)、ffl)NF、a)NF、GFAP、GFRa-l、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GR0、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap 或 NIP-cap)、HB-EGF, HCC、HCMV gB 包膜糖蛋白、HCMV gH 包膜糖蛋白、HCMVUL,造血生长因子(HGF)、HepB gpl20、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen) (HMff-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gpl20 V3 环、HLA、HLA-DR、HMl.24、HMFGPEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-U I CAM-3, ICE、I COS, IFNg、Ig、IgA 受体、IgE、IGF、IGF 结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-1, IGF-1I, IL、IL-U IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6, IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12, IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-a、INF-β、INF-Y、抑制素、iNOS、胰岛素 A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白a2、整联蛋白a3、整联蛋白a4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白a5(aV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白a 6、整联蛋白β 1、整联蛋白β2、干扰素Y、IP-10、1-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白 5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型 TGF-1、潜伏型 TGF_lbpl、LBP、LDGF, LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 相关抗原、LFA-U LFA-3、Lfo, LIF、LIGHT、月旨蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-选择素、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β 受体、Mac-1、MAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF, MDC, Mer、金属蛋白酶、MGDF 受体、M GMT, MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMACU MMP, MMP-UMMP-10、MMP-11、MMP—12、MMP—13、MMP—14、MMP—15、MMP—2、MMP—24、MMP—3、MMP—7、MMP—8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK, NAIP, NAP、NCAD, N-C粘附因子、NCA90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素_3、神经营养素-4或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF- β、nNOS、NO、NOS、Npn, NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr,甲状旁腺激素、PARC、PARP,PBR、PBSF, PCAD, P-钙黏蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-U PECAM, PEM、PF4、PGE, PGF, PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk, PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES,RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV)F、RSVFgp, Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-U SLAM、SLPI, SMAC, SMDF, SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-1I, TACE, TACI,TAG-72 (肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC, TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α / β )、TdT、TECK, TEMU TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸 PLAP 样碱性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、TGF- β、TGF-β 泛特异性(泛特异性的 TGF-β )、TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RH、TGF-β Rllb、TGF- β RII1、TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、TGF- β 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲状腺激素、116、11]\^、1'10、组织因子、丁]\^卩卩2、1'111?0、丁]\^1?52、丁,、丁,-0、TNF-α β、TNF_3 2、TNFc、TNF-R1、TNF-RI1、TNFRSF10A(TRAIL Rl Apo_2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl、LIT、TRID)、TNFRSF1D (TRAILR4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF1IA (RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSFI IB (OPG OCIF、TRl)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR、HveA, LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19(TR0Y TAJ, TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSFIA (TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75_80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RII1、TNFCR)、TNFRSF4 (0X40 ACT35、TXGPIR)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-U APTl、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21 (DR6)、TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1)、TNFRSF25 (DR3 Apo_3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF1 (TRAIL Apo-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSF1A (TNF_a黏附素(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC,p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPl)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMl、MD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体CD153)、TNFSF9 (4-1B B 配体 CD 137 配体)、TP-U t_PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-RUTRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF, Trk, TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原 CA125、肿瘤相关抗原表达病毒Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD, VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI, VM、病毒抗原、VLA, VLA-U VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-U WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT1B、WNTl 1、WNT16、XCLl、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP,XPD、HMGBl、IgA, A β、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG, Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、SODl、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAPl、高分子激肽原、IL-31、IL_31R、Navl.UNavl.2,Nav1.3,Nav1.4,Nav1.5,Navl.6、Navl.7、Navl.8、Navl.9、EPCR、Cl、Clq、Clr、Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、壳硬蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VI1、因子Vila、因子VII1、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子X1、因子XIa、因子XI1、因子Xlla、因子XII1、因子XIIIa、TFP1、抗凝血酶II1、EPCR、血栓调节蛋白、TAP1、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PA1-1、PA1-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖_2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖_4、LPA、SlP以及用于激素和生长因子的受体。
[0827]如下所述，象双特异性抗体等在抗原结合分子与抗原分子中的多个表位结合的情况下，可与该抗原结合分子形成复合体的抗原可以是上述例示的抗原中的任一种、或者是其组合，换言之，可以是单体或异源多聚体。作为异源多聚体的非限定性例子，可以列举:包含 IL-12p40 和 IL-12p35 的 IL-12、包含 IL_12p40 和(还称作 IL-30B) IL_23pl9 的 IL-23、或者包含EB1-3和IL27p28的IL-23、或者包含IL_12p35和EB1-3的IL-35等异源二聚体。
[0828]在上述抗原的例示中还记载有受体，但在这些受体以可溶型存在于血浆中等生物体液中的情况下，其可以和本发明的抗原结合分子形成复合体，所以上述列举的受体只要以可溶型存在于血浆中等生物体液中，则其可以用作与本发明的抗原结合分子结合能够形成本发明的复合体的抗原。作为这种可溶型受体的一个非限定性方案，例如可以例示:由Mullberg 等人(J.1mmunol.(1994) 152 (10), 4958-4968)记载的作为可溶型 IL-6R 的、包含SEQ ID NO:1所表示的IL-6R多肽序列中第I位~第357位的氨基酸的蛋白。
[0829]在上述抗原的例示中，还记载有可溶型抗原，对该抗原所存在的溶液没有限定，该可溶型抗原可以存在于生物体液、即充满生物体内的脉管或组织.细胞间隙的所有液体。在一个非限定性方案中，本发明的抗原结合分子所结合的抗原可以存在于细胞外液中。细胞外液是指脊椎动物的血浆、组织间液、淋巴液、致密的结缔组织、脑脊髓液、髓液、穿刺液、或关节液等骨和软骨中的成分、肺胞液(支气管肺胞清洗液)、腹水、胸水、心包液、囊内液、或眼房水(房水)等细胞透过液(细胞的主动输送?分泌活动的结果产生的各种腺腔内的液体、和消化道管腔等其他体腔内液)的总称。
[0830]另外，当抗原结合分子所含的抗原结合结构域所结合的表位是单一表位时，作为与该抗原结合分子结合能够形成本发明的复合体的抗原的一个非限定性方案，可以例示抗原结合单元中包含同源二聚体或同源三聚体等的下述分子:⑶F、⑶F-1、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP—13、CDMP—2)、⑶F_7 (BMP—12、CDMP—3)、⑶F—8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-α、TNF-α β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配体、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSFI)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMl、IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配体 CD 137 配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL、TGF- α、TGF- β、泛特异性的 TGF- β、IL-8。
[0831]表位
[0832]表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
[0833]线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸、以及最普通地含有至少5个、例如约8至10个、6至20
个氨基酸。
[0834]与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白的三维结构。例如，蛋白分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链形成并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法例如包括:χ射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B1logy (1996),第 66 卷，Morris (编)。
[0835]与表位结合的抗原结合结构域的结构被称作互补位。表位和互补位通过在表位和互补位之间发生作用的氢键、静电引力、范德华力、疏水键等稳定地结合。该表位和互补位之间的结合力被称作亲和力(affinity)。多个表位与多个互补位结合时的结合力的总和被称作亲合力(avidity)。包含多个互补位(即多价)的抗体等与多个表位结合时，结合力(affinity)相加或协同地发挥作用,所以亲合力比亲和力高。
[0836]结合活性
