使用具有降低的ispa活性的宿主细胞提高异戊二烯的产量的制作方法
【专利摘要】本发明涉及能够产生异戊二烯的重组微生物以及利用这种重组微生物以好的效率产生异戊二烯。在本发明中，变更ispA基因的功能活性以在发酵过程中减少工程改造为产生异戊二烯的重组细胞中或由于别的原因易于发生类异戊二烯积聚的细胞中的类异戊二烯分子的产生。该降低的ispA基因功能活性使得宿主微生物中异戊二烯合成增强。
【专利说明】使用具有降低的ISPA活性的宿主细胞提高异戊二烯的产 量
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求于2011年12月23日提交的美国临时专利申请No. 61/580, 163 和于2012年4月27日提交的美国临时专利申请No. 61/639,855的优先权，将这两篇专利 申请每一者的公开内容以引用的方式全文并入本文。
[0003] 以引用方式并入本f
[0004] 将如下ASCII文本文件的提交内容以引用的方式全文并入本文：序列表的计算 机可读形式（CRF)(文件名称：643842004240. txt，记录日期：2012年12月21日，大小： 65, 536 字节）。
【技术领域】
[0005] 本发明总体涉及用于从培养细胞产生异戊二烯的方法以及包括这些培养细胞的 组合物。
【背景技术】
[0006] 异戊二烯（2-甲基-1，3- 丁二烯）是多种合成聚合物（最值得注意的是合成橡 胶）的关键原料。异戊二烯由多种微生物、植物和动物物种自然产生。具体地讲，已经鉴别 了两条进行异戊二烯生物合成的途径：甲羟戊酸（MVA)途径和非甲羟戊酸（DXP)途径。然 而，天然存在的生物体的异戊二烯产率没有商业吸引力。还可以通过分馏石油获得异戊二 烯，但该材料的纯化昂贵而且耗时。C5烃流的石油裂解仅生成约15%的异戊二烯。每年大 约有800, 000吨顺式聚异戊二烯由异戊二烯的聚合反应产生；这种聚异戊二烯大部分用于 轮胎和橡胶工业。异戊二烯还被共聚以用作其他产品中的合成弹性体，这些产品例如为鞋 类、机械产品、医疗产品、体育用品和乳胶。
[0007] 在微生物中的代谢过程中，甲羟戊酸依赖的生物合成途径将乙酰辅酶A转化为异 戊烯二磷酸（IPP)和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)。IPP和DMAPP是异戊二烯的前体以及 是一类称为类异戊二烯的高分子量分子的前体。类异戊二烯对大多数活生物体和细胞是至 关重要的，为维持细胞膜流动性和电子传递提供了手段。
[0008] 关于产生异戊二烯的最新进展公开了以可足以满足稳定商业过程的速率、滴度和 纯度产生异戊二烯的方法（参见例如国际专利申请公布此.102009/07667642);然而，仍然 需要提高其产量和产率的可供选择的途径。
[0009] 本文提供的是培养的重组细胞、这些细胞的组合物以及使用这些细胞来增加异戊 二烯的产量的方法。
[0010] 在整篇本说明书中，参考了多个专利、专利申请以及其他类型的出版物（如杂志 文章）。特此将本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式全文并入本文用于所 有目的。
【发明内容】
toon] 本文提供的发明特别是公开了包含重组细胞的物质的组合物以及制备和使用这 些重组细胞来产生异戊二烯的方法。在一些方面，重组微生物包含具有降低的功能活性的 ispA基因和一种或多种编码一种或多种异戊二烯合酶和/或MVA途径酶的核酸。
[0012] 因此，在一些方面，本文提供的是能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包 含具有降低的功能活性的ispA基因和一种或多种编码以下物质的核酸：(a)异戊二烯合酶 多肽，其中所述异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和（b) -种或多种甲羟戊酸（MVA)途径 多肽，其中在合适的培养基中培养所述重组细胞提供所述多肽的产生和异戊二烯的合成。 在其他方面，ispA基因的功能活性通过如下来降低：缺失ispA基因；降低ispA基因表达； 降低ispA蛋白活性；降低ispA蛋白表达；或时序调节ispA表达。在另一个方面，ispA基 因表达通过将ispA基因设置于弱启动子的控制下来降低。在一些方面，ispA基因表达通过 将ispA基因设置于自动调节启动子的控制下来降低。在另外其他的方面，ispA蛋白活性通 过ispA蛋白与蛋白水解标签的翻译融合来降低。在其他方面,ispA蛋白表达通过使用反义 RNA来降低。在一些方面，ispA蛋白表达通过将一个或多个突变引入位于ispA mRNA分子 中的核糖体结合位点来降低。在其他方面，ispA基因表达通过HrcA转录阻遏蛋白来降低。 在另一个方面，ispA蛋白活性通过将内源ispA基因替换为编码多肽的基因来降低，所述多 肽包含的针对DMAPP的Km与由内源ispA基因编码的多肽的Km相比是增加的。在另一个 方面，ispA蛋白活性通过将内源ispA基因替换为包含不同最适温度的另一基因来降低。
[0013] 在任何本文所述细胞的其他方面，所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合 酶多肽或其变体。在一些方面，所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属（Pueraria)或杨属 (Populus)或杂种银白杨X欧洲山杨（Populus alba X Populus tremula)的多肽或其变 体。在另一个方面，所述异戊二烯合酶多肽选自山葛（Pueraria montana)或野葛（Pueraria lobata)、美洲山杨（Populus tremuloides)、银白杨、黑杨（Populus nigra)、毛果杨 (Populus trichocarpa)或其变体。在其他的方面，所述植物异戊二烯合酶多肽为葛异戊二 烯合酶多肽或其变体。在其他的方面，所述植物异戊二烯合酶多肽为桉树（Eucalyptus)异 戊二烯合酶多肽或其变体。在任何本文所述细胞的一些方面，所述编码（b)的一种或多种 MVA途径多肽的一种或多种核酸是异源核酸。在一些方面，所述细胞包含一种或多种编码 来自MVA上游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA上游途径核酸选自AA-辅酶A硫 解酶或乙酰乙酰辅酶A合酶、HMG-辅酶A合酶和HMG-辅酶A还原酶核酸。在一些方面，所 述细胞包含一种或多种编码来自MVA下游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA下游 途径核酸选自MVK、PMK和MVD核酸。在一些方面，所述细胞包含一种或多种编码完整MVA 途径的MVA途径多肽的核酸。在一些方面，所述细胞还包含一种或多种编码异戊烯二磷酸 异构酶（IDI)多肽的核酸。在任何本文所述细胞的其他方面，所述细胞还包含1-脱氧 木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。在另一个方面，所述（b)的一种或多种编码DXS多肽的 核酸为编码DXS多肽的异源核酸。在又一个方面，所述（b)的一种或多种编码DXS多肽的 核酸为编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。在任何本文所述细胞的其他方面，将所述一种或 多种异源核酸设置于诱导型启动子或组成型启动子之下。在另一个方面，将所述一种或多 种异源核酸克隆进多拷贝质粒中。在其他方面，将所述一种或多种异源核酸整合进所述细 胞的染色体中。
[0014] 在另外其他的方面，该细胞是细菌细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在一个 方面，该细胞为细菌细胞。在另一方面，该细菌细胞为革兰氏阳性菌细胞或革兰氏阴性菌细 胞。在一些方面，该细菌细胞选自大肠杆菌细胞、柠檬泛菌（p.citrea)细胞、枯草芽孢杆 菌（B. subtilis)细胞、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis)细胞、迟缓芽胞杆菌（B. lentus) 细胞、短芽孢杆菌（B. brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus)细胞、 嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus)细胞、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens)细胞、 克劳氏芽孢杆菌（B. clausii)细胞、耐盐芽孢杆菌（B.halodurans)细胞、巨大芽孢杆菌 (B.megaterium)细胞、凝结芽孢杆菌（B.coagulans)细胞、环状芽孢杆菌（B.circulans) 细胞、灿烂类芽孢杆菌（B. lautus)细胞、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis)细胞、白色 链霉菌（S. albus)细胞、变铅青链霉菌（S. lividans)细胞、天蓝色链霉菌（S. coelicolor) 细胞、灰色链霉菌（S.griseus)细胞、假单胞菌属物种（Pseudomonas sp.)细胞和产碱假 单胞菌（P. alcaligenes)细胞。在一个方面，该细胞是大肠杆菌。在另一个方面，该细胞 是藻类细胞。在又一另外的方面，藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻（glaucophyte)、绿蝴藻 (chlorarachniophyte)、眼虫、色藻（chromista)或腰鞭毛虫类（dinoflagellates)。在另 一个方面，该细胞是真菌细胞。在一些方面，真菌细胞是丝状真菌。在另一个方面，该细胞是 酵母细胞。在一个方面，酵母细胞选自酵母属物种（Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属物种 (Schizosaccharomyces sp·)、毕赤酵母属物种（Pichia sp.)或假丝酵母属物种（Candida sp.)。在另一个方面，酵母细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0015] 本文提供的是包含任何本文所公开的细胞的组合物。
[0016] 本文还提供的是产生异戊二烯的方法，包括：(a)在适于合成异戊二烯的条件下 培养任何本文所述的重组细胞；以及（b)产生异戊二烯。在一些方面，该方法还包括回收由 所述重组细胞产生的异戊二烯。
