脊髓灰质炎病毒株的鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于鉴定和/或区分脊髓灰质炎病毒株尤其是用于疫苗生产的脊髓灰质炎病毒株的方法。所述方法基于使用寡核苷酸(即，引物和/或探针)的选择性杂交，所述方法使得能够根据那些脊髓灰质炎病毒株之间存在的核苷酸多态性来区分紧密相关但又不相同的脊髓灰质炎病毒株。优选地，所述方法采用用于检测选择性杂交的扩增测定或扩增-连接测定。本发明还涉及用于本发明的方法的寡核苷酸和包含这种寡核苷酸和任选的用于实施本发明的方法的酶和缓冲液的试剂盒。
【专利说明】脊髓灰质炎病毒株的鉴定
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒学和病毒疫苗学领域。具体地，本发明涉及用于鉴定疫苗专用脊 髓灰质炎病毒株的工具和方法。
【背景技术】
[0002] 活的减毒的口服脊髓灰质炎疫苗（0PV)和灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗（IPV)的使 用已经显著地减少了脊髓灰质炎的病例数目和脊髓灰质炎的爆发（Dutta，2008 ;Crawford and Buttery，2010)。世界卫生组织（WHO)的全球根除脊髓灰质炎行动（Global Polio Eradication Initiative)目前将注意力集中在消灭疾病和根除野生脊髓灰质炎病毒上 (WH0, 2003 ;Sutter et al.，2003)。尽管在普及性疫苗接种方面付出了很大努力，但是在最 近几年中仍然报道了几十例脊髓灰质炎病例（Crawford and Buttery, 2010 ;Global Polio Eradication Initiative. Global polio case count. 2011.可获自：（Novl4,2011 取得 的）；Kew et al.，2005)。用0PV接种疫苗可引入疫苗衍生脊髓灰质炎病毒，导致脊髓灰质 炎的爆发（Kew et al.，2005)。这些疫苗衍生脊髓灰质炎病毒中有一些有高毒力并且是可 传染的（Boot et al.，2004;Kew et al.，2005)。显然，IPV不会有这个缺点。然而，目前 IPV的生产能力非常有限，IPV使用的增加要求建立更多的生产设备。这些设备必须应对 密闭性方面严苛的安排，因为IPV是使用有毒力的脊髓灰质炎毒株生产的（2003)。因此， WHO决定促进开发基于减毒的脊髓灰质炎病毒（例如Sabin毒株）的IPV(Heymann et al.， 2005 ;Heymann et al. ,2006)。因此，即使不能完全消除从生产设备逃逸的病毒造成有害影 响或意外感染制造人员的风险，但是可使上述风险降到最低（Kew et al. ,2005)。
[0003] 在基于野生型毒株的IPV向基于Sabin毒株的IPV转变的过程中，IPV的生产者 可能既使用野生型脊髓灰质炎病毒株也使用减毒的脊髓灰质炎病毒株（表1)。明确地鉴定 用于IPV生产的脊髓灰质炎病毒株对于疫苗发放而言是重要的质量控制试验。目前，血清 学方法用于鉴定和定量化IPV中存在的三种脊髓灰质炎病毒血清型，但是其通常不能区分 野生型疫苗毒株和减毒的疫苗毒株（Westdijk et al.，2011)。尽管可以使用能够区分野 生型脊髓灰质炎病毒株和减毒的脊髓灰质炎病毒株的血清学测定，但是所述血清学测定需 要高度特异性的抗血清（van der Avoort et al. ,1995)，所述高度特异性的抗血清的制备 是复杂并且费时费力的（van Wezel and Hazendonk，1979)。或者可鉴定野生型或减毒的 脊髓灰质炎病毒株的分子生物学方法可用于常规分析野生（field)分离株中的脊髓灰质炎 病毒。所述技术基于核酸杂交（Kilpatrick et al·，1996)或逆转录PCR(Kilpatrick et al·，1998 ;Boot et al·，2004 ;Kilpatrick et al·，2004 ;Kilpatrick et al·，2009)。每 种技术都有其自身的优点和缺点（表2)。然而，必须将文献中描述的这些方法改变后，才可 将其用于鉴定疫苗专用的脊髓灰质炎病毒株。因此，本领域仍然需要使得能够快速且准确 地鉴定和区分疫苗生产中使用的多种疫苗专用脊髓灰质炎病毒株的方法和工具，所述脊髓 灰质炎病毒株包括例如 Mahoney、MEF-1、Saukett H、Sabinl 型、Sabin2 型和 Sabin3 型。
【发明内容】