[0837]下述例示了通过含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IgA以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适当实施。
[0838]例如，含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别存在于IgA分子中的线性表位，这可以通过如下所示的操作来确认。例如，为了上述目的，合成了包含构成IgA的恒定区的氨基酸序列的线性肽。该肽可进行化学合成。或者，可以利用IgA的cDNA中编码相当于恒定区的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。接下来，对包含构成恒定区的氨基酸序列的线性肽、和含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IgA细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
[0839]另外，含有针对IgA蛋白的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否识别立体结构表位，这可以通过如下操作来确认。为了上述目的，如本说明书中所述，通过采用普通的重组基因方法，向可以形成IgA蛋白内的天然的立体表位的宿主细胞(例如，动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)中形质导入编码IgA的重组基因。由如此制作的重组细胞的培养液制备含有立体结构表位的IgA。含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别立体结构表位是指，该被测抗原结合分子与经固定化的含有立体结构表位的IgA接触时，强烈地与该IgA分子结合，但该抗原结合分子与经固定化的包含构成IgA的氨基酸序列的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。还可以使用经二硫苏糖醇(dith1threitol)、二硫赤鲜醇(dith1erythritol) β _ 巯基乙醇(β -mercaptoethanol)、膦衍生物(phosphines)、硼氢化钠(sodium borohydride)等切断二硫键的还原剂和/或胍盐酸盐、尿素、十二烷基硫酸钠等表面活性剂等离液序列高的药物改性的针对IgA的该被测抗原结合分子来代替上述线性肽。这里，实质上不结合是指，对人IgA的结合活性的80%以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
[0840]作为测定含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IgA的结合活性的方法，例如可以列举 Antibodies A Laboratory Manual 记载的方法(Ed Harlow, DavidLane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420) ? SP，可以根据以 IgA 为抗原的ELISA或EIA的原理进行评价。
[0841]在ELISA形式中，含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IgA的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测抗原结合分子添加至固定有IgA的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检测与固定在该板上的IgA结合的被测抗原结合分子。在上述ELISA中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IgA的抗体结合效价(titer),由此可以比较被测抗原结合分子对IgA的结合活性。
[0842]被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置:
[0843]ACSCanto?II ；
[0844]FACSAri a? ；
[0845]FACSArray? ；
[0846]FACSVantage?SE ；
[0847]FACSCalibur?(均为 BD B1sciences 公司的商品名)；
[0848]EPICS ALTRA HyPerSort ；
[0849]Cytomics FC 500 ；
[0850]EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC ；
[0851]Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为 Beckman Coulter 公司的商品名)。
[0852]例如，作为含有针对IgE的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一例，可以列举以下方法。首先，使表达IgE的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适当的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备成所期望的浓度来使用。例如，能够以10 μ g/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着,通过FACSCalibur (BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
[0853]含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子是否与某抗原结合分子共有表位，这可以通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
[0854]具体而言，在交叉阻断试验中，包被于微量滴定板的孔上的IgA蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下或不存在下经孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IgA蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对包被有IgA蛋白的孔的结合活性越降低。
[0855]经由IgA蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标志物质进行标记。具体而言，公知的是放射标记或突光标记等。
[0856]与在候选竞争抗原结合分子缔合体的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20%、优选至少20-50%、进一步优选至少50%的含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位、或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
[0857]在鉴定含有针对IgA的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，这能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
[0858]作为这种测定结合活性的方法，例如，在上述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0859]另外，在细胞上表达的抗原中的鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子是否共有表位，这例如可通过如下所述的方法来评价。以抗原为IgE的情形为例，以下进行说明。首先，制备表达IgE的细胞和表达在表位中导入了突变的IgE的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液中添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，用合适的缓冲液清洗，向所得细胞悬浮液中添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过 FACSCalibur (BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备成所期望的浓度来使用。例如，能够以10 μ g/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELLQUEST软件(BD公司)进行分析而得到的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
[0860]本方法中，例如“实质上不与突变IgE表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IgE的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELLQUEST软件进行分析。由多肽缔合体存在下和不存在下的几何平均值，通过下述计算式计算该比较值(AGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
[0861]Δ Geo-Mean = Geo-Mean (多肽缔合体存在下)/Geo-Mean (多肽缔合体不存在下)
[0862]将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IgE表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IgE分子AGeo-Mean值)与反映被测抗原结合分子对IgE表达细胞的结合量的AGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IgE表达细胞和IgE表达细胞的AGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备成彼此相同或者实质上相同的浓度。预先确定了识别IgE中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
[0863]被测抗原结合分子相对于突变IgE表达细胞的AGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IgE表达细胞的AGeo-Mean比较值的至少80%、优选50%、进一步优选30%、特别优选15%，则认为“实质上不与突变IgE表达细胞结合”。计算Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于CELL QUEST软件用户指南(BD b1sciences公司)。通过将比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
_4] 抗原结合结构域
[0865]本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，例如可以列举:抗体的重链和轻链的可变区、生物体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(国际公开第TO2004/044011号、国际公开第W02005/040229号)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白即纤连蛋白中的蛋白结合的结构域即10Fn3结构域的Adnectin(国际公开第W02002/032925号)、以构成蛋白A的包含58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为构架的Affibody(国际公开第W01995/001937号)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat:AR)的分子表面露出的区域 DARPins (Designed Ankyrin Repeat proteins)(国际公开第W02002/020565号)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区域Anticalin等(国际公开第W02003/029462号)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得性免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸残基重复(leucine-rich-repea t (LRR))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片层结构的凹陷区域(国际公开第W02008/016854号)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可以列举含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选列举“scFv (单链Fv) ”、“单链抗体”、^’、“8。?￥2(单链？￥2) ”、“Fab”或“F(ab，)2” 等。
[0866]本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如包含SEQ ID N0:2所记载的氨基酸序列的蛋白中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与彼此不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如包含SEQ ID N0:2所记载的氨基酸序列的蛋白中。
[0867]免疫复合休(Tmmune complex)
[0868]免疫复合体是指，至少一个抗原和至少一个抗原结合分子相互结合形成分子量更大的复合体时产生的比较稳定的结构。作为免疫复合体的一个非限定性方案，例示抗原-抗体聚集体。在本说明书中，评价包含两个以上抗原结合分子和两个以上抗原结合单元的免疫复合体的形成的方法见后述。
[0869]特异件
[0870]特异性是指特异性结合的分子中的一个分子对于它的一个或多个结合对象分子以外的分子不显示任何显著性结合的状态。另外，也可用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位是特异性的情形。另外，在多个不同的抗原中含有抗原结合结构域所结合的表位时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。这里，不显示任何显著性结合是指，对于该对象分子以外的分子，显示出对该对象分子的结合活性的50%以下、通常为30%以下、优选15%以下、特别优选10%以下、进一步优选5%以下的结合活性。
[0871]
[0872]本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造的免疫球蛋白。抗体可从其天然存在的血衆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全地合成。作为抗体的实例，优选列举免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚型。作为人的免疫球蛋白，已知有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可包含这些同种型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。作为人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunologicalinterest, NIH Publicat1n N0.91-3242中，但在本发明中可以是其中的任一种。特别是，作为人IgGl的序列，以EU编号表示的356-358位氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。另外，作为人IgK (Kappa)恒定区和人IgX (Lambda)恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publicat1nN0.91-3242中，但在本发明可以是其中的任一种。