[0017] 本文提供的是产生异戊二烯的方法，包括（a)培养能够产生异戊二烯的重组细 胞，其中所述细胞包含具有降低的功能活性的ispA基因和一种或多种编码以下物质的核 酸：（i)异戊二烯合酶多肽，其中所述异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和（ii) 一种或多 种甲羟戊酸（MVA)途径多肽，其中在合适的培养基中培养所述重组细胞可提供所述多肽的 产生和异戊二烯的合成；以及（b)产生异戊二烯。在一些方面，该方法还包括回收由所述重 组细胞产生的异戊二烯。在本文所述方法的其他方面中，所述异戊二烯合酶多肽是植物异 戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属或杨属或杂种 银白杨X欧洲山杨的多肽或其变体。在另一个方面，所述异戊二烯合酶多肽选自山葛或野 葛、美洲山杨、银白杨、黑杨、毛果杨或其变体。在其他的方面，所述植物异戊二烯合酶多肽 为葛异戊二烯合酶多肽或其变体。在其他的方面，所述植物异戊二烯合酶多肽为桉树异戊 二烯合酶多肽或其变体。在任何本文所述方法的一些方面，所述（b)的一种或多种编码一 种或多种MVA途径多肽的核酸是异源核酸。在一些方面，所述细胞包含一种或多种编码来 自MVA上游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA上游途径核酸选自AA-辅酶A硫解 酶核酸或乙酰乙酰辅酶A合酶核酸、HMG-辅酶A合酶核酸和HMG-辅酶A还原酶核酸。在 一些方面，所述细胞包含一种或多种编码来自MVA下游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所 述MVA下游途径核酸选自MVK核酸、PMK核酸和MVD核酸。在一些方面，所述细胞包含一种 或多种编码完整MVA途径的MVA途径多肽的核酸。在一些方面，所述细胞还包含一种或多 种编码异戊烯二磷酸异构酶（IDI)多肽的核酸。在任何本文所述细胞的其他方面，所 述细胞还包含1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。在另一个方面，所述（b)的一种或 多种编码DXS多肽的核酸为编码DXS多肽的异源核酸。在又一个方面，所述（b)的一种或 多种编码DXS多肽的核酸为编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图la绘出了 CMP882和CMP884发酵期间的甲羟戊酸进料浓度。图lb绘出了菌株 CMP882和CMP884发酵期间培养基中的甲羟戊酸积聚。
[0019] 图2绘出了 CMP882和CMP884发酵期间的法尼基焦磷酸（FPP)浓度。
[0020] 图3绘出了 CMP882和CMP884在发酵期间的细胞活力。
[0021] 图4绘出了在菌株CMP882和CMP884发酵期间的呼吸率（CER)。
[0022] 图5绘出了在发酵期间MVA途径菌株（CMP457)及与之相比较的野生型对照菌株 (MCM1020)中的 yddV 表达。
[0023] 图6绘出了菌株CMP457和MCM1020发酵期间的呼吸率（CER)。
[0024] 图7a绘出了各种工程改造的产异戊二烯菌株的生长曲线（一式二份运行的平均 值）。图7b绘出了各种工程改造的产异戊二烯菌株的比生产率（任意单位）（一式二份运 行的平均值）。
[0025] 图8绘出了 IspA合成基因的核苷酸序列（SEQ ID N0:10)。
[0026] 图 9 绘出了 pMCM1535 的核苷酸序列（SEQ ID NO: 11)。
[0027] 图10绘出了质粒构建体pMCM1535。
[0028] 图11绘出了禽法尼基二磷酸合酶A116W突变体的核苷酸序列（SEQ ID N0:12)。
[0029] 图12绘出了禽法尼基二磷酸合酶N144'W突变体的核苷酸序列（SEQ ID NO: 13)。
[0030] 图13绘出了随时间推移15L发酵中，与对照菌株CMP1043(实心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (实心黑色正方形）所实现的从葡萄糖产生异戊二烯的产率。
[0031] 图14绘出了随时间推移15L发酵中，与对照菌株CMP1043(实心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (实心黑色正方形和空心正方形）所实现的异戊二烯滴度。
[0032] 图15绘出了随时间推移15L发酵中，与对照菌株CMP1043(实心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (实心黑色正方形）所实现的细胞生产力指数（CPI)。
[0033] 图16绘出了随时间推移15L发酵中，与对照菌株CMP1043(实心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (实心黑色正方形）所实现的体积生产率。
[0034] 图17绘出了随时间推移15L发酵中，与对照菌株CMP1043(实心三角形）相比， yddV-ispA菌株CMP1082 (实心黑色正方形）所实现的比生产率。
[0035] 图18绘出了用于在大肠杆菌中表达的hrcA的密码子优化等位基因的核苷酸序列 (SEQ ID N0:14)。
[0036] 图19绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的从葡萄糖产生异戊二烯的产率。 CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由实心正方形示出。
[0037] 图20绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的从葡萄糖产生异戊二烯的瞬时 产率。CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由实心正方形示出。
[0038] 图21示出了随时间推移每个15L发酵中所实现的细胞生产力指数（CPI)。 CMP1082(pgl+)由空心三角形示出，而MP1136(pgl_)由实心正方形示出。
[0039] 图22绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。CMP1082(pgl+)由 空心三角形示出，而MP1136 (pgl_)由实心正方形示出。
[0040] 图23绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。CMP1082(pgl+)由空 心三角形示出，而MP1136 (pgl_)由实心正方形示出。
[0041] 图24绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的从葡萄糖产生异戊二烯的产率。 使用_鸡肠球菌（E. gallinarum)或铅黄肠球菌（E. casseliflavus)进行的所有运行（分 别是三角形和正方形）均比使用粪肠球菌（E.faecalis)上游途径酶进行的两个运行（空 心菱形和实心菱形）实现更高的从葡萄糖产生异戊二烯的％产率。从葡萄糖产生的％重量 产率计算为：异戊二烯总量（t) / [(进料Wt (0)-进料Wt (t) +83. 5) *0. 59)]，其中0. 59为葡 萄糖进料液中葡萄糖的重量百分比，83. 5为在t = 0时分批供料进发酵罐中的该进料的克 数。独立地对每次进料测量其重量％。
[0042] 图25绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。使用鹑鸡肠球菌 或铅黄肠球菌进行的所有运行（分别是三角形和正方形）均比使用粪肠球菌上游途径酶进 行的两个运行（空心菱形和实心菱形）实现更高的总体积生产率。使用下式计算体积生产 率：体积生产率（g/L/hr) = [S(ER(t)/1000*68. 117)]/[t-tJ，其中求和是从 tQ 到 t。未 纳入罐的周转时间。
[0043] 图26绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。使用鹑鸡肠球菌或铅 黄肠球菌进行的所有运行（分别是三角形和正方形）均比使用粪肠球菌上游途径酶进行的 两个运行（空心菱形和实心菱形）实现更高的峰值比生产率。使用下式计算比生产率：t匕 生产率（mg/L/hr/OD) =HgER*68. 117g/mol/0D。HgER 为异戊二烯放出速率，单位为（mmol/ L/hr)。0D =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀释系数。
[0044] 图27绘出了所限定的菌株中的IspA浓度。
[0045] 图28绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的从葡萄糖产生异戊二烯的 产率。具有经修饰的RBS位点的菌株，S卩CMP 1286 (RBS9yddV)、CMP 1284 (RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分别为空心圆、空心正方形和空心三角形）所实现的从葡萄糖产生 异戊二烯的累积％产率与对照菌株（DW719,运行号为20120526和20120565,分别是实心正 方形和实心菱形）相似。从葡萄糖产生的％重量产率计算为：异戊二烯总量（t)/[(进料 Wt(0)-进料Wt(t)+83. 5) *0. 59)]，其中0. 59为葡萄糖进料液中葡萄糖的重量百分比，83. 5 为在t = 0时分批供料进发酵罐中的该进料的克数。独立地对每次进料测量其重量％。
[0046] 图29绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的从葡萄糖产生异戊二烯的瞬 时产率。具有经修饰的RBS位点的菌株，S卩CMP1286(RBS9yddV)、CMP1284(RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分别为空心圆、空心正方形和空心三角形）所实现的从葡萄糖产生 异戊二烯的峰值瞬时产率与对照菌株（DW719,运行号为20120526和20120565,分别是实心 正方形和实心菱形）相似。所有经修饰的菌株均在运行前期实现较高的瞬时收率值，而菌 株CMP1284在运行末期（56至64小时EFT)时具有最稳健的性能。异戊二烯瞬时产率（g/ g% )计算为：所产生的异戊二烯α「〇/所消耗的葡萄糖
[0047] 图30绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的体积生产率。具有经修饰的RBS 位点的菌株，即 CMP1286 (RBS9yddV)、CMP1284 (RBS3yddV)和 CMP1275 (RBSl/3yddV)(分别为 空心圆、空心正方形和空心三角形）所实现的异戊二烯体积生产率与对照菌株（DW719,运 行号为20120526和20120565,分别是实心正方形和实心菱形）相似。使用下式计算体积 生产率：体积生产率（g/L/hr) = [Σ (HGER(t)/1000*68. 117)]/[t-t。]，其中求和是从t0至 t。未纳入罐的周转时间。
[0048] 图31绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的细胞生产力指数（CPI)。 具有经修饰的RBS位点的菌株，即CMP1286(RBS9yddV)、CMP1284(RBS3yddV)和 CMP1275(RBSl/3yddV)(分别为空心圆、空心正方形和空心三角形）所实现的CPI与对照菌 株（DW719,运行号为20120526和20120565,分别是实心正方形和实心菱形）相似。使用下 式计算细胞生产力指数（CPI) :CPI =异戊二烯总克数/干细胞重量总克数。
[0049] 图32绘出了随时间推移每个15L发酵中所实现的比生产率。具有经修饰的RBS 位点的菌株，即 CMP1286 (RBS9yddV)、CMP1284 (RBS3yddV)和 CMP1275 (RBSl/3yddV)(分别为 空心圆、空心正方形和空心三角形）所实现的异戊二烯比生产率与对照菌株（DW719,运行 号为20120526和20120565,分别是实心正方形和实心菱形）相似。使用下式计算比生产 率：比生产率（mg/L/hr/OD) = HgER*68. 117g/mol/0D。HgER为异戊二烯放出速率，单位为 (mmol/L/hr)。0D =光密度=550nm下的吸光度*在水中的稀释系数。