[0004] 在第一方面，本发明涉及一种用于鉴定样品中的脊髓灰质炎病毒株的方法，其中 所述方法包括寡核苷酸与样品中的脊髓灰质炎病毒核酸选择性杂交的步骤，其中所述寡 核苷酸是以下寡核酸中的至少一种：a)包含SEQ ID N0 :1或其互补物的至少12个连续核 苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO: 1或其互 补物第1942-1944位的序列；b)包含SEQ ID NO :1或其互补物的至少12个连续核苷酸 的寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO: 1或其互补物 的第3894-3896位的序列；c)包含SEQ ID N0 :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的 寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID N0 :2或其互补物的 第1942-1944位的序列；和d)包含SEQ ID N0 :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的 寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID N0 :2或其互补物的 第3894-3896位的序列；其中，与a)中寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Mahoneyl型、 Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株；与b)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在 Mahoneyl型脊髓灰质炎病毒株；与c)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Sab ini型脊髓灰 质炎病毒株；与d)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Sabinl型、CHAT和Cox的脊髓 灰质炎病毒株。优选地，在所述方法中，所述寡核苷酸包含相对于SEQ ID N0 :1和2或其互 补物的错配，更优选地，所述错配在对应SEQ ID N0 :1的第1940位、第1946位、第3892位 或第3898位的位置上。在本发明方法的一个实施方案中，寡核苷酸的选择性杂交是通过扩 增测定或扩增-连接测定来检测。
[0005] 在本发明的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)用包括正向引物和反 向引物的引物对扩增样品中的脊髓灰质炎病毒核酸的至少一部分，所述正向引物为以 下引物中的至少一种：（i)包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCCAC-3'的至少12个连续 核苷酸和3 '末端的正向引物，其中Η是不能与C碱基配对的核苷酸；（ii)包含序列： 5' -CCCTTTGACTTAAGTHCAAA-3'的至少12个连续核苷酸和:V末端的正向引物，其中Η是 不能与C碱基配对的核苷酸；（iii)包含序列：5' -CCATGGTGTTCTTTTVTGTG-3'的至少12个 连续核苷酸和3'末端的正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸；（iv)包含序列： 5' -CCATGGTGTTCTTTTVTTTT-3'的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向引物，其中V是 不能与A碱基配对的核苷酸；(v)包含序列：5' -GATTTACTCAGCAGAVTAGC-3'的至少12个 连续核苷酸和3'末端的正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸；(vi)包含序列： 5'-GATTTACTCAGCAGAVTGGA-3'的至少12个连续核苷酸和：V末端的正向引物，其中V是不 能与A碱基配对的核苷酸；(vii)包含序列：5' -AACTCTGTTATTTTGVCGCT-3'的至少12个连 续核苷酸和3'末端的正向引物，其中V是不能与A碱基配对核苷酸；和（viii)包含序列： 5' -AACTCTGTTATTTTGVCTCC-3'的至少12个连续核苷酸和:V末端的正向引物，其中V是 不能与A碱基配对的核苷酸；其中与正向引物配对的反向引物与所述正向引物（i)、（iii)、 (v)和（vii)在包含Mahoney脊髓灰质炎病毒株的序列的参考cDNA模板上产生扩增子，或 者与正向引物（ii)、（iv)、（vi)和（viii)在包含Sabinl型脊髓灰质炎病毒株的序列的 参考cDNA模板上产生扩增子；和b)检测在步骤a)中是否获得了扩增子，其中用正向引物 (i)、（iii)、（v)和（vii)中的至少一种产生的扩增子表明存在选自Mahoney、Brunhilde、 CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株；并且，其中用正向引物（ii)、（iv)、（vi)和（viii)中的 至少一种产生的扩增子表明存在Sabinl型脊髓灰质炎病毒株。