[0873]制作具有所期望的结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IgA结合的抗体(抗IgA抗体)的制作方法。与IgA以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适当制作。
[0874]抗IgA抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IgA抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包含:由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。需要说明的是，本申请发明的单克隆抗体包含“人源化抗体”或“嵌合抗体”。
[0875]产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下制作。即，使用IgA蛋白作为致敏抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IgA抗体的杂交瘤。
[0876]具体而言，单克隆抗体的制作例如如下进行。例如，纯化的天然IgA蛋白可以用作致敏抗原。另外，为了从培养上清中获得可溶型IgA，而纯化在MGT/GENE-DB中以L00022|IGHE*02的形式记载的、由以SEQ ID NO:2表示的IgA多肽序列构成的重组蛋白。为了表达重组蛋白，首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID N0:3中的IgA重链恒定区基因，由此可得到由SEQ ID N0:2表示的IgA蛋白，其用作致敏抗原用于抗体制备。即，将编码IgA的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的IgA蛋白。表达IgA重链恒定区基因时，可以将SEQID N0:3中记载的多核苷酸序列有效连接在信号序列的3’末端。另外，在另一非限定性方案中，可以在编码5’末端包含信号序列的重链可变区的多核苷酸序列的3’末端有效连接SEQ ID N0:3中记载的多核苷酸序列。另外，为了纯化重组蛋白，可以在SEQ ID N0:2的氨基末端或羧基末端添加用于进行适当纯化的标签肽。作为这种例子的一个非限定性方案，可以列举经由GGGGS (SEQ ID NO: 31)接头连接的作为Avi标签的GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ IDNO:4)等。作为如上所述的重组蛋白的非限定性制作例，可以列举下述方法:从重组宿主细胞的培养液中回收如实施例1中记载的与轻链组合表达的重组IgA蛋白后进行纯化。
[0877]作为用于免疫哺乳动物的致敏抗原，可使用该纯化IgA蛋白。IgA的部分肽也可以用作致敏抗原。此时，该部分肽也可以根据人IgA的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将一部分IgA基因插入到表达载体中使其表达来获得。进而，还可以使用蛋白分解酶分解IgA蛋白来获得，但用作部分肽的IgA肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID N0:2的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为致敏抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体而言，可以将8~50、优选10~30个残基的肽用作致敏抗原。
[0878]另外，也可以将IgA蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作致敏抗原。为了制造用作致敏抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fe片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作:将编码所期望的两种或更多的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如上所述地插入表达载体中。融合蛋白的制作方法记载于 Molecular Cloning 第 2 版.(Sambrook, J 等人，Molecular Cloning 第 2版，9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.press)。用作致敏抗原的 IL-6 受体的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于PCT/JP2011/077619等中。
[0879]作为用该致敏抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
[0880]按照公知的方法将上述动物用致敏抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过注射将致敏抗原给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的致敏抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该致敏抗原对哺乳动物每4至21日给予数次。另外，致敏抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作致敏抗原时，有时希望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白结合的该致敏抗原肽进行免疫。
[0881]另外，产生所期望抗体的杂交瘤可通过使用DNA免疫，如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法:被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，致敏抗原在该免疫动物的生物体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下的优越性:
[0882]-抗原为膜蛋白时，能够维持膜蛋白的结构而赋予免疫刺激；
[0883]-无需纯化免疫抗原。
[0884]为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IgA蛋白的DNA。编码IgA的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体中，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如PCDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予生物体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IgA的抗体的制作也可以采用PCT/JP2011/077619中记载的方法来制作。
[0885]如此地将哺乳动物免疫，确认血清中与IgA结合的抗体效价上升后，从哺乳动物采集免疫细胞用于细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
[0886]作为与上述免疫细胞融合的细胞,可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指能够(或者不能)在特定培养条件下存活的形态。选择标志物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会增殖。
[0887]HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞各自可通过含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5’ -溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标志物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
[0888]作为这类骨髓瘤细胞，例如可优选使用:P3 (P3 X 63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4), 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microb1logyand Immunology (1978)81, 1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976)6 (7)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976)8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685)，269-270)、FO (J.1mmunol.Methods (1980) 35 (1-2)，1-21)、S194/5.ΧΧ0.BU.1 (J.Exp.Med.(1978) 148 (I)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0889]基本上，根据公知的方法，例如Kohler和Milstein等人的方法(MethodsEnzymol.(1981)73, 3-46)等，进行上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
[0890]更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施上述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂后使用。
[0891]免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞达到I至10倍。作为用于上述细胞融合的培养液，使用例如适于上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
[0892]关于细胞融合，将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至37°C左右的PEG溶液(例如平均分子量为1000至6000左右)通常以30至60% (w/v)的浓度添加。通过缓缓地混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
[0893]如此操作得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)进行培养来选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。接着，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0894]如此操作得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标志物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够除所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体而言，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。接着，可通过通常的有限稀释法实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0895]所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如,可以根据ELISA的原理来评价抗体对固定化的IgA的结合活性。例如,将IgA固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的IgA接触，检测与IgA结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择出的、产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释法等进行克隆。
[0896]如此操作而制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
[0897]按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前一种方法适于获得高纯度的抗体。
[0898]也可以优选使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因插入适当的载体中，再导入宿主中，由此表达由该基因编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等人确立(Eur.J.B1chem.(1990) 192 (3)，767-775)。另外，如下所述重组抗体的制造方法也是公知的。
[0899]例如，由产生抗IgA抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IgA抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤中提取总RNA。作为用于从细胞中提取mRNA的方法，例如可使用如下所述的方法。
[0900]-胍超离心法(B1chemistry(1979) 18 (24)，5294-5299)；
[0901]-AGPC 法(Anal.B1chem.(1987) 162(1), 156-159)。
[0902]所提取的mRNA可使用mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareB1science制)等进行纯化。或者，还市售有象QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare B1science制)等用于从细胞中直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可由杂交瘤获得mRNA。使用逆转录酶，可由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生化学工业)等合成。另外，为了 cDNA的合成和扩增，可以适当采用使用了SMART RACE cDNA 扩增试剂盒(Clontech 制)和 PCR 的 5，-RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1988)85 (23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989) 17 (8)，2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
[0903]由所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择集落后，可以由形成该集落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，关于该重组载体是否具有目标cDNA的核苷酸序列，这可以通过公知的方法、例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
[0904]为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’ -RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先，以从杂交瘤细胞中提取的RNA为模板合成cDNA，获得5’ -RACE cDNA文库。在5’ -RACE cDNA文库的合成中可适当地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
[0905]以所得的5’_RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。根据公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的核苷酸序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