[0050] 图33绘出了在发酵32小时和44小时后测量的FPP水平。
[0051] 图34绘出了在发酵32小时和44小时后测量的GPP水平。
[0052] 图35绘出了在发酵32小时和44小时后测量的DMAPP水平。
[0053] 图36绘出了在发酵32小时和44小时后测量的IPP水平。
[0054] 图37绘出了质粒构建体pCHL426。
[0055] 图 38 绘出了 pCHL426 的核苷酸序列（SEQ ID N0:104)。
[0056] 图39绘出了质粒构建体pCHL427。
[0057] 图 40 绘出了 pCHL427 的核苷酸序列（SEQ ID N0:105)。
[0058] 图41绘出了包含组成型表达的异戊二烯合酶变体的宿主细胞和对比的包含诱导 型异戊二烯合酶变体的宿主细胞的生长。
[0059] 图42绘出了包含组成型表达的异戊二烯合酶变体的宿主细胞和对比的包含诱导 型异戊二烯合酶变体的宿主细胞的异戊二烯比生产率。
【具体实施方式】
[0060] 本文提供的发明特别是公开了在重组细胞中产生异戊二烯的组合物和方法，所述 重组细胞已工程改造为在发酵期间在精确的时期下调ispA基因的表达或功能活性。本发 明是基于这样的发现：重组细胞在发酵期间ispA基因表达降低导致与不具有降低的ispA 基因功能活性的细胞相比异戊二烯产量水平较高。不受理论束缚，据信降低ispA基因表达 和/或功能活性可通过降低较高分子量类异戊二烯分子的产生和积聚从而导致供异戊二 烯合成的碳可利用率较高以及细胞活力改善来改善异戊二烯产率。然而，因为ispA基因产 生细菌和其他微生物稳健生长所必需的酶，所以完全消除该基因（例如通过基因敲除）对 于改善异戊二烯产率而言不是可行的选项，因为据报道其导致细胞生长受损（Fukisaki等 人，2005, J. Biochem.(《生物化学杂志》），137(3) :395-400)或导致细胞死亡（www. genome-wise, edu/resources/essential. htm ;Baba 等人， 2006, Mol. Syst. Biol. ， （《分子系统生物 学》）2006. 0008)。本发明人已根据他们的如下发现解决了该技术问题：在异戊二烯产生期 间（如发酵的线性生长期后）特定地和时间精确地降低ispA基因的表达和/或功能活性可 导致重组细胞的异戊二烯产率、滴度、细胞生产力、体积生产率、比生产率和细胞活力较高。
[0061] 诵用抟术
[0062] 除非另外指明，否则本发明的实施将采用分子生物学（包括重组技术）、微生物 学、细胞生物学、生物化学和免疫学领域的常规技术，这些技术均为本领域的现有技术。这 些技术在以下文献中有完整解释'Molecular Cloning:A Laboratory Manual (《分子克 隆：实验室手册》）"，第三版（Sambrook 等人，2001) ;"01igonucleotide Synthesis (《寡 核苷酸合成》Gait 编辑，1984) ;"Animal Cell Culture:A practical approach (《动物细胞培养：实用方法》）"，第三版（J.R. Masters编辑，2000) ;"Methods in Enzymology(《酶学方法》）"（美国学术出版社（Academic Press, Inc·)) ;"Current Protocols in Molecular Biology(《分子生物学实验室指南》）"（F.M.Ausubel等人编 辑，1987,以及定期更新版本）；"PCR:The Polymerase Chain Reaction(《PCR:聚合酶链 反应》），'，（Mullis 等人编辑，1994)。Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology3rd revised ed·,(《微生物学和分子生物学词典第三修订版》），约翰 威立父子出版公司（J. Wiley & Sons)(纽约州纽约市，2006年）以及March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure6th ed.(《马奇高级有机化学 反应、机理和结构，第六版》），约翰威立父子出版公司（纽约州纽约市，2007年），为本领域 技术人员提供了关于本申请中所用的许多术语的一般性指导。
[0063] 定义
[0064] 术语"ispA"可以指任何生物体中的任何香叶基转移酶或法尼基二磷酸（FPP)合 酶或异戊烯基转移酶家族的可催异戊烯二磷酸（IPP)与3, 3-二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP) 或香叶基二磷酸（GPP)缩合以生成FPP的酶的任何成员。在一些实施例中，ispA由ispA基 因编码。
[0065] 术语"异戊二烯"是指2-甲基-1，3- 丁二烯（CAS#78-79-5)。其可以是由DMAPP 消除焦磷酸所得的直接和最终的挥发性C5烃产物。其可能不涉及IPP分子与DMAPP分子 的连接或聚合。除非本文中另外指明，否则术语"异戊二烯"通常不旨在受其产生方法的限 制。
[0066] 如本文所用，术语"多肽"包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽。
[0067] 如本文所用，"分离的多肽"不是多肽文库（如2种、5种、10种、20种、50种或更多 种不同多肽的文库）的一部分，并且与和其一起存在于自然界中的至少一种组分分离。分 离的多肽可例如通过编码该多肽的重组核酸的表达来获得。
[0068] 所谓"异源多肽"意指由衍生自其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞的核酸序列 编码的多肽。在一些实施例中，异源多肽不同于存在于自然界中相同宿主细胞内的野生型 多肽。
[0069] 如本文所使用，"核酸"是指单股或双股形式的共价连接在一起的两个或更多个脱 氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。
[0070] 所谓"重组核酸"意指这样的目的核酸，其缺少位于该目的核酸旁侧、目的核酸所 源自的有机体的天然存在基因组中的一种或多种核酸（如，基因）。因此，该术语包括（例 如）掺入载体中、掺入自主复制型质粒或病毒中、或掺入原核生物或真核生物的基因组DNA 中，或者独立于其他序列作为单独分子（如，cDNA、通过PCR或限制性核酸内切酶消化制备 的基因组DNA片段或cDNA片段）存在的重组DNA。
[0071] 所谓"异源核酸"意指衍生自其他生物体、物种或菌株而非宿主细胞的核酸序列。 在一些实施例中，异源核酸不同于自然界中的相同宿主细胞内存在的野生型核酸。
[0072] 如本文所用，"表达控制序列"意指指导目的核酸转录的核酸序列。表达控制序列 可以为启动子（例如组成型或诱导型启动子）或增强子。表达控制序列可以是"天然的"或 异源的。天然的表达控制序列衍生自与所表达基因相同的生物体、物种或株系。异源表达 控制序列衍生自与所表达基因不同的生物体、物种或株系。"诱导型启动子"是在环境或发 育调节下具有活性的启动子。
[0073] 所谓"有效连接的"意指核酸表达控制序列（例如启动子）与第二核酸序列之间 的功能性连接，其中该表达控制序列指导对应于该第二序列的核酸的转录。
[0074] 如本文所用，术语"基础培养基"是指含有细胞有可能生长所需的最少营养物，通 常不存在氨基酸的培养基。基本培养基通常含有：（1)用于细菌生长的碳源；（2)各种盐，其 可因细菌物种和生长条件而变动；和（3)水。碳源的范围很大，从简单的糖如葡萄糖到其他 生物质的较复杂水解产物如酵母提取物，如下文更详细论述的。盐通常提供必需元素如镁、 氮、磷和硫以允许细胞合成蛋白质和核酸。基本培养基还可补充有选择剂，例如抗生素，以 针对某些质粒的维持等进行选择。例如，如果微生物对某一抗生素例如氨苄青霉素或四环 素具有抗性，则可将该抗生素添加至培养基以便防止缺乏该抗性的细胞生长。培养基可在 必要时补充有其他化合物以选择所需的生理或生化特性，例如特定的氨基酸等。
[0075] 如本文所用，术语"类异戊二烯"是指数量大且多样的一类天然存在的有机化合 物，其由两个或更多个烃单元构成，每个单元由以特定模式排列的五个碳原子组成。类异 戊二烯可包括（但不限于）萜类化合物（例如半萜类化合物、单萜类化合物、倍半萜类化 合物、二萜类化合物、二倍半萜类化合物、三萜类化合物、四萜类化合物和/或多萜类化合 物）。如本文所用，明确地将"异戊二烯"从"类异戊二烯"的定义中排除。
[0076] 如本文所用，术语"质量产率"是指重组细胞（如细菌细胞）所产生的产物的质量 除以重组细胞所耗费的葡萄糖的质量乘以100。
[0077] 所谓"比生产率"，其意指细菌细胞所生成的产物的质量除以产生产物的时间、细 胞密度和培养物体积。
[0078] 所谓"滴度"，其意指重组细胞（例如细菌细胞）所产生的产物的质量除以培养物 的体积。
[0079] 如本文所用，术语"细胞生产力指数（CPI) "是指重组细胞（如细菌细胞）所产生 的产物的质量除以培养物中产生的重组细胞的质量。
[0080] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普 通技术人员所一般理解的含义相同的含义。
[0081] 如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数"一个"、"一种"和"该"包括复 数指代。
[0082] 在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，就如同 此类较低数值限度在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度 将包括每一较高数值限度，就如同此类上限值在本文中明确地写出一样。在本说明书通篇 中给出的每一个数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一个较窄数值范围，就如同 此类较窄数值范围在本文中全部明确地写出一样。
[0083] 能够增大异戊二烯的产量的重纟目微牛物
[0084] 异戊二烯（2-甲基-1，3-丁二烯）是在大量应用中使用的重要有机化合物。例如， 异戊二烯在多种化学组合物和聚合物的合成中，包括在合成橡胶的制备中用作中间体或原 料。异戊二烯也是由许多植物和动物天然合成的重要生物材料。甲羟戊酸依赖性生物合成 途径（MVA途径）是所有高等真核生物和某些细菌中存在的关键代谢途径。除了对蛋白质 异戊二烯化、细胞膜维持、蛋白质锚定和N-糖基化等各种各样的过程中所用的分子的产生 是重要的外，甲羟戊酸途径还提供二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)和异戊烯二磷酸（IPP)的 主要来源，这些分子充当类异戊二烯和异戊二烯二者的生物合成的基础。
[0085] 类异戊二烯化合物如异戊烯基tRNA、类异戊二烯醌和糖载体脂质由包括大肠杆菌 在内的许多微生物作为正常代谢的一部分合成（Fujisaki等人，（1989)J.Bacteri 〇l.(《细 菌学杂志》）171:5654-5658)。用于类异戊二烯化合物产生的合成途径的分支点涉及由酶法 尼基二磷酸（FPP)合酶催化的反应，该酶使IPP与DMAPP或香叶基二磷酸（GPP)缩合而生 成FPP。FPP合酶（EC: 2. 5. 1. 10)属于转移酶家族的酶，具体地讲是能够在代谢反应中转移 芳基或除了甲基之外的烷基的那些酶。FPP合酶的其他通用名称包括香叶基转移酶、香叶基 转移酶I、异戊烯基转移酶、法尼基焦磷酸合成酶和法尼焦磷酸合成酶。