优选地，在所述方法的这一 实施方案中，所述反向引物在其3'末端包含至少14个连续核苷酸的序列，所述连续核苷 酸与用上文定义的正向引物在脊髓灰质炎病毒模板上获得的延伸产物中的序列互补。优选 地，所述正向引物是以下引物中的至少一种：（i)包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCCAC-3' 的正向引物，其中Η为A、C、T或U;和（ii)包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCAAA-3'的正 向引物，其中Η为A、C、T或U ;所述反向引物为5' -GATCCTGCCCAGTGTGTGTAG-3'。或者或并 且，所述方法可包括以下步骤：d)用包含正向引物和反向引物的引物对扩增样品中的脊髓 灰质炎病毒核酸的至少一部分，所述正向引物为以下引物中的至少一种：（ix)包含序列： 5' -GATTTACTCAGCAGATAGGG-3'（SEQ ID NO :32)的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向 序列；（X)包含序列：5' -AACTCTGTTATTTTGVCCCC-3'（SEQ ID NO :33)的至少 12 个连续核 苷酸和3'末端的正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸；其中与正向引物配对的 反向引物与正向引物（ix)和（X)在包含Brunhilde脊髓灰质炎病毒株的序列的参考cDNA 模板产生扩增子；和e)检测在步骤d)中是否获得了扩增子，其中在步骤d)中产生的扩增 子表明存在Brunhilde脊髓灰质炎病毒株。
[0006] 在本发明方法的其他实施方案中，所述方法还包括寡核苷酸与样品中的脊髓灰质 炎病毒核酸选择性杂交的步骤，其中所述寡核苷酸对选自以下的一种或多种脊髓灰质炎病 毒株有选择性：MEF_1 2型毒株或Lansing毒株、Sabin2型毒株、Saukett Η或G毒株、和 Sabin3型或Leon毒株。优选地，在该实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)用对选自以 下的一种或多种脊髓灰质炎病毒株有特异性的引物对扩增样品中的脊髓灰质炎病毒核酸 的至少一部分：MEF-1 2型毒株或Lansing毒株、Sabin2型毒株、Saukett Η或G毒株、以及 Sabin3型或Leon毒株；和b)检测在步骤a)是否中获得了扩增子，其中用对所述脊髓灰质 炎病毒株中的一种或多种有特异性的引物对产生的扩增子表明存在那些脊髓灰质炎病毒 株。优选地，在该方法的步骤a)中，用至少一种选自以下的引物对扩增脊髓灰质炎病毒核 酸的一部分：1)包含序列GGTTGTTGAGGGAGTCACGAGA的至少12个连续核苷酸和3'末端的 正向引物和包含序列CCCTGTCTCTACGGCTGTTAGC的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向 引物；Π )包含序列GCAATTACGCCGCAAGC的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向引物和 包含序列GTGTAGGTGCTCCTGGAGGT的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引物；III)包 含序列AAGGAATTGGTGACATGATTGAGG的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向引物和包含 序列CTCGGCTTTGTGTCAGGC的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引物；和IV)包含序 列AATGACCAGATTGGTGATTCCTTG的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向引物和包含序列 GTAAATGCGGACTTTGGAGGTTACT的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引物；并且其中在步 骤b)中，用I)中的引物对产生的扩增子表明存在MEF-1 2型毒株或Lansing毒株；用II) 中的引物对产生的扩增子表明存在Sabin2型毒株；用III)中的引物对产生的扩增子表明 存在Saukett Η或G毒株；用IV)中的引物对产生的扩增子表明存在Sabin3型或Leon毒 株。