[0906]具体而言，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的Y 1、Y 2a> Y 2b> Y 3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常3’侧的引物使用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5’侧的引物则使用5’ RACEcDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
[0907]使用如此扩增而得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白针对IgA的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得抗IgA的抗体时，进一步优选抗体对IgA的结合是特异性的。与IgA结合的抗体例如可如下进行筛选:
[0908]步骤⑴，使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与IgA接触；
[0909]步骤⑵，检测I gA与抗体的结合；以及
[0910]步骤(3),选择与IgA表达细胞结合的抗体。
[0911]检测抗体与IgA的结合的方法是公知的。具体而言，通过之前所述的ELISA等方法，可检测出抗体与IL-6R表达细胞的结合。
[0912]作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还优选采用淘选法，其利用了噬菌体载体。由多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(ScFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体中，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。根据需要重复该操作，从而可以浓缩具有所期望的结合活性的scFv。
[0913]得到目标的编码抗IgA抗体V区的cDNA后，该cDNA被识别插入该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的核苷酸序列中出现的频率低的核苷酸序列。进而，为了将I拷贝的消化片段以正确方向插入载体中，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上消化的编码抗IgA抗体V区的cDNA插入适当的表达载体中，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因和编码上述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包含在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入上述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可在保持有编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适当地配置消化上述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
[0914]为了制造抗IgA单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因插入表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子或启动子。另外，可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:5)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。接着，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IgA抗体的DNA的重组细胞。
[0915]为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于其他的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化(co-transfect)成相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，将编码H链和L链的DNA插入单一表达载体中，从而可以转化宿主细胞(参照国际公开第WO 1994/011523号)。
[0916]用于将分离的抗体基因导入适当的宿主中来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合分子。将真核细胞用作宿主细胞时，可适当使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，动物细胞可例示下述细胞。
[0917](I)哺乳动物细胞:CH0(中国仓鼠卵巢细胞株)、C0S (猴肾细胞株)、骨髓瘤(Sp2/O、NSO等)、BHK (幼仓鼠肾细胞株)、HEK293(携带已剪切腺病毒(Ad)OTNA的人胚肾细胞株)、PER.C6细胞(用5型腺病毒(Ad5)ElA和ElB基因转化的人胚视网膜细胞株)、Hela、Vero、HEK293(携带已剪切腺病毒(Ad) OTNA的人胚肾细胞株)等(Current Protocols inProtein Science (May, 2001, Unit5.9, Table5.9.1))；
[0918](2)两栖动物细胞:非洲爪蟾卵母细胞等；
[0919](3)昆虫细胞:sf9、sf21、Tn5 等。
[0920]或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。在植物细胞的转化中，可以适当使用进行了愈伤组织培养的细胞。
[0921]进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞:
[0922]-酵母:酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属；
[0923]-丝状真菌:黑曲霉菌(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)属。
[0924]另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适当利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
[0925]除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以由导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，再将该注入了的胚胎导入母山羊体内。由接受了胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白形成的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(B1/Technology (1994)，12(7)，699-702)。
[0926]对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结合结构域，可以适当采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，所述基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工修饰。基因重组型抗体包含例如人源化(humanized)抗体等。这些修饰抗体可使用公知方法适当制造。
[0927]为了制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个构架区(FR)夹持的3个互补性决定区(complementarity-determiningreg1n ;⑶R)构成。⑶R实质上是决定抗体结合特异性的区域。⑶R的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便在具有不同结合特异性的抗体之间也往往显示出高度的同源性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体中。
[0928]人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的⑶R移植到人抗体中的应用了⑶R移植技术(⑶R grafting technology)的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的核苷酸序列。针对4个FR分别准备引物。通常，将小鼠CDR移植至人FR时，选择与小鼠FR同源性高的人FR，但在维持CDR功能方面认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同源性高的氨基酸序列。
[0929]另外，连接的核苷酸序列被设计成相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。其结果，得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的核苷酸序列被设计成相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR经由小鼠⑶R序列来连接。
[0930]最终3个⑶R和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5’末端和3’末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开第 W01996/002576 号)。
[0931]通过定性或者定量地测定并评价如上制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以优选选择人抗体FR，以便经由⑶R连接时该⑶R形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适的抗原结合位点的方式取代FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR中导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分核苷酸序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了核苷酸序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸取代的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望的性质的突变FR序列(CancerRes.，(1993)53，851-856)。
[0932]此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开W01993/012227, W01992/003918, W01994/002602, W01994/025585, W01996/034096、W01996/033735)作为免疫动物，通过DNA免疫可以获得所期望的人抗体。
[0933]进而，使用人抗体文库通过淘选法获得人抗体的技术也是已知的。例如,人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体中，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适当的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，从而可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、W01993/011236、W01993/019172、W01995/001438、W01995/015388)。
[0934]另外，作为获得抗体基因的方法，除了上述方法外，还可适当地使用如Bernasconi等人(Science (2002) 298，2199-2202)或国际公开W02008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
[0935]EU编号和Kabat编号
[0936]根据本发明中使用的方法，分配给抗体的⑶R和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nat1nal Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表不。
[0937]离子浓度条件
[0938]金属离子浓度条件
[0939]在本发明的一个方案中，离子浓度是指金属离子浓度。“金属离子”是指属于除了氢以外的碱金属和铜族等第I族、碱土金属和锌族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第IV族、铁族和钼族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亚族的元素、以及锑、铋、针等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称之为离子化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。
[0940]作为本发明中优选的金属离子的实例，可以列举钙离子。钙离子参与多种生命现象的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩、白细胞的运动和吞噬等的活化、血小板的变形和分泌等的活化、淋巴细胞的活化、组胺的分泌等肥大细胞的活化、儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答、胞吐作用、递质从神经元末端的释放、神经元的轴浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大多已知。例如，还熟知钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
[0941]本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可以列举低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。结合活性随钙离子浓度条件而变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分子对抗原的结合活性发生变化。例如可以列举:高钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性高于低钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。此外还可以列举:低钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性高于高钙离子浓度条件下抗原结合分子对抗原的结合活性的情形。
[0942]本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自100μΜ至1mM之间的浓度。此外，在其他方案中，可以是选自200 μ M至5mM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自400μΜ至3mM之间的浓度，在其他的方案中也可以是选自200 μ M至2mM之间的浓度。进而，还可以是选自400μ M至ImM之间的浓度。特别优选列举选自与生物体内血浆中(血中)的钙离子浓度接近的500 μ M至2.5mM之间的浓度。
[0943]本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0.ΙμΜ至30μΜ之间的浓度。此外，在其他方案中，可以是选自0.2μΜ至20μΜ之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自0.5μΜ至ΙΟμΜ之间的浓度，在其他的方案中也可以是选自I μ M至5 μ M之间的浓度。进而，还可以是选自2 μ M至4μ M之间的浓度。特别优选列举选自与生物体内的早期核内体内的离子化钙浓度接近的I μ M至5 μ M之间的浓度。