[0086] 如上所述，DMAPP和IPP为类异戊二烯和异戊二烯二者的生物合成提供了初始碳 源输入。异戊二烯合酶使用这些分子来催化异戊二烯的产生而FPP合酶则利用它们来产生 GPP和FPP-这两者则进一步被合成为更大分子量的类异戊二烯分子。因而，不受理论束缚， 据信对于工程改造为产生异戊二烯的重组细胞，FPP合酶的酶活性通过使可供由异戊二烯 合酶转化成异戊二烯的DMAPP和IPP分子较少而导致供异戊二烯产生的碳可利用率降低。 此外，重组细胞中或由于别的原因易于发生类异戊二烯积聚的细胞中类异戊二烯产量增加 与差的形态和降低的细胞活力相关。
[0087] 在诸如大肠杆菌之类的微生物中，FPP合酶由ispA基因编码（Fukisaki等人， (1990)，J.Biochem.(《生物化学杂志》）108:995-1000)。ispA基因与如下两个其他基因位 于操纵子中：dxs基因，其编码脱氧木酮糖-5-磷酸合酶（DXS)，以及xseB基因，其产生外 切核酸酶 VII 小亚基（Lois 等人，（1998 年 3 月 3 日）Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.(《美 国国家科学院院刊》）95 (5) :2105-2110)。IspA基因表达据报道是微生物稳健生长所需 的，因为完全移除该基因会产生生长速率低于野生型株系的生长速率的细胞（Fukisaki等 人，2005, J. Biochem.(《生物化学杂志》）137(3) :395-400)或导致细胞致死（www. genome-wise, edu/resources/essential. htm ;Baba 等人， 2006, Mol. Syst. Biol. (《分子系 统生物 学》）2006. 0008)。
[0088] 已工程改造为产生异戊二烯的重组细胞在培养中可表现具有两个阶段：1)生长 阶段，其中重组细胞以线性方式分裂，和2)发酵阶段，其中细胞利用碳源（如葡萄糖）来产 生异戊二烯。因而，在一些实施例中，重组细胞包含具有降低的功能活性的ispA。在一个方 面，ispA的功能活性仅在细胞培养的发酵阶段期间降低。在另一个方面，ispA的功能活性 在细胞培养期间的线性生长阶段期间不降低。在一些方面，ispA的功能活性在细胞培养的 生长阶段和发酵阶段二者中均降低。在又一个方面，ispA的功能活性在细胞培养的生长阶 段和发酵阶段二者中均降低，但是在发酵阶段的降低较大。
[0089] 可将任何方法用于降低ispA的功能活性，例如但不限于缺失ispA基因、降低ispA 基因表达或降低由ispA基因编码的多肽的活性或可利用率。在其他方面，本发明的重组 细胞包含具有降低的功能活性的ispA和涉及异戊二烯生物合成的一组基因中的一种或多 种，所述一组基因使得能在宿主微生物中合成异戊二烯。在另一个方面，本发明的重组宿主 细胞包含为了在宿主细胞中表达而经密码子优化的重组ispA基因。在一些方面，密码子优 化的ispA基因整合进宿主基因组中。在其他方面，密码子优化的ispA基因在一段染色体 外DNA (如质粒）上表达。在另一个方面，密码子优化的ispA基因在yhfS基因座处整合进 宿主细胞基因组中并且内源ispA基因缺失。
[0090] 在一些方面，本发明的重组宿主细胞包含重组ispA基因，该重组ispA基因编码的 FPP合酶（例如禽FPP合酶）对DMAPP的Km值与内源编码的FPP合酶所展现的对DMAPP 的Km值相比增加。这种高Km FPP合酶已经例如在Fernandez等人，Biochemistry (《生 物化学》)2000,39(50) :15316-21中进行了描述。在其他方面，本发明的重组宿主细胞可包 含具有不同最适温度的FPP合酶（例如但不限于在Koyama等人，1993，J.Biochem.(《生 物化学杂志》），113(3) :355-363中描述的嗜热FPP合酶）、嗜冷FPP合酶（如在Nichols 等人，2004, J.Bact.(《细菌学杂志》）186:8508-8515中描述的FPP合酶，将其公开内容以 引用方式全文并入本文）或来自海洋原核生物的FPP合酶（如在Ranzer等人，2009, Mar. Biotechnol (《海洋生物技术》），11:62-73中描述的FPP合酶）。在一些方面，任何本文所 述重组细胞中的内源宿主细胞ispA基因被替换为编码本文所述FPP合酶的任何备选基因。 在其他方面，重组ispA基因设置于诱导型启动子或组成型启动子的控制之下。在另一个方 面，重组ispA基因在多拷贝质粒上表达。在又一方面，重组ispA基因整合进宿主细胞的染 色体中。
[0091] 在一些方面，本发明的重组宿主细胞包含处于弱启动子（即驱动ispA基因表达的 启动子，其中表达量低于对于内源或野生型ispA启动子所观察到的表达量）的控制下的 ispA基因。在一些方面，与发酵阶段期间的ispA基因表达相比，在细胞培养期间的线性生 长阶段，控制ispA基因表达的启动子可以较高水平表达ispA基因。
[0092] ispA的降低的功能活件
[0093] 在一些方面，本文所述的重组细胞包含具有降低的功能活性的ispA。在该语境中 的"降低的功能活性"是指ispA多肽（例如由ispA基因编码的多肽）将IPP和DMAPP转 化为GPP和/或FPP (即后续产生类异戊二烯所必需的分子）的能力。在一些方面，任何本 文所公开的重组细胞可包含ispA基因，其中ispA的功能活性降低而使得与不包含具有降 低的功能活性的ispA的细胞中的GPP和/或FPP浓度相比，该细胞产生的GPP和/或FPP 浓度小于约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (包括这些百分数，且包括这些值之间的 任何百分数）。在另一个方面，与包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源 核酸但不包含具有降低的功能活性的ispA的重组细胞中的GPP和/或FPP浓度相比，包含 一种或多种编码具有异戊二烯合酶活性的多肽的异源核酸、一种或多种编码MVA途径的一 个或多个成员的异源核酸和具有降低的功能活性的ispA、已工程改造为产生异戊二烯的重 组细胞产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90% 或 100% (包括这些 百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。
[0094] 在其他方面，任何本文所公开的重组细胞可包含ispA，其中ispA的功能活性降低 而使得与不包含具有降低的功能活性的ispA的细胞中的类异戊二烯浓度相比，该细胞产 生的类异戊二烯浓度小于约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 % 或 100 % (包括这些百分数，且 包括这些值之间的任何百分数）。在其他方面，任何本文所公开的重组细胞可包含ispA， 其中ispA基因的功能活性降低而使得与不包含具有降低的功能活性的ispA的细胞的活 力相比，该细胞表现出约 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (包括这些百分数，且包括这些值之 间的任何百分数）的改善的活力中的任一者。在另一个方面，与包含一种或多种编码MVA 途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含具有降低的功能活性的ispA的细胞的活力相 t匕，包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸和具有降低的功能活性 的ispA、已工程改造为产生异戊二烯的重组细胞可表现出约5%、10 %、15%、20%、25 %、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）的改善的活力中的任一者。如本文 所用，"改善的活力"意指在发酵过程期间产生较少的死亡、濒死或另外在形态学上异常的 细胞。形态异常可包括但不限于伸长的细胞和/或来自死亡或濒死细胞的细胞碎片。在一 些实施例中，"改善的活力"可意指较大数目的细胞通过本领域已知的细胞生物学技术、分 子生物学技术或生物化学技术（如但不限于荧光激活细胞分选（FACS)或者DiBAC4(3)染 色）测定是有活力的。在一些方面，ispA功能活性在发酵的峰值异戊二烯产生阶段期间降 低。在其他方面，ispA功能活性在发酵的线性生长阶段期间不降低。
[0095] 测量ispA功能活性降低的方法有很多并且是本领域众所周知的。例如，可将标准 方法用于确定细胞中的代谢物（例如FPP和GPP)产量，例如通过从全细胞用化学方法提取 代谢物，然后通过质谱法鉴定。相似地，可将标准方法用于测定具有降低的ispA功能活性 的细胞的活力，例如通过显微镜法进行的形态分析和通过评估膜电位。膜电位保持不变的 细胞被认为是活的和代谢活跃的，而没有膜电位的细胞被认为是死亡的和代谢惰性的。
[0096] ispA某闵的降低的表汰
[0097] 在一些方面，通过降低ispA基因的表达来降低ispA基因的功能活性。这可包括 缺失ispA基因本身（全部缺失或部分缺失），或通过用多种本文所述方法或本领域技术人 员已知方法来降低其表达。在一些方面，可将启动子工程转入细胞来控制ispA基因的表 达。在一个方面，驱动ispA基因表达的启动子可因为类异戊二烯化合物的积聚增加而受到 抑制。当引入这种启动子来控制ispA的表达时，ispA可在对应于流通过类异戊二烯途径 的期间受到阻遏。然而，在通量低的期间，启动子保持受到诱导并因而允许ispA表达。
[0098] 经由自动调节启动子讲行的时序调节的表汰降低
[0099] 在一些方面，ispA基因表达通过将ispA基因设置于自动调节启动子的控制下来 降低。在某些实施例中，可将仅在已工程改造为产生增加水平的异戊二烯的重组细胞的后 期发酵期间受阻遏的启动子用于降低ispA基因的功能活性。不受理论束缚，假设这种启动 子在类异戊二烯化合物随发酵进行而积聚增加期间受到阻遏。因而，将ispA基因设置于这 些启动子的控制之下可用于时序调节ispA的表达，使得在对应于通过类异戊二烯途径的 通量增加的时期发生ispA阻遏。然而，在类异戊二烯途径通量低的时期，例如在发酵的线 性生长阶段期间，则启动子将保持受到诱导并从而允许ispA基因的表达。该标记式活性谱 (signature activity profile)构成了自动调节ispA表达控制系统。
[0100] 因此，在一些方面，任何本文所述重组细胞可包含具有降低的功能活性的ispA基 因，其中通过将ispA基因设置于自动调节启动子的控制之下来降低ispA基因的功能活性。 在一些方面，自动调节启动子选自：efeO、kpsC、kpsD、kpsD、kpsE、kpsF、kpsS、kpsU、nmpC、 sodA、ybll29、ybll30、ybll31、yddV 和 ydiU。在一个方面，将 ispA 基因设置于 yddV 启动 子的控制之下。在其他方面，可从重组细胞（例如，重组大肠杆菌细胞）的基因组缺失内源 ispA基因，并且可将新的ispA基因在一不同基因座处替代进基因组中。在一个方面，将异 源ispA基因在yhfS基因座处插入进重组细胞（例如，重组大肠杆菌细胞）的基因组中。 该异源ispA基因可以与缺失的内源ispA基因相同或可为来自另一来源的ispA基因。在 其他方面，处于自动调节启动子的控制之下的异源ispA基因在染色体外表达。在另一个 方面，本发明的重组宿主细胞包含为了在宿主细胞中表达而经密码子优化的重组ispA基 因。在一些方面，密码子优化的ispA基因整合进宿主基因组中。在另一个方面，密码子优 化的ispA基因处于选自如下的自动调节启动子的控制之下：efeO、kpsC、kpsD、kpsD、kpsE、 kpsF、kpsS、kpsU、nmpC、sodA、ybll29、ybll30、ybll31、yddV 和 ydiU。在一些方面，密码子 优化的ispA基因处于yddV启动子的控制之下。在又一个方面，任何本文所述的自动调节 启动子可驱动选自如下的ispA基因的表达：密码子优化的ispA、编码的酶与来自微生物的 ispA编码的酶相比具有较高的Km的ispA等位基因（例如，禽ispA等位基因）和内源ispA 等位基因。