[0007] 在本发明的方法中，扩增子优选通过与荧光探针或化学发光探针进行杂交来检 测，所述荧光探针或化学发光探针包含与所述扩增子中的序列互补的序列，并且其中所述 检测优选为实时检测。
[0008] 而且，在本发明的方法中，其中在进行选择性杂交、连接和/或扩增步骤之前，所 述方法还可包括纯化样品中的脊髓灰质炎病毒的RNA并逆转录所述脊髓灰质炎病毒RNA以 提供脊髓灰质炎病毒cDNA的步骤。
[0009] 在第二方面，本发明涉及如本文所定义的用于任何上述本发明的方法的寡核苷 酸、引物或探针。
[0010] 在第二方面，本发明涉及包含上文定义的寡核苷酸、引物和探针中的至少一种的 试剂盒，所述试剂盒还任选地包含用于实施本发明的方法的酶、溶液、缓冲液和指导手册中 的至少一种。
【具体实施方式】
[0011] 本发明涉及用于鉴定和/或区分脊髓灰质炎病毒株尤其是用于疫苗生产的脊髓 灰质炎病毒株的方法。所述方法基于使用寡核苷酸（即，引物和/或探针）的选择性杂交， 所述方法使得能够根据那些脊髓灰质炎病毒株之间存在的核苷酸多态性来区分紧密相关 但又不相同的脊髓灰质炎病毒株。
[0012] 脊髓灰质炎病毒是传染人的肠道病毒。已知三种血清型的脊髓灰质炎病毒，血清 型1、血清型2和血清型3或PV1、PV2和PV3。对于每种血清型来说，有毒力的脊髓灰质炎 病毒株和减毒的脊髓灰质炎病毒株可用于疫苗生产（参见，例如，表1)。虽然对于大多数脊 髓灰质炎病毒株来说，设计能够将这些毒株与其他脊髓灰质炎病毒株区分开来的特异性寡 核苷酸引物或探针是可能的，但是对于两种重要的血清型1脊髓灰质炎病毒疫苗株（即，有 毒力的Mahoney毒株和减毒的Sabinl型毒株）来说，已经证明很难进行这种设计，因为这 两种毒株的病毒基因组之间有高水平的核苷酸序列同一性。本发明的发明人为了设计能够 区分Mahoney毒株和Sabinl型毒株的引物，将注意力集中在这些脊髓灰质炎病毒株基因组 之间存在的2个双核苷酸多态性上。这些双核苷酸多态性存在于Mahoney脊髓灰质炎病毒 基因组序列SEQ ID N0 :1的第1942-1944位和第3894-3896位上。第一个在SEQ ID N0 :1 第1942位和1944位上的双多态性是Sabinl型毒株特有的；后面的在SEQ ID NO :1第3894 位和第3896位上的双多态性是Mahoney毒株特有的。
[0013] 因此，在第一方面，本发明涉及鉴定样品中脊髓灰质炎病毒株的方法，其中所述方 法使得能将选自Mahoney、Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株与Sabinl型脊髓灰 质炎病毒株区分开。
[0014] 所述方法优选包括寡核苷酸与样品中的脊髓灰质炎病毒核酸选择性杂交的步骤。 应理解，所述寡核苷酸与脊髓灰质炎病毒核酸选择性杂交意指所述寡核苷酸与靶脊髓灰质 炎病毒核酸（即，与所述寡核苷酸的互补性最高的脊髓灰质炎病毒核酸，而不是与与所述 寡核苷酸的互补性较低的其他脊髓灰质炎病毒的核酸），形成大量的或阳性的双链体。因 此，选择性杂交在能够促进所述寡核苷酸与靶脊髓灰质炎病毒核酸之间形成大量的或阳性 的双链体的杂交条件下，同时在所述寡核苷酸与非靶脊髓灰质炎病毒核酸之间不形成大量 的或阳性的双链体的杂交条件下进行。
[0015] 在本发明的方法中，包含第一双多态性的寡核苷酸的选择性杂交被用于将选自 Mahoney、Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株与Sabinl型脊髓灰质炎病毒株区分 开。因此，本发明的能够与Mahoney脊髓灰质炎病毒株的核酸选择性杂交的包含SEQ ID N0: 1中的双多态性1942和1944的寡核苷酸不会与Sabinl型脊髓灰质炎病毒株的核酸形成大 量的或阳性的杂交。反之亦然，本发明的能够与Sabinl型脊髓灰质炎病毒株的核酸选择性 杂交的包含SEQ ID NO :1的多态性1942和1944的寡核苷酸不会与Mahoney、Brunhilde、 CHAT和Cox脊髓灰质炎病毒株的核酸形成大量的或阳性的杂交。
[0016] 在本发明的方法中，包含SEQ ID N0 :1中的第3894和3896位上的双多态性的寡 核苷酸的选择性杂交被用于将Mahoney脊髓灰质炎病毒株与选自Sabinl型、Brunhilde、 CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株区分开。因此，本发明的能够与Mahoney脊髓灰质炎病毒 株的核酸选择性杂交的包含SEQ ID NO: 1中第3894位和第3896位上的双多态性的寡核苷 酸不会与Sabinl型、Brunhilde、CHAT和Cox脊髓灰质炎病毒株的核酸形成大量的或阳性 的杂交。反之亦然，本发明的能够与Sabinl型脊髓灰质炎病毒株的核酸选择性杂交的包含 SEQ ID N0 :1中的第3894位和第3896位上的双多态性的寡核苷酸不会与Mahoney脊髓灰 质炎病毒株的核酸形成大量的或阳性的杂交。