[0944]本发明中，低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性意指，抗原结合分子在选自0.1 μ M至30 μ M之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自100μΜ至1mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。优选意指抗原结合分子在选自0.5μ M至10μ M之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200μΜ至5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指生物体内的早期核内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于生物体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子在选自ΙμΜ 至5μΜ之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500 μ M至2.5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。
[0945]抗原结合分子对抗原的结合活性是否随金属离子浓度条件而变化，这可以通过使用例如上述结合活性项目中记载的公知测定方法来确定。例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变得更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。
[0946]进而，本发明中，“低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。需要说明的是，本发明中有时也将“低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性”记载为“低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”，此外，有时也将“使低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性”记载为“使低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”。
[0947]本领域技术人员可以适当选择测定抗原结合活性时的钙离子浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、3 7 °C的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore (GE Healthcare)等进行测定。关于抗原结合分子与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，可以评价对可溶型抗原的结合活性；在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，可以评价对膜型抗原的结合活性。
[0948]本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件下的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件下的KD (Dissociat1n constant:解离常数)与高钙离子浓度条件下的KD之比即KD (Ca3 μ M) /KD(Ca 2mM)的值为2以上，进一步优选KD(Ca 3 μ M)/KD(Ca 2mM)的值为10以上，进一步优选KD (Ca 3 μ M) /KD (Ca 2mM)的值为40以上。KD (Ca 3 μ M) /KD (Ca 2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
[0949]作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD (解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD (Apparent dissociat1n constant:表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。
[0950]此外，作为显示本发明的抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性与高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可优选使用例如解离速率常数kd (Dissociat1n rate constant:解离速率常数)。代替KD (解离常数)而使用kd (解离速率常数)来作为显示结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速率常数)与高钙浓度条件下的kd (解离速率常数)之比kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。对Kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以是50、100、200等任意的值。
[0951]作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd (Apparent dissociat1n rate constant:表观解离速率常数)。kd (解离速率常数)和表观kd (表观解离速率常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。需要说明的是,本发明中，在测定不同钙离子浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。
[0952]例如，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)~(C)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得:
[0953]步骤(a)，获得低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性；
[0954]步骤(b)，获得高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性；
[0955]步骤(C)，选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。
[0956]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)~(c)的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库的筛选来获得:
[0957]步骤(a)，在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库与抗原接触；
[0958]步骤(b)，将在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子置于低钙浓度条件下；
[0959]步骤(C)，对在上述步骤(b)中发生解离的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。
[0960]此外，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)~(d)的抗原结合结构域或抗原结合分子或其文库的筛选来获得:
[0961]步骤(a)，在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触；
[0962]步骤(b)，选择在上述步骤(a)中未与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子;
[0963]步骤(C)，使在上述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合；
[0964]步骤(d)，对在上述步骤(C)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。
[0965]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)~(C)的筛选方法来获得:
[0966]步骤(a)，在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与固定有抗原的柱接触；
[0967]步骤(b)，将在上述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗原结合分子在低钙浓度条件下从柱上洗脱；
[0968]步骤(C)，对在上述步骤(b)中被洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。
[0969]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)~(d)的筛选方法来获得:
[0970]步骤(a)，在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库通过固定有抗原的柱；
[0971]步骤(b)，对在上述步骤(a)中未与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗原结合分子进行回收；
[0972]步骤(C)，使在上述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗原结合分子在高钙浓度条件下与抗原结合；
[0973]步骤(d)，对在上述步骤(C)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。
[0974]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子可通过包含以下步骤(a)~(d)的筛选方法来获得:
[0975]步骤(a)，在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗原结合分子的文库与抗原接触；
[0976]步骤(b)，获得在上述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗原结合分子；
[0977]步骤(C)，将在上述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗原结合分子置于低钙浓度条件下；
[0978]步骤(d)，对上述步骤(C)中抗原结合活性弱于上述步骤(b)中选择的标准的抗原结合结构域或抗原结合分子进行分离。
[0979]需要说明的是，上述步骤可以重复两次以上。因此，根据本发明可提供通过上述筛选方法中进一步包括将步骤(a)~(C)或步骤(a)~(d)重复两次以上的步骤的筛选方法而获得的低钙离子浓度条件下的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。步骤(a)~(C)或步骤(a)~(d)的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
[0980]本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1 μ M~30 μ M之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可以列举0.5 μ M~10 μ M之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可以列举生物体内的早期核内体内的离子化钙浓度，具体可以列举I μ M~5 μ M下的抗原结合活性。另外，高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μΜ~1mM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可以列举200 μ M~5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可以列举生物体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可以列举0.5mM~2.5mM时的抗原结合活性。
[0981]抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，关于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适当决定。抗原结合结构域或抗原结合分子的抗原结合活性可以作为KD(Dissociat1n constant:解离常数)、表M KD (Apparent dissociat1n constant:表观解离常数)、解离速率 kd (Dissociat1nrate:解离速率常数)、或表观kd (Apparent dissociat1n:表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore (GEhealthcare)、斯卡查德图、FACS等。
[0982]本发明中，选择高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤，与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的步骤含义相同。
[0983]只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则对高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上，进一步优选为10倍以上，更优选为40倍以上。
[0984]通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以是任意的抗原结合结构域或抗原结合分子，例如，可以筛选上述的抗原结合结构域或抗原结合分子。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗原结合分子，也可以筛选氨基酸序列被取代的抗原结合结构域或抗原结合分子。
[0985]文座
[0986]根据一个方案，本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以由文库获得，所述文库主要由多个抗原结合分子形成，所述多个抗原结合分子的序列彼此不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基。作为离子浓度的实例，优选列举金属离子浓度或氢离子浓度。
[0987]本说明书中，“文库”是指多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多个抗原结合分子或含有抗原结合分子的多个融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列彼此不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
[0988]本说明书中，序列彼此不同的多个抗原结合分子的记载中的“序列彼此不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同。即，文库中的彼此不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为16至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10，000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10，000个。所以，本发明中的“序列彼此不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同，更具体意指序列彼此不同的抗原结合分子存在16至114个分子、优选17至112个分子、进一步优选18至111个分子、特别优选18至101°个分子。