[0101] 在一些方面，与不包含处于自动调节启动子控制之下的ispA基因的细胞中的GPP 和/或FPP浓度相比，表达处于自动调节启动子控制之下的ispA基因的重组细胞（如任何 本文所公开的重组细胞）产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7%,8%,9 %U0%>15%,20 %,25%,30%,35 %,40%,45%,50 %,60%,70%,80 %,90% 或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在另一个方面，与包含一 种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含处于自动调节启动子控制 之下的ispA基因的重组细胞中的GPP和/或FPP浓度相比，包含一种或多种编码MVA途径 的一个或多个成员的异源核酸和处于自动调节启动子控制之下的ispA基因、工程改造为 产生异戊二烯的重组细胞产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、6%、 7 %,8%,9%U0 %>15%,20%,25 %,30%,35%,40 %,45%,50%,60 %,70%,80%,90 % 或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在一些方面，与不包含处于 自动调节启动子控制之下的ispA基因的细胞中的类异戊二烯浓度相比，表达处于自动调 节启动子控制之下的ispA基因的重组细胞（如任何本文所公开的重组细胞）产生的类异 戊二烯浓度小于约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、 35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100% (包括这些百分数，且包括这些值之 间的任何百分数）。在其他方面，与不包含处于自动调节启动子控制之下的ispA基因的细 胞的活力相比，表达处于自动调节启动子控制之下的ispA基因的重组细胞（如任何本文所 公开的重组细胞）表现出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括这些百分数，且包括这些值之 间的任何百分数）的改善的活力中的任一者。在另一个方面，与包含一种或多种编码MVA 途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含处于自动调节启动子控制之下的ispA基因的 细胞的活力相比，包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸和处于自动 调节启动子控制之下的ispA基因、工程改造为产生异戊二烯的重组细胞可表现出约5%、 10 % U5 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %, 85%、90%、95%或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）的改善的活 力中的任一者。
[0102] 通讨异源阳遏蛋白HrcA讲行的时序调节的表汰降低
[0103] 控制ispA表达的一种备选方法利用新月柄杆菌（Caulobacter crescentus)的 转录阻遏蛋白HrcA(Roberts等人，1996，Journal of Bacteriology(《细菌学杂志》）， 178(7):1829-1841 ;Susin 等人，2004，Journal of Bacteriology (《细菌学杂志》）， 186(20) :6759-6767)。编码HrcA的基因不天然存在于大肠杆菌中并且没有已知的信息表 明CIRCE元件（为HrcA所识别）涉及控制大肠杆菌基因表达。因此，将CIRCE元件掺入进 控制大肠杆菌异戊二烯产生系统内的ispA表达的调节序列内将会允许HrcA-介导的ispA 阻遏。此外，可将异源hrcA基因引入进大肠杆菌产异戊二烯宿主中，在该宿主中其表达可 通过多种严格调节手段中的至少一种来控制。
[0104] 因此，在一些方面，任何本文所述重组细胞可包含具有降低的功能活性的ispA基 因，其中通过由hrcA基因编码的HrcA转录阻遏蛋白降低ispA基因的功能活性并且其中将 CIRCE元件工程改造进控制ispA表达的调节序列中。在一些方面，通过线性生长阶段调节 启动子控制hrcA表达，所述启动子是在整个大规模产异戊二烯发酵中细胞的转录谱内鉴 别的。在一些方面，线性生长阶段调节启动子选自〇tsA、amiB和deoC。
[0105] 在其他方面，可通过正调节回路（positive regulatory-loop)控制hrcA表 达，该正调节回路自身经由诱导信号（如严重营养限制或改变的温度）在所需的发酵缓 慢生长阶段打开。在该方面，反式激活肽如反式激活蛋白T与特定的信号感测启动子 (signal-sensing promoter)功能性连接。引入诱导信号将会诱导该信号感测启动子的活 性，其继而上调反式激活蛋白T的表达。通过将另外拷贝的反式激活蛋白T基因连接至反 式激活蛋白T依赖性启动子，正反馈回路被引发并且一旦移除诱导信号就得到维持。在其 他方面，将hrcA基因连接至至少一个反式激活蛋白T依赖性启动子，从而导致在正调节回 路激活之后的期间HrcA连续表达。在某些方面，由转录激活蛋白T依赖性启动子驱动的反 式激活蛋白T基因位于与hrcA基因相同的操纵子上。在其他方面，由转录激活蛋白T依赖 性启动子驱动的反式激活蛋白T基因位于不含hrcA基因的独立基因座中。
[0106] 在一些方面，与不包含处于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的细胞中的GPP 和/或FPP浓度相比，表达处于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重组细胞（如任何 本文所公开的重组细胞）产生的GPP和/或FPP浓度小于约1 %、2 %、3 %、4 %、5 %、6 %、 7 %,8%,9%U0 %>15%,20%,25 %,30%,35%,40 %,45%,50%,60 %,70%,80%,90% 或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在另一个方面，与包含一种 或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含处于HrcA阻遏蛋白控制之下 的ispA基因的重组细胞中的GPP和/或FPP浓度相比，包含一种或多种编码MVA途径的一 个或多个成员的异源核酸和处于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因、工程改造为产生异 戊二烯的重组细胞产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在一些方面，与不包含处于HrcA阻 遏蛋白控制之下的ispA基因的细胞中的类异戊二烯浓度相比，表达处于HrcA阻遏蛋白控 制之下的ispA基因的重组细胞（如任何本文所公开的重组细胞）产生的类异戊二烯浓度 小于约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或100 % (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百 分数）。在其他方面，与不包含处于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的细胞的活力相 t匕，表达处于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的重组细胞（如任何本文所公开的重组 细胞）表现出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、95%或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百 分数）的改善的活力中的任一者。在另一个方面，与包含一种或多种编码MVA途径的一个 或多个成员的异源核酸但不包含处于HrcA阻遏蛋白控制之下的ispA基因的细胞的活力相 t匕，包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸和处于HrcA阻遏蛋白控制 之下的ispA基因、工程改造为产生异戊二烯的重组细胞可表现出约5%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）的改善的活力中的任一者。
[0107] 通过木糖调节的i sdA表汰讲行的时序调节的表汰降低
[0108] 通过碳源可利用率介导的受调节的基因表达是控制生产宿主（例如大肠杆菌生 产宿主）内的ispA基因表达的另一可放大的备选方法。这种方法使得能够提供健康稳健快 速生长的细胞所需的相对正常和/或足够水平的ispA基因表达，从而快速产生生物量。此 夕卜，当据信FPP合酶活性对细胞活力有害从而导致从葡萄糖产生的异戊二烯产率降低时， 这种方法使得能够限制葡萄糖支持的异戊二烯产生期间的ispA表达。
[0109] 因此，在一些方面，任何本文所述重组细胞可包含具有降低的功能活性的ispA基 因，其中通过将ispA基因设置于木糖调节的启动子的控制之下来降低ispA基因的功能活 性。在一些方面，重组细胞（如重组大肠杆菌细胞）中的ispA表达设置在重组细胞内的 内源xylA或xylF启动子的直接控制之下或处于由D-木糖正向影响和由葡萄糖负向影响 的任何启动子的控制之下。这可通过缺失内源ispA基因和替代处于xylA或xylF D-木 糖响应启动子的控制下的异源ispA来实现。大肠杆菌反向xylA-xylF启动子及它们经 由D-木糖进行的正向调节和转录激活因子XylR以及它们由葡萄糖进行的负向调节和分 解代谢物阻遏已经有所描述（S. Song和C. Park, 1997, J. Bacterial.(《细菌学杂志》）， 179(22) :7025-7032)。在一些方面，ispA基因表达通过在不存在葡萄糖时木糖的可利用 性来正向控制以及通过葡萄糖的存在来负向控制。在一些方面，木糖诱导型ispA基因座 存在于重组细胞（如重组大肠杆菌细胞）的染色体内，但作为另一种选择，也可在染色体 外核苷酸序列如质粒上编码。木糖诱导型ispA构建体的构造以及其向产异戊二烯大肠杆 菌宿主中的引入可使用标准的分子和微生物学技术来进行（J. Sambrook, E. F. Fritsch和 T.Maniatis Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港实验室出版社），NY. 1989)。