[0017] 形成大量或阳性的双链体，即，本发明的寡核苷酸与脊髓灰质炎病毒核酸形成大 量的或阳性的杂交应理解为是通过在扩增测定或连接-扩增测定中可通过形成扩增子来 检测的所述寡核苷酸和靶脊髓灰质炎病毒核酸之间双链体的形成（参见下文）。实际上， 这将意味着包含所述双多态性的寡核苷酸的末端会与靶脊髓灰质炎病毒核酸形成双链体， 使得所述寡核苷酸可被聚合酶延伸，或被连接至邻近的碱基配对的多核苷酸或寡核苷酸分 子。本文使用的"扩增子"是指由扩增步骤例如PCR步骤得到的具有确定大小和序列的双 链核酸区段。扩增子的大小由核酸双链体的两条链上与引物结合的位点来决定。如美国专 利N0. 4, 683, 195所述，在几个扩增循环之后，产物核酸的这一区段变成了扩增步骤的主要 产物。
[0018] 本文使用的与核酸序列例如寡核苷酸序列有关的术语"对靶序列有特异性"或"对 靶序列有选择性"，是指在给定的实验环境所使用的条件下与靶核酸杂交，而在同样的环境 下不与非靶序列的序列杂交的核苷酸序列。对特定的脊髓灰质炎病毒靶序列有特异性的核 苷酸序列是所包含的碱基全部都与靶标上的对应碱基互补的那些序列。此外，本文使用的 核酸序列对靶序列的"特异性"还涵盖了具有少量可不与靶序列的对应核苷酸互补的核苷 酸的核酸和寡核苷酸。用于本文时，这种序列对于靶序列仍有"特异性"或"选择性"，只要 偏离互补的程度不会对功能造成任何影响。具体地，只要在给定实验环境所用的条件下，序 列与靶序列有效杂交而不与任何非靶序列的序列杂交，那么这种序列就对靶序列具有"特 异性"或"选择性"。
[0019] 术语"脊髓灰质炎病毒核酸"在本文中应被理解为其是指脊髓灰质炎病毒RNA或 其任意部分或片段，其cDNA拷贝--包括其双链形式以及其任一条单链。
[0020] 术语第一序列的"互补物"或"互补序列"在本文中应被理解为其意指可通过碱 基配对与所述第一序列形成双链结构或双链体的第二序列，例如G-T-A-C的互补序列是 C-A-T-G。
[0021] 在本发明的方法，用于选择性杂交的寡核苷酸优选为以下寡核苷酸中的至少一 种：
[0022] a)包含SEQ ID NO :1 ( = Mahoney序列）或其互补物的至少12个连续核苷酸的 寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在Y末端或：V末端包含SEQ ID NO: 1或其互补物的第 1942-1944位的序列；
[0023] b)包含SEQ ID NO :1或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中 所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO: 1或其互补物的第3894-3896位的序 列；
[0024] c)包含SEQ ID NO :2 ( = Sabinl型序列）或其互补物的至少12个连续核苷酸的 寡核苷酸，并且其中所述寡核苷酸在Y末端或3'末端包含SEQ ID N0 :2或其互补物的第 1942-1944位的序列；和，
[0025] d)包含SEQ ID N0 :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中 所述寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID N0 :2或其互补物的第3894-3896位的序 列。
[0026] 在本发明的方法中，优选地，将a)和b)中所定义的Mahoney特异性寡核苷酸和c) 和d)中所定义的Sabinl型特异性寡核苷酸中的至少一种用于选择性杂交。在优选的实施 方案中，将a)、b)、c)和d)中定义的寡核苷酸中的一种以上或全部四种用于选择性杂交。
[0027] 在本发明的方法中，与a)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Mahoney、 Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株；与b)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在 Mahoney脊髓灰质炎病毒株；与c)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Sabinl型脊髓灰质 炎病毒株；与d)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Sabinl型、CHAT和Cox的脊髓灰 质炎病毒株。因此，脊髓灰质炎病毒血清型1疫苗株可根据表A中的方案鉴定。
[0028] 表 A.