[0989]此外，本发明中的主要由多个抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多个”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒而言，通常是指这些物质的两种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面彼此不同，则表示该物质存在两种以上。作为实例，可以列举在氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外序列实质上相同、且优选存在序列相同的本发明的2个以上的抗原结合分子时，则存在多个本发明的抗原结合分子。在其他例子中，当除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、且优选存在序列相同的本发明的2个以上的多核苷酸分子时，则存在多个本发明中的多核苷酸分子。
[0990]进而，本发明中的主要由多个抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体而言，优选显示出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在14个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在15个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在16个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在17个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由显示出这种结合活性的抗原结合分子至少存在18个分子的文库中获得。在其它表述中，也可适当表述为在文库中的序列不同的独立克隆的数量中抗原结合分子对抗原的结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的比例。具体而言，本发明的抗原结合结构域可以由显示出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1 %至80 %、优选0.5%至60%、更优选1%至40%、进一步优选2%至20%、特别优选4%至10%的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也和上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表述。此外，病毒的情形也和上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表述。
[0991]使抗原结合结构域的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸
[0992]通过上述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗原结合分子可以任意制备，例如，在金属离子为钙离子浓度的情况下，可以使用预先存在的抗原结合分子、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库中导入能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得到的抗体或文库(能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库、或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得到的文库等)等。
[0993]如上所述，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，不论其种类如何。钙结合模体为本领域技术人员所周知，并且有详细记载(例如Springer等人(Cell (2000) 102，275-277) ；Kawasaki 和 Kretsinger(Protein Prof.(1995)2, 305-490)；Moncrief 等人(J.Mol.Evol.(1990)30,522-562) ；Chauvaux 等人(B1chem.J.(1990)265, 261-265) ；Bairoch 和 Cox(FEBS Lett.(1990)269, 454-456) ；Davis(NewB1l.(1990) 2, 410-41 9) ;Schaefer 等人(Genomics (1995) 25，638 ~643) ;Economou 等人(EMB0J.(1990)9, 349-354) ;Wurzburg 等人(Structure.(2006) 14, 6, 1049-1058)) ? 即，本发明的抗原结合分子中可以含有ASGPR、CD23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知钙结合模体。作为这种钙结合模体的优选实例，除了上述钙结合模体之外，还可以列举SEQ IDNO:6所记载的抗原结合结构域中所含的钙结合模体。
[0994]此外，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，也可优选使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选列举例如丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gln(Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。
[0995]含有上述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的CDR3中含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由重链的⑶R3的以Kabat编号表示的95位、96位、10a位和/或101位含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
[0996]此外，在本发明的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDRl中含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDRl的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位含有该氨基酸、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
[0997]此外，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR2中含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中提供下述文库，所述文库主要由轻链的CDR2的以Kabat编号表示的50位含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
[0998]进而，在其他方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR3中含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的CDR3的以Kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
[0999]此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方案来获得，所述文库主要由选自上述记载的轻链的⑶RU⑶R2和⑶R3中的2个或3个⑶R含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，所述文库主要由轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一者以上含有该氨基酸残基、且序列彼此不同的抗原结合分子形成。
[1000]在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的构架序列具有人的种系构架序列。因此，在本发明的一个方案中，若构架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明中的“含有种系序列”意指本发明的构架序列的一部分与任意的人的种系构架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2序列为多个不同的人的种系构架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。
[1001]作为构架的实例，例如优选列举现在已知的完全人型构架区的序列，其包含在V-Base (http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中。这些构架区的序列能够适当用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可根据其相似性来分类(Tomlinson 等人(J.Mol.B1l.(1992) 227, 776-798) Williams 和 Winter (Eur.J.1mmunol.(1993)23，1456-1461)和 Cox 等人(Nat.Genetics (1994) 7, 162-168))。可以从分类为 7 个亚类的Vk、分类为10个亚类的V λ、分类为7个亚类的VH中适当选择合适的种系序列。
[1002]完全人型VH序列并不仅限于下述序列，优选列举例如VHl亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1_69)、VH2 亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3 亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5 亚类(VH5-51)、VH6 亚类(VH6-1)、VH7 亚类(VH7-4、VH7_81)的 VH 序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等人(J.Exp.Med.(1998) 188, 1973-1975))等中，本领域技术人员可以根据它们的序列信息适当设计本发明的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型构架或构架的亚区域(sub-reg1n)。
[1003]完全人型Vk序列并不仅限于下述序列，例如优选列举:分类为Vkl亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、Lll、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、018 ;分类为 Vk2 亚类的 Al、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011 ;分类为 Vk3 亚类的 All、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25 ;分类为 Vk4 亚类的 B3 ;分类为 Vk5亚类的B2(本说明书中也称为Vk5-2);分类为Vk6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等人(Eur.J.1mmunol.(2001)31, 1017-1028) ； Schab Ie 和 Zachau (B1l.Chem.HoppeSeyler (1993) 374, 1001-1022)和 Brensing-Kuppers 等人(Gene (1997) 191，173-181))。
[1004]完全人型的V λ序列并不仅限于下述序列，例如优选列举:分类为VLl亚类的Vl-2、Vl-3、Vl-4、Vl-5、Vl-7、Vl-9、Vl-1U Vl-13、Vl-16、Vl-17、Vl-18、Vl-19、V1-20、V1-22 ;分类为 VLl 亚类的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19 ;分类为 VL3 亚类的 V3-2、V3-3、V3-4 ;分类为 VL4 亚类的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6 ;分类为 VL5 亚类的 V5-1、V5-2、V5-4、V5-6 等(Kawasaki 等人(Genome Res.(1997)7，250-261))。
[1005]通常，这些构架序列根据一个或更多的氨基酸残基的区别而彼此不同。这些构架序列可以与本发明中的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明中的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基” 一起使用的完全人型构架的实例，并不仅限于此，另外还可以列举 KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY、POM 等(例如，上述的 Kabat 等人(1991)和 Wu 等人(J.Exp.Med.(1970) 132,211-250))。
[1006]本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中的有害免疫应答的一个理由如下。通常的免疫应答中产生的亲和性成熟步骤的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的⑶R的附近，对构架区的残基也造成影响。这些构架的突变在种系基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于种系基因所表达的构架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系构架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性达到最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。
[1007]为了制作本发明的、上述可变区序列的序列、重链可变区或轻链可变区的序列、或CDR序列或构架序列中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的抗原结合分子，可以适当地采用位点特异性诱变法(Kunkel等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82, 488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。
[1008]例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的构架序列的轻链可变区与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合，可以制作含有本发明的多个序列彼此不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，例如优选列举:将SEQ IDN0:6(Vk5-2)所记载的轻链可变区序列和作为随机可变区序列文库而制作的重链可变区组合而成的文库。
[1009]此外，也可以设计成上述被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的构架序列的轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。在本发明中这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ ID N0:6(Vk5-2)所记载的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可以列举表1或表2所记载的氨基酸残基。
[1010][表1]
[1011]

【权利要求】