[0110] 在一些方面，与不包含处于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因的细胞中的 GPP和/或FPP浓度相比，表达处于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因的重组细胞（如 任何本文所公开的重组细胞）产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、 6 %,7%,8%,9 %U0%>15%,20 %,25%,30%,35 %,40%,45%,50 %,60%,70%,80 %, 90%或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在另一个方面，与包含 一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含处于木糖诱导型启动子 控制之下的ispA基因的重组细胞中的GPP和/或FPP浓度相比，包含一种或多种编码MVA 途径的一个或多个成员的异源核酸和处于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因、工程 改造为产生异戊二烯的重组细胞产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、 6%,7%,8 %,9%U0%>15 %,20%,25%,30 %,35%,40%,45 %,50%,60%,70 %,80%, 90%或100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在一些方面，与不包 含处于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因的细胞中的类异戊二烯浓度相比，表达处 于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因的重组细胞（如任何本文所公开的重组细胞） 产生的类异戊二烯浓度小于约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或100%(包括这些百分数，且包 括这些值之间的任何百分数）。在其他方面，与不包含处于木糖诱导型启动子控制之下的 ispA基因的细胞的活力相比，表达处于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因的重组细 胞（如任何本文所公开的重组细胞）表现出5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括这些百分 数，且包括这些值之间的任何百分数）的改善的活力中的任一者。在另一个方面，与包含一 种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含处于木糖诱导型启动子控 制之下的ispA基因的细胞的活力相比，包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员 的异源核酸和处于木糖诱导型启动子控制之下的ispA基因、工程改造为产生异戊二烯的 重组细胞可表现出约 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、 65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或100 % (包括这些百分数，且包括这些值之间的 任何百分数）的改善的活力中的任一者。
[0111] 降低的FPP合酶活件
[0112] 在一些方面，通过降低IspA蛋白FPP合酶的活性来降低ispA基因的功能活性。这 可包括抑制IspA mRNA的翻译或通过用多种本文所述方法降解FPP合酶本身。
[0113] IsdA蛋白与蛋白水解标签的翻译融合以降低蛋白质活件
[0114] 在任何本文所述重组细胞的一些方面，通过将编码11个氨基酸的蛋白质标签的 DNA序列工程改造进ispA基因中来祀向FPP合酶进行蛋白质水解降解（Andersen等人， 1998, Appl Environ Microbiol.(《应用和环境微生物学》），64(6) :2240-2246)。蛋白水解 tmRNA标签于是在宿主细胞中靶向FPP合酶进行降解，从而降低FPP合酶活性。在一些方 面，蛋白水解标签融合至FPP合酶蛋白的C末端。在其他方面，蛋白水解标签融合至FPP合 酶蛋白的N末端。
[0115] 在一些方面，与不包含与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的细胞中的GPP和/ 或FPP浓度相比，表达与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的重组细胞（如任何本文所公 开的重组细胞）产生的GPP和/或FPP浓度小于约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、 9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在另一个方面，与包含一种或多种 编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋 白的重组细胞中的GPP和/或FPP浓度相比，包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个 成员的异源核酸、已工程改造为产生异戊二烯的表达与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋 白的重组细胞（如任何本文所公开的重组细胞）产生的GPP和/或FPP浓度小于约1 %、 2 %,3%,4%,5 %,6 %,7%,8 %,9 % U0 % >15%,20 %,25 %,30 %,35%,40 %,45 %,50%, 60%、70%、80%、90%或100%(包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数）。在 一些方面，与不包含与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的细胞中的类异戊二烯浓度相 t匕，表达与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的重组细胞（如任何本文所公开的重组细胞） 产生的类异戊二烯浓度小于约 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或 100% (包括这些百分数，且包 括这些值之间的任何百分数）。在其他方面，与不包含与蛋白水解标签融合的IspA蛋白 的细胞的活力相比，表达与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的重组细胞（如任何本文所 公开的重组细胞）表现出 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括这些百分数，且包括这些值之 间的任何百分数）的改善的活力中的任一者。在另一个方面，与包含一种或多种编码MVA 途径的一个或多个成员的异源核酸但不包含与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的细胞 的活力相比，包含一种或多种编码MVA途径的一个或多个成员的异源核酸和ispA基因、表 达与蛋白水解标签融合的FPP合酶蛋白的重组细胞（如任何本文所公开的重组细胞）可表 现出约约 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或100%(包括这些百分数，且包括这些值之间的任何百分数） 的改善的活力中的任一者。
[0116] 通丄寸j申用反.义mRNA矛口核糖体结合突变讲斗〒的IspA蛋白表汰降j氏
[0117] 在一些方面，将针对ispA mRNA的反义mRNA用于防止ispA mRNA翻译成IspA蛋 白并导致IspA蛋白表达降低。反义是本领域众所周知的并且已经用于大肠杆菌等生物体 中来降低诸如乙酸之类的分子的产生（Kim J.和Cha H.J.，2003，Biotech Bioeng.(《生 物技术和生物工程》），83:841-853)或用于工程改造过氧化氢酶敲除表型（Chan E.等人， 2010, J. Exp. Microbiol Immunol.(《实验微生物学和免疫学杂志》），14:127-134)。可使 用如下文献中描述的方法来制备祀向大肠杆菌的ispA基因的反义构建体设计：Shao Y.等 人，2006, Nucleic Acids Res.(核酸研究），34:5660-5669。可使用配对的末端使反义RNA 分子稳定化（似1^811；[1]^11等人，2006，池(316；^六(^(18 1^8.(《核酸研究》），34:6138)。在 一些方面，反义寡核苷酸长约150bp。可通过本领域已知的任何手段（包括但不限于酶活 性测定法、蛋白质印迹法、RNA印迹法或RT-PCR)测量由于反义mRNA处理引起的ispA mRNA 翻译降低。
[0118] 在其他方面，通过将一个或多个突变引入位于ispA mRNA分子中的一个或多个核 糖体结合位点来降低IspA蛋白表达。引入核糖体结合突变可干扰或废止IspA mRNA的翻 译从而导致IspA蛋白表达降低。可通过本领域已知的任何手段（包括但不限于酶活性测 定法或蛋白质印迹法）测量由于将一个或多个突变引入位于ispA mRNA分子中的一个或多 个核糖体结合位点而引起的ispA mRNA翻译降低。
[0119] 可使用本领域已知的优化软件鉴别具体mRNA中的核糖体结合位点（RBS)的位置。 例如，可将使用RNA热力学参数的RBS calculator优化软件与Vienna RNA软件包1. 8. 4 版（可得自 world, wide. web. tbi. univie. ac. at/ ?ivo/RNA/，Gruber 等人，（NAR, 2008)) 和用于RBS calculator的Vienna RNA模块结合使用。这种RBS calculator优化软件可 用于鉴别对蛋白质表达具有预测效果的RBS。例如，可使用RBS calculator优化软件鉴别 应该会使祀标蛋白质（如ispA)的表达降低的RBS。
[0120] 异戊二烯合酶核酸和多狀
[0121] 在本发明的一些方面，在任何本文所述的组合物或方法中所述的重组细胞还包含 编码异戊二烯合酶多肽或具有异戊二烯合酶活性的多肽的一种或多种核酸。在一些方面， 异戊二烯合酶多肽为内源多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接 至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至诱导型启动 子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有效连接至强启动子。在一些方面，使 用不止一种编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸（如，2个、3个、4个或更多个拷贝的编码异 戊二烯合酶多肽的内源核酸）。在一个特定方面，对细胞进行工程改造以相对于野生型细 胞过表达内源异戊二烯合酶途径多肽。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸有 效连接至弱启动子。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂种例如银白 杨X欧洲山杨的多肽。在一些方面，所述异戊二烯合酶多肽来自桉树。