[0029]
【权利要求】
1. 一种用于鉴定样品中的脊髓灰质炎病毒株的方法，其中所述方法包括使寡核苷酸与 所述样品中的脊髓灰质炎病毒核酸选择性杂交的步骤，其中所述寡核苷酸是以下寡核苷酸 中的至少一种： a) 包含SEQ ID NO :1或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述 寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO :1或其互补物的第1942-1944位的序列； b) 包含SEQ ID NO :1或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述 寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO :1或其互补物的第3894-3896位的序列； c) 包含SEQ ID NO :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述寡 核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO :2或其互补物的第1942-1944位的序列；和， d) 包含SEQ ID NO :2或其互补物的至少12个连续核苷酸的寡核苷酸，并且其中所述 寡核苷酸在5'末端或3'末端包含SEQ ID NO : 2或其互补物的第3894-3896位的序列； 其中，与a)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Mahoneyl型、Brunhilde、CHAT和 Cox的脊髓灰质炎病毒株；与b)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Mahoneyl型脊髓灰质 炎病毒株；与c)中的寡核苷酸选择性杂交表明存在Sabinl型脊髓灰质炎病毒株；与d)中 的寡核苷酸选择性杂交表明存在选自Sabinl型、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病毒株。
2. 权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸包含相对于SEQ ID NO :1和2或其互补物的 错配。
3. 权利要求2的方法，其中所述错配在SEQ ID NO :1的第1940位、第1946位、第3892 位或第3898位上。
4. 权利要求1-3任一项的方法，其中所述寡核苷酸的选择性杂交通过扩增测定或扩 增-连接测定来检测。
5. 权利要求4的方法，其中所述方法包括以下步骤： a)用包括正向引物和反向引物的引物对扩增所述样品中的脊髓灰质炎病毒核酸的至 少一部分，所述正向引物为以下引物中的至少一种： (i) 包含序列：5'-CCCTTTGACTTAAGTHCCAC-3'的至少12个连续核苷酸和:V末端的正 向引物，其中Η是不能与C碱基配对的核苷酸； (ii) 包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCAAA-3'的至少12个连续核苷酸和3'末端的 正向引物，其中Η是不能与C碱基配对的核苷酸； (iii) 包含序列：5'-CCATGGTGTTCTTTTVTGTG-3'的至少12个连续核苷酸和3'末端的 正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸； (iv) 包含序列：5' -CCATGGTGTTCTTTTVTTTT-3'的至少12个连续核苷酸和3'末端的 正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸； (v) 包含序列：5'-GATTTACTCAGCAGAVTAGC-3'的至少12个连续核苷酸和:V末端的正 向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸； (vi) 包含序列：5' -GATTTACTCAGCAGAVTGGA-3'的至少12个连续核苷酸和：V末端的 正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸； (vii) 包含序列：5'-AACTCTGTTATTTTGVCGCT-3'的至少12个连续核苷酸和3'末端的 正向引物，其中V是不能与A碱基配对核苷酸；和， (viii) 包含序列：5' -AACTCTGTTATTTTGVCTCC-3'的至少12个连续核苷酸和3'末端 的正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸； 其中与正向引物配对的反向引物与正向引物（i)、（iii)、（v)和（vii)在包含Mahoney 脊髓灰质炎病毒株的序列的参考cDNA模板上产生扩增子，或者与正向引物（ii)、（iv)、 (vi)和（viii)在包含Sabinl型脊髓灰质炎病毒株的序列的参考cDNA模板上产生扩增子； 和， b)检测在步骤a)中是否获得了扩增子，其中用正向引物（i)、（iii)、（v)和（vii)中 的至少一种产生的扩增子表明存在选自Mahoney、Brunhilde、CHAT和Cox的脊髓灰质炎病 毒株；并且，其中用正向引物（ii)、（iv)、（vi)和（viii)中的至少一种产生的扩增子表明 存在Sabinl型脊髓灰质炎病毒株。