1.可形成免疫复合体的抗原结合分子的用于使该抗原从血浆中消失的应用，是指包含(i)Fe区和(ii)两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子的应用，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域； 所述免疫复合体包含(a)两分子以上的该抗原结合分子和(b)两分子以上的抗原，其中，所述抗原包含两个以上的抗原结合单元。
2.权利要求1所述的应用，其中，离子浓度条件为钙离子浓度条件。
3.权利要求2所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在低钙离子浓度条件下对抗原的结合活性低于在高钙离子浓度条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。
4.权利要求1~3中任一项所述的应用，其中，离子浓度条件为pH条件。
5.权利要求4所述的应用，其中，所述抗原结合结构域是在pH酸性范围对抗原的结合活性低于在PH中性范围条件下对抗原的结合活性的抗原结合结构域。
6.权利要求1~5中任一项所述的应用，其中，包含两个以上抗原结合单元的所述抗原为多聚体。
7.权利要求6所述的应用，其中，所述抗原为⑶F、⑶F-1、⑶F-3(Vgr-2)、⑶F-5 (BMP-14、CDMP-1)、⑶F_6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F-8 (肌肉生成抑制素)、GDF-9、GDF-15 (MIC-1)、TNF、TNF-a、TNF-α β、TNF-β 2、TNFSF1 (TRAILΑρο-2 配体、TL2) 、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLU THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配体、LTg)、TNFSF15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSFIA(TNF-a 肌联蛋白(Connectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF_b LTa,TNFSFI),TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPl)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMl、MD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8(CD30 配体 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配体 CD 137 配体)、VEGF、IgE、IgA、IgG、IgM、RANKL, TGF- a、TGF- β、泛特异性的TGF- β或IL-8中的任一种。
8.权利要求1~5中任一项所述的应用，其中，包含两个以上抗原结合单元的所述抗原为单体。
9.权利要求1~8中任一项所述的应用，其中，抗原结合分子为多特异性或多互补位的抗原结合分子、或者抗原结合分子混合物。
10.权利要求1~9中任一项所述的应用，其中，所述Fe区分别为SEQID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区。
11.权利要求1~9中任一项所述的应用，其中，所述Fe区为在pH酸性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
12.权利要求11所述的应用，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的238位、244位、245位、249位、250位、251位、252位、253位、254位、255 位、256 位、257 位、258 位、260 位、262 位、265 位、270 位、272 位、279 位、283 位、285位、286 位、288 位、293 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312 位、314 位、316位、317 位、318 位、332 位、339 位、340 位、341 位、343 位、356 位、360 位、362 位、375 位、376位、377 位、378 位、380 位、382 位、385 位、386 位、387 位、388 位、389 位、400 位、413 位、415位、423 位、424 位、427 位、428 位、430 位、431 位、433 位、434 位、435 位、436 位、438 位、439位、440位、442位或447位的氨基酸。
13.权利要求12所述的应用，其中，所述Fe区为SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表不的Fe区的氨基酸序列中以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸: . 238位氨基酸为Leu ； . 244位氨基酸为Leu ； . 245位氨基酸为Arg ； . 249位氨基酸为Pro ； . 250位氨基酸为Gln或Glu中的任一个；或者. 251位氨基酸为Arg、Asp、Glu或Leu中的任一个； . 252位氨基酸为Phe、Ser > Thr或Tyr中的任一个； . 254位氨基酸为Ser或Thr中的任一个； . 255位氨基酸为Arg、Gly、Ile或Leu中的任一个； .256 位氨基酸为 Ala 、Arg、Asn、Asp、Gin、Glu、Pro 或 Thr 中的任一个； . 257位氨基酸为Ala、lie、Met、Asn、Ser或Val中的任一个； . 258位氨基酸为Asp ； . 260位氨基酸为Ser ； . 262位氨基酸为Leu ； .270位氨基酸为Lys ；. 272位氨基酸为Leu或Arg中的任一个；.279位氨基酸为 Ala、Asp、Gly、His、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 283 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr>Trp或Tyr中的任一个； . 285位氨基酸为Asn ； . 286位氨基酸为Phe ； . 288位氨基酸为Asn或Pro中的任一个； . 293位氨基酸为Val ； . 307位氨基酸为Ala、Glu、Gln或Met中的任一个； . 311位氨基酸为 Ala、Glu、lie、Lys> Leu、Met、Ser、Val 或 Trp 中的任一个； . 309位氨基酸为Pro ； . 312位氨基酸为Ala、Asp或Pro中的任一个； . 314位氨基酸为Ala或Leu中的任一个； . 316位氨基酸为Lys ； . 317位氨基酸为Pro ；. 318位氨基酸为Asn或Thr中的任一个； . 332 位氨基酸为 Phe、His、Lys> Leu、Met、Arg、Ser 或 Trp 中的任一个； . 339位氨基酸为Asn、Thr或Trp中的任一个；. 341位氨基酸为Pro ； . 343 位氨基酸为 Glu、His、Lys> Gin、Arg、Thr 或 Tyr 中的任一个； . 375位氨基酸为Arg ； . 376位氨基酸为Gly、lie、Met、Pro、Thr或Val中的任一个；. 377位氨基酸为Lys ； . 378位氨基酸为Asp、Asn或Val中的任一 个；. . 380位氨基酸为Ala、Asn、Ser或Thr中的任一个； . 382 位氨基酸为 Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个； . 385位氨基酸为 Ala、Arg、Asp、Gly、His、Lys> Ser 或 Thr 中的任一个； . 386位氨基酸为 Arg、Asp、lie、Lys> Met、Pro、Ser 或 Thr 中的任一个； . 387位氨基酸为Ala、Arg、His、Pro、Ser或Thr中的任一个； . 389位氨基酸为Asn、Pro或Ser中的任一个；. . 423位氨基酸为Asn ； . 427位氨基酸为Asn ； . 428位氨基酸为Leu、Met、Phe、Ser或Thr中的任一个； . 430 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val 或Tyr中的任一个；. 431位氨基酸为His或Asn中的任一个； . 433位氨基酸为 Arg、Gin、His、lie、Lys> Pro 或 Ser 中的任一个； .434位氨基酸为 Ala、Gly、His、Phe、Ser、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 436 位氨基酸为 Arg、Asn、His、lie、Leu、Lys> Met 或 Thr 中的任一个； 438位氨基酸为Lys、Leu、Thr或Trp中的任一个； .440位氨基酸为Lys ;或者 . 442位氨基酸为Lys、308位氨基酸为lie、Pro或Thr中的任一个。
14.权利要求1~9中任一项所述的应用，其中，所述Fe区为在pH中性范围条件下对FcRn的结合活性与SEQ ID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的结合活性相比增强的Fe区。
15.权利要求14所述的应用，其中，所述Fe区为下述Fe区:在SEQID NO: 13、14、15或16中任一个所表示的Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸被取代的Fe区:以EU编号表示的237位、248位、250位、252位、254位、255位、256位、257位、258位、265 位、286 位、289 位、297 位、298 位、303 位、305 位、307 位、308 位、309 位、311 位、312位、314 位、315 位、317 位、332 位、334 位、360 位、376 位、380 位、382 位、384 位、385 位、386位、387 位、389 位、424 位、428 位、433 位、434 位或 436 位。
16.权利要求15所述的应用，其中，所述Fe区为在SEQID NO: 13、14、15、或16中任一个所表不的Fe区的氨基酸序列中，以EU编号表不的选自以下的至少一个以上的氨基酸: . 237位氨基酸为Met ； . 248位氨基酸为Ile ； . 250 位氨基酸为 Ala、Phe、lie、Met、Gin、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；. 252位氨基酸为Phe、Trp或Tyr中的任一个； .254位氨基酸为Thr ； . 255位氨基酸为Glu ； .256位氨基酸为Asp、Asn、Glu或Gln中的任一个； . 257 位氨基酸为 Ala、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Ser、Thr 或 Val 中的任一个； . 258位氨基酸为His ； . 265位氨基酸为Ala ； . 286位氨基酸为Ala或Glu中的任一个； .289位氨基酸为His ； . 297位氨基酸为Ala ； . 303位氨基酸为Ala ； .305位氨基酸为Ala ； . 307位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Val、Trp或Tyr中的任一个； . 308位氨基酸为 Ala、Phe、lie、Leu、Met、Pro、Gln 或 Thr 中的任一个； . 309位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro或Arg中的任一个； . 311位氨基酸为Ala、His或Ile中的任一个； .312位氨基酸为Ala或His中的任一个； . 314位氨基酸为Lys或Arg中的任一个； .315位氨基酸为Ala、Asp或His中的任一个； .317位氨基酸为Ala ； .332位氨基酸为Val ； . 334位氨基酸为Leu ； . 360位氨基酸为His ； .376位氨基酸为Ala ； .380位氨基酸为Ala ； .382位氨基酸为Ala ； . 384位氨基酸为Ala ； . 385位氨基酸为Asp或His中的任一个； . 386位氨基酸为Pro ； . 387位氨基酸为Glu ； .389位氨基酸为Ala或Ser中的任一个； .424位氨基酸为Ala ； . 428位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Asn、Pro、Gin、Ser> Thr> Val、Trp或Tyr中的任一个； .433位氨基酸为Lys ； . 434位氨基酸为Ala、Phe、His、Ser> Trp或Tyr中的任一个；或者 . 436 位氛基酸为 His、lie、Leu> Phe> Thr 或 Val。
17.权利要求1~13中任一项所述的应用，其中，所述Fe区包含对Fe Y受体的结合活性比天然型人IgG的Fe区对Fe Y受体的结合活性高的Fe区。
18.权利要求17所述的应用，其中，所述Fe区的氨基酸序列中，选自以下的至少一个以上的氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸:以EU编号表示的221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位或440位。
19.权利要求18所述的应用，其中，所述Fe区的氨基酸序列中，包含以EU编号表示的选自以下的至少一个的氨基酸: 221位氨基酸为Lys或Tyr中的任一个； 222位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 223位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个； 224位氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 225位氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个； 227位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 228位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 230位氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个； 231位氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个； 232位氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 233位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个； 234位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； 235位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； 236位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； 237位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个； 238位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个；