[0122] 在一些方面，异戊二烯合酶多肽为异源多肽。在一些方面，细胞包含不止一个拷贝 的编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有 效连接至组成型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至诱导 型启动子。在一些方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至强启动子。在一些 方面，编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸有效连接至弱启动子。
[0123] 编码异戊二烯合酶多肽的核酸可整合进宿主细胞的基因组中，或者可在细胞中稳 定表达。编码异戊二烯合酶多肽的核酸另外可位于载体上。
[0124] 示例性异戊二烯合酶核酸包括编码具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的多 肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)转 化成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的 多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自任何本文所述 来源生物体的天然多肽和核酸。此外，异戊二烯合酶的变体可具有改善的活性例如改善的 酶活性。在一些方面，异戊二烯合酶变体具有其他改善的特性，例如改善的稳定性（如热稳 定性）和/或改善的可溶性。
[0125] 可使用标准的方法，通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转 化为异戊二烯的能力，来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。细胞提取物中的异 戊二烯合酶多肽活性可例如按如下文献中所描述的进行测量：Silver等人，1995, J. Biol. Chem.(《生物化学杂志》）270:13010-13016。在一个示例性的测定法中，可在氮气流下将 DMAPP(西格玛公司（Sigma))蒸发至干燥并在100mM磷酸钾缓冲液（pH8. 2)中将其再水化 至lOOmM的浓度，并保存于-200C下。为了进行该测定法，可将5mL的1M MgCl2、lmM(250mg/ ml)DMAPP、65mL的植物提取缓冲液（PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0,20mMMgCl2,5%甘油和 2mM DTT)的溶液添加至20mL顶空小瓶中的25mL的细胞提取物中并在振动下于37°C培 养15分钟，其中该小瓶具有金属旋盖和涂有特氟龙的硅隔膜（安捷伦科技公司（Agilent Technologies))。反应可通过加入200μ L的250mM EDTA进行淬灭并通过GC/MS进行定量。
[0126] 在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为植物异戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方 面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，该异戊二烯合 酶多肽为来自杨属的异戊二烯合酶或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为白杨异 戊二烯合酶多肽或其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为葛异戊二烯合酶多肽或其 变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自葛属或杨属或杂种银白杨X欧洲山杨的多 肽或其变体。
[0127] 在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸来自豆科（Fabaceae)，例如蝶形花亚科 (Faboideae)。在一些方面，异戊二烯合酶多肽或核酸为来自如下的多肽或核酸：山葛（葛） (Sharkey 等人，2005，Plant Physiology (《植物生理学》）137:700_712)、野葛、杨（如银 白杨、黑杨、毛果杨或银白杨X欧洲山杨（CAC35696) (Miller等人，2001，Planta(《植物 学》）213:483-487)、山杨（如美洲山杨）（Silver 等人，1995, JBC270 (22) :13010-1316)、英 国橡树（夏栎（Quercus robur)) (Zimmer等人，W098/02550)或其变体。在一些方面，该 异戊二烯合酶多肽为来自山葛、野葛、美洲山杨、银白杨、黑杨或毛果杨的异戊二烯合酶或 其变体。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽为来自银白杨的异戊二烯合酶或其变体。在一 些方面，异戊二烯合酶是香脂杨（Populus balsamifera)(Genbank JN173037)、美洲黑杨 (Populus deltoides)(Genbank JN173039)、弗里芒氏杨（Populus fremontii)(Genbank JNl73〇40)、大齿杨（Populus granididenta)(Genbank JNl73〇38)、柳属（Genbank JNl73〇 43)、刺槐（Robinia pseudoacacia)(Genbank JNl73〇4l)、紫藤属（Wisteria) (Genbank JN173042)、蓝按（Eucalyptus globulus) (Genbank AB266390)或 Melaleuca alterniflora(Genbank AY279379)或其变体。在一些方面，编码异戊二烯合酶（如来自银 白杨的异戊二烯合酶或其变体）的核酸经密码子优化。
[0128] 在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是天然存在的多肽或核酸（例如，来自杨 属的天然存在的多肽或核酸）。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽不是野生型或天然存 在的多肽或核酸。在一些方面，异戊二烯合酶核酸或多肽是野生型或天然存在的多肽或核 酸的变体（例如，来自杨属的野生型或天然存在的多肽或核酸的变体）。
[0129] 在一些方面，异戊二烯合酶多肽为变体。在一些方面，异戊二烯合酶多肽是野生 型或天然存在的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯 合酶相比具有改善的活性，例如改善的催化活性。活性（如催化活性）的增加可为至少约 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或 95% 中的任一者。在一些方面，诸如 催化活性之类的活性的增加为至少约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍 或100倍中的任一者。在一些方面，诸如催化活性之类的活性的增加为约10%至约100倍 (如，约20%至约100倍、约50%至约50倍、约1倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍 至约20倍）。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶相比具有改善的溶解 性。溶解性的增加可为至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95% 中的任一者。溶解性的增加可为至少约1倍、2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75 倍或100倍中的任一者。在一些方面，溶解性的增加为约10%至约100倍（如，约20%至 约100倍、约50 %至约50倍、约1倍至约25倍、约2倍至约20倍或约5倍至约20倍）。在 一些方面，异戊二烯合酶多肽为天然存在的异戊二烯合酶的变体，并与天然存在的异戊二 烯合酶相比具有改善的稳定性（如热稳定性）。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽来自桉树 或其变体。在其他方面，该异戊二烯合酶来自洋槐属（Robinia)、柳属（Salix)或白千层属 (Melaleuca)或其变体。
[0130] 在一些方面，变体具有野生型或天然存在的异戊二烯合酶的活性的至少约10%、 至少约20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少 约80%、至少约90%、至少约100%、至少约110%、至少约120%、至少约130%、至少约 140 %、至少约150 %、至少约160 %、至少约170 %、至少约180 %、至少约190 %、至少约 200%。变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有序列相似性。在一些方面，野生 型或天然存在的异戊二烯合酶的变体可与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有至少约 40 %,50 %,60 %,70 %,75 %,80 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或99. 9%中的任一者的氨基酸序列同一性。在一些方面，野生型或天然存在 的异戊二烯合酶的变体与野生型或天然存在的异戊二烯合酶具有约70%至约99. 9%、约 75%至约99%、约80%至约98%、约85%至约97%或约90%至约95%中的任一者的氨基 酸序列同一性。
[0131] 在一些方面，变体在野生型或天然存在的异戊二烯合酶中包含突变。在一些方面， 变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些 方面，变体具有至少一个氨基酸置换。在一些方面，变体与野生型或天然存在的异戊二烯合 酶之间的不同氨基酸残基的数量可为一个或多个，例如1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50或 更多个氨基酸残基。天然存在的异戊二烯合酶可包括来自植物的任何异戊二烯合酶，例如 葛异戊二烯合酶、杨异戊二烯合酶、英国栎异戊二烯合酶和柳树异戊二烯合酶。在一些方 面，变体为来自银白杨的异戊二烯合酶的变体。在一些方面，来自银白杨的异戊二烯合酶的 变体具有至少一个氨基酸置换、至少一个氨基酸插入和/或至少一个氨基酸缺失。在一些 方面，变体为截短的银白杨异戊二烯合酶。在一些方面，编码变体（如来自银白杨的异戊二 烯合酶的变体）的核酸为密码子优化的（例如，基于在其中表达异源异戊二烯合酶的宿主 细胞而进行密码子优化的）。在一些方面，该异戊二烯合酶多肽来自桉树或其变体。在其他 方面，该异戊二烯合酶来自洋槐属、柳属或白千层属或其变体。
[0132] 本文提供的异戊二烯合酶多肽可以是W02009/132220、W02010/124146和美国专 利申请公开No. :2010/0086978中所述的任何异戊二烯合酶或异戊二烯合酶变体，将这些 专利关于异戊二烯合酶和异戊二烯合酶变体的内容全文以引用的方式明确地并入本文。
[0133] 本文所述启动子中的任一者（如本文所述的以及在本公开的实例中所鉴定的启 动子，包括诱导型启动子和组成型启动子）均可用于驱动任何本文所述异戊二烯合酶的表 达。
[0134] 合适的异戊二烯合酶包括但不限于Genbank登录号AY341431、AY316691、 AY279379、AJ457070和AY182241所标示的那些。可用于本文所述组合物或方法（包 括产生编码本文所述异戊二烯合酶的微生物的方法）中的任一者的异戊二烯合酶类型 也在如下参考文献中描述：国际专利申请公布No. W02009/076676、No. W02010/003007、 No.W02009/132220, No.W02010/031062, No.W02010/031068, No.W02010/031076, No.W02010/013077, No.W02010/031079, No.W02010/148150, No.W02010/124146, No. TO2010/078457、No. TO2010/148256 以及 Sharkey 等人，"Isoprene Synthase Genes Form A Monophyletic Clade Of Acyclic Terpene Synthases In The Tps_B Terpene Synthase Family"，Evolution (《进化》）（2012)(可在线得自 DOI: 10. 1111/evo. 12013)， 将上述参考文献每一者以引用的方式全文并入本文。
[0135] 可制备在表A中所示的残基位置处具有置换的各种异戊二烯合酶变体。任何本文 (包括表A、权利要求书或实例中）所述的变体均可用于本发明的组合物和方法中。在一些 方面，变体包含一个或多个（即2、3、4、5、6个等）来自表A的对应于银白杨的氨基酸序列 的突变。
[0136]
【权利要求】
1. 一种能够产生异戊二烯的重组细胞，其中所述细胞包含具有降低的功能活性的 ispA基因和一种或多种编码如下多肽的核酸： (a) 异戊二烯合酶多肽，其中所述异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码；和 (b) -种或多种甲羟戊酸（MVA)途径多肽， 其中在合适的培养基中培养所述重组细胞提供所述多肽的产生以及异戊二烯的合成。
2. 根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述ispA基因的功能活性通过如下来降低： a. 缺失所述ispA基因； b. 降低ispA基因表达； c. 降低ispA蛋白活性； d. 降低ispA蛋白表达；或者 e. 时序调节ispA表达。
3. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA基因表达通过将所述ispA基因设置在 弱启动子的控制下来降低。
4. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA基因表达通过将所述ispA基因设置在 自动调节启动子的控制下来降低。
5. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA蛋白活性通过所述ispA蛋白与蛋白水 解标签的翻译融合来降低。
6. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA蛋白活性通过使用反义RNA来降低。
7. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA蛋白活性通过将一个或多个突变引入位 于ispA mRNA分子中的核糖体结合位点中来降低。
8. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA基因表达通过HrcA转录阻遏蛋白来降 低。
9. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA蛋白活性通过将内源ispA基因替换为 编码这样的多肽的基因来降低，所述多肽包含的针对DMAPP的Km与由内源ispA基因编码 的多肽的Km相比是增加的。
10. 根据权利要求2所述的重组细胞，其中ispA蛋白活性通过将内源ispA基因替换为 包含不同最适温度的另一基因来降低。
11. 根据权利要求1-10中任一项所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物 异戊二烯合酶多肽或其变体。
12. 根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自葛属 (Pueraria)或杨属（Populus)或杂种银白杨（Populus alba) X 欧洲山杨（Populus tremula)的多肽或其变体。
13. 根据权利要求12所述的重组细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽选自山葛 (Pueraria montana)或野葛（Pueraria lobata)、美洲山杨（Populus tremuloides)、银白 杨、黑杨（Populus nigra)、毛果杨（Populus trichocarpa)或其变体。
14. 根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是葛异戊二烯 合酶多肽或其变体。
15. 根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是桉树 (Eucalyptus)异戊二烯合酶多肽或其变体。
16. 根据权利要求1-15中任一项所述的重组细胞，其中编码（b)的一种或多种MVA途 径多肽的所述一种或多种核酸为异源核酸。
17. 根据权利要求16所述的重组细胞，其中所述细胞包含一种或多种编码来自MVA上 游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA上游途径核酸选自AA-辅酶A硫解酶核酸或 乙酰乙酰辅酶A合酶核酸、HMG-辅酶A合酶核酸和HMG-辅酶A还原酶核酸。
18. 根据权利要求16所述的重组细胞，其中所述细胞包含一种或多种编码来自MVA下 游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA下游途径核酸选自MVK核酸、PMK核酸和MVD 核酸。
19. 根据权利要求16所述的重组细胞，其中所述细胞包含一种或多种编码完整MVA途 径的MVA途径多肽的核酸。
20. 根据权利要求1所述的细胞，所述细胞进一步包含一种或多种编码异戊烯二磷酸 δ-异构酶（IDI)多肽的核酸。
21. 根据权利要求1-20中任一项所述的重组细胞，所述重组细胞进一步包含1-脱氧木 酮糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。
22. 根据权利要求21所述的重组细胞，其中所述一种或多种编码DXS多肽的核酸是编 码DXS多肽的异源核酸。
23. 根据权利要求21所述的重组细胞，其中所述一种或多种编码DXS多肽的核酸是编 码DXS多肽的内源核酸的拷贝。
24. 根据权利要求1-23中任一项所述的重组细胞，其中所述一种或多种异源核酸被设 置于诱导型启动子或组成型启动子之下。
25. 根据权利要求1-24中任一项所述的重组细胞，其中所述一种或多种异源核酸被克 隆进多拷贝质粒中。
26. 根据权利要求1-25中任一项所述的重组细胞，其中所述一种或多种异源核酸被整 合进所述细胞的染色体中。
27. 根据权利要求1-26中任一项所述的重组细胞，其中所述细胞是细菌细胞、藻类细 胞、真菌细胞或酵母细胞。
28. 根据权利要求27所述的重组细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
29. 根据权利要求28所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞是革兰氏阳性细菌细胞或革 兰氏阴性细菌细胞。
30. 根据权利要求29所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞选自大肠杆菌（E.coli) 细胞、柠檬泛菌（P. citrea)细胞、枯草芽孢杆菌（B. subtilis)细胞、地衣芽孢杆菌 (B.licheniformis)细胞、迟缓芽胞杆菌（B. lentus)细胞、短芽孢杆菌（B. brevis)细胞、 嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus)细胞、嗜碱芽孢杆菌（B.alkalophilus)细 胞、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens)细胞、克劳氏芽孢杆菌（B. clausii)细胞、 耐盐芽孢杆菌（B. halodurans)细胞、巨大芽孢杆菌（B. megaterium)细胞、凝结芽孢杆菌 (B. coagulans)细胞、环状芽孢杆菌（B. circulans)细胞、灿烂类芽孢杆菌（B. lautus)细 胞、苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis)细胞、白色链霉菌（S. albus)细胞、变铅青链霉菌 (S. lividans)细胞、天蓝色链霉菌（S. coelicolor)细胞、灰色链霉菌（S. griseus)细胞、假 单胞菌属物种（Pseudomonas sp.)细胞和产碱假单胞菌（P.alcaligenes)细胞。
31. 根据权利要求30所述的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
32. 根据权利要求27所述的重组细胞，其中所述细胞是藻类细胞。
33. 根据权利要求32所述的藻类细胞，其中藻类细胞选自绿藻、红藻、灰藻门、绿蜘藻、 眼虫、色藻或腰鞭毛虫。
34. 根据权利要求27所述的重组细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
35. 根据权利要求34所述的真菌细胞，其中所述真菌细胞是丝状真菌。
36. 根据权利要求27所述的重组细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
37. 根据权利要求36所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞选自酵母属物种 (Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属物种（Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属物种 (Pichia sp.)或假丝酵母属物种（Candida sp.)。
38. 据权利要求37所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)〇
39. 包含根据权利要求1-38中任一项所述的细胞的一种组合物。
40. -种产生异戊二烯的方法，所述方法包括：(a)在提供异戊二烯的合成的合适条件 下培养根据权利要求1-38中任一项所述的重组细胞；以及（b)产生异戊二烯。
41. 根据权利要求40所述的方法，其还包括回收由所述重组细胞产生的异戊二烯。
42. 根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述ispA基因的功能活性通过 如下来降低： a. 缺失所述ispA基因； b. 降低ispA基因表达； c. 降低