6. 权利要求4或5的方法，包括以下步骤： d) 用包含正向引物和反向引物的引物对扩增所述样品中的脊髓灰质炎病毒核酸的至 少一部分，所述正向引物为以下引物中的至少一种 ： (ix)包含序列：5'-GATTTACTCAGCAGATAGGG-3'（SEQ ID NO :32)的至少 12 个连续核苷 酸和3'末端的正向引物； (X)包含序列：5' -AACTCTGTTATTTTGVCCCC-3'（SEQ ID NO :33)的至少 12 个连续核苷 酸和3'末端的正向引物，其中V是不能与A碱基配对的核苷酸； 其中与正向引物配对的反向引物与所述正向引物（ix)和（X)在包含Brunhilde脊髓 灰质炎病毒株的序列的参考cDNA模板上产生扩增子；和， e) 检测在步骤d)中是否获得了扩增子，其中在步骤d)中产生扩增子表明存在 Brunhilde脊髓灰质炎病毒株。
7. 权利要求5或6的方法，其中所述反向引物在其3'末端包含具有至少14个连续核 苷酸的序列，所述连续核苷酸与用权利要求5或6中定义的正向引物在脊髓灰质炎病毒模 板上获得的延伸产物中的序列互补。
8. 权利要求5的方法，其中所述正向引物是以下引物中的至少一种： (i) 包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCCAC-3'的正向引物，其中Η为A、C、T或U;和， (ii) 包含序列：5' -CCCTTTGACTTAAGTHCAAA-3'的正向引物，其中Η为A、C、T或U;并 且其中所述反向引物为5' -GATCCTGCCCAGTGTGTGTAG-3'。
9. 权利要求1-8任一项的方法，其中所述方法还包括使寡核苷酸与所述样品中的脊髓 灰质炎病毒核酸选择性杂交的步骤，其中所述寡核苷酸对选自以下的一种或多种脊髓灰质 炎病毒株有选择性：MEF-12型毒株或Lansing毒株、Sabin2型毒株、Saukett Η或G毒株、 和Sabin3型或Leon毒株。
10. 权利要求9的方法，其中所述方法包括以下步骤： a) 用对选自以下的一种或多种脊髓灰质炎病毒株有特异性的引物对扩增所述样品 中的脊髓灰质炎病毒核酸的至少一部分：MEF-12型毒株或Lansing毒株、Sabin2型毒株、 Saukett Η或G毒株、和Sabin3型或Leon菌株；和， b) 检测在步骤a)中是否获得了扩增子，其中用对所述脊髓灰质炎病毒株中的一种或 多种有特异性的引物对产生的扩增子表明存在那些脊髓灰质炎病毒株。
11. 权利要求10的方法，其中在步骤a)中，用至少一种选自以下的引物对扩增脊髓灰 质炎病毒核酸的一部分： I)包含序列GGTTGTTGAGGGAGTCACGAGA的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向引物 与包含序列CCCTGTCTCTACGGCTGTTAGC的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引物； Π)包含序列GCAATTACGCCGCAAGC的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向引物与包 含序列GTGTAGGTGCTCCTGGAGGT的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引物； ΠΙ)包含序列AAGGAATTGGTGACATGATTGAGG的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向 引物与包含序列CTCGGCTTTGTGTCAGGC的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引物；和， IV)包含序列AATGACCAGATTGGTGATTCCTTG的至少12个连续核苷酸和3'末端的正向 引物与包含序列GTAAATGCGGACTTTGGAGGTTACT的至少12个连续核苷酸和3'末端的反向引 物； 并且其中在步骤b)中，用I)中的引物对产生的扩增子表明存在MEF-12型毒株或 Lansing毒株；用II)中的引物对产生的扩增子表明存在Sabin2型毒株；用III)中的引物 对产生的扩增子表明存在Saukett Η或G毒株；用IV)中的引物对产生的扩增子表明存在 Sabin3型或Leon毒株。
12. 权利要求5-11任一项的方法，其中扩增子是通过与荧光探针或化学发光探针进行 杂交来检测，所述荧光探针或化学发光探针包含与所述扩增子中的序列互补的序列，并且 其中所述检测优选为实时检测。
13. 权利要求1-12任一项的方法，其中在进行选择性杂交、扩增或连接步骤之前，所述 方法还可包括以下步骤中的至少一步：纯化所述样品中的脊髓灰质炎病毒的RNA和逆转录 所述脊髓灰质炎病毒RNA以提供脊髓灰质炎病毒cDNA。
14. 权利要求1-12任一项所定义的寡核苷酸、引物或探针。
15. -种试剂盒，包含： a) 权利要求1-12任一项所定义的寡核苷酸、引物或探针中的至少一种；和 b) 用于实施权利要求1-13的方法的酶和缓冲液中的至少一种。
【文档编号】C12Q1/70GK104114719SQ201280069697
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年12月14日 优先权日:2011年12月14日
【发明者】B·梅茨, O·E·M·尼斯特, J·J·毛斯哈恩, D·R·梅克斯 申请人:由卫生福利和体育大臣代表的荷兰王国