239位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个；. 240位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；. 241位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个； . 243 位氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 244位氨基酸为His ； . 245位氨基酸为Ala ； .246位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； . 247 位氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；. 249位氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个； . 250位氨基酸为Glu或Gln中的任一个； . 251位氨基酸为Phe ； . 254位氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个； . 255位氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个； . 256位氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个； . 258位氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个； . 260位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； . 262位氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个； . 263位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； . 264位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr > Trp或Tyr中的任一个； . 265位氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 266位氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； . 267位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr> Val、Trp或Tyr中的任一个； . 268位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Trp中的任一个； . 269位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个； . 270位氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp 或 Tyr中的任一个； . 271位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys> Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .272位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个； . 273位氨基酸为Phe或Ile中的任一个； . 274 位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg> Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；. 275位氨基酸为Leu或Trp中的任一个； . 276 位氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .278 位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、SerΛ ThrΛVal或Trp中的任一个； .279位氨基酸为Ala ； .280 位氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个； .281位氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个； .28.2位氨基酸为Glu、Gly、L ys、Pro或Tyr中的任一个； .28.3 位氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个； .284位氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个； .285位氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一个； .286位氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个； .288位氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个； .290位氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个； .291位氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个； .29.2位氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个； .29.3位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr中的任一个； .294位氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个； .295位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .296位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr 或Val中的任一个； .297位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .298位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个； .299位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .300位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个； .301位氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； .30.2位氨基酸为Ile ； .30.3位氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个； .304位氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个； .305位氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个； .311位氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个； .31.3位氨基酸为Phe ； .315位氨基酸为Leu;.317位氨基酸为Glu或Gln ； . 318位氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个； .320 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 322 位氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .323位氨基酸为Ile ； . 324位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 325位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .326位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个； . 327位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； . 328位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .329位氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .330位氨基酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； . 331位氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 332位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .333位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val 或 Tyr中的任一个； .334位氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个； . 335位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr中的任一个； .336位氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个； .337位氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个； . 339 位氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个； . 376位氨基酸为Ala或Val中的任一个； . 377位氨基酸为Gly或Lys中的任一个； . 378位氨基酸为Asp ； .379位氨基酸为Asn ； . 380位氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个； .382位氨基酸为Ala或Ile中的任一个；385位氨基酸为Glu ； 392位氨基酸为Thr ； 396位氨基酸为Leu ； 421位氨基酸为Lys ；
427位氨基酸为Asn ； 428位氨基酸为Phe或Leu中的任一个； 429位氨基酸为Met ； 434位氨基酸为Trp ； 436位氨基酸为Ile ;或者 440位氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
20.权利要求1~16中任一项所述的应用，其中，所述Fe区为对抑制型FeY受体的结合活性高于对活性型Fe Y受体的结合活性的Fe区。
21.权利要求20所述的应用，其中，所述抑制型FeY受体为人FcyRIIb。
22.权利要求20或21中任一项所述的应用，其中，所述活性型FeY受体为人FcyRIa、AFc Y RIIa(R)、人 Fe YRIIa(H)、人 Fe YRIIIa(V)或人 Fe YRIIIa(F)。
23.权利要求20~22中任一项所述的应用，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位或328位的氨基酸包含与天然型人IgG的Fe区的氨基酸不同的氨基酸。
24.权利要求23所述的应用，其中，所述Fe区的以EU编号表示的238位氨基酸为Asp、或者328位氨基酸为Glu。
25.权利要求23或24所述的应用，其中，所述Fe区的氨基酸序列中，为以EU编号表示的选自以下的至少一个以上的氨基酸: 233位氨基酸为Asp ； 234位氨基酸为Trp或Tyr中的任一个； 237 位氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Leu、Met、Phe、Trp 或 Tyr 中的任一个； 239位氨基酸为Asp ； 267位氨基酸为Ala、Gln或Val中的任一个； 268位氨基酸为Asn、Asp或Glu中的任一个； 271位氨基酸为Gly ； 326 位氨基酸为 Ala、Asn、Asp、Gin、Glu、Leu、Met、Ser 或 Thr 中的任一个； 330位氨基酸为Arg、Lys或Met中的任一个； 323位氨基酸为lie、Leu或Met中的任一个；或者 296位氨基酸为Asp。
26.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的筛选方法，该方法包括以下的步骤(a)~⑴: 步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域； 步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因； 步骤(C)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fe区的基因进行有效连接； 步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞携带在上述步骤(C)中进行了有效连接的基因；步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子； 步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触； 步骤(g)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成。
27.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)~(d): 步骤(a)，使包含Fe区和两个以上的抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触，所述抗原结合结构域中的至少一个是对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域； 步骤(b)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成； 步骤(C)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体携带编码在上述步骤(b)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因； 步骤(d)，从上述步骤(C)中得到的培养液中分离抗原结合分子。
28.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)~⑴: 步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域； 步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因； 步骤(C)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fe区的基因进行有效连接； 步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞携带在上述步骤(C)中进行了有效连接的基因； 步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子； 步骤(f)，使上述步骤(e)中得到的抗原结合分子与抗原接触； 步骤(g)，评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成； 步骤(h)，培养包含载体的宿主细胞，所述载体携带编码在上述步骤(g)中确认到免疫复合体的形成的抗原结合分子的基因； 步骤(i)，从上述步骤(h)中得到的培养液中分离抗原结合分子。
29.具有使抗原从血浆中消失的功能的抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下的步骤(a)~(e)，还包括如下步骤:使通过该制备方法得到的抗原结合分子与抗原接触，以评价包含该抗原结合分子和该抗原的免疫复合体的形成； 步骤(a)，得到对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域； 步骤(b)，得到编码上述步骤(a)中选择的抗原结合结构域的基因； 步骤(C)，将上述步骤(b)中得到的基因与编码Fe区的基因进行有效连接； 步骤(d)，培养宿主细胞，所述宿主细胞携带在上述步骤(C)中进行了有效连接的基因； 步骤(e)，从上述步骤(d)中得到的培养液中分离抗原结合分子。
【文档编号】C12N15/09GK104080909SQ201280068428
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2011年11月30日
【发明者】井川智之, 广庭奈绪香 申请人:中外制药株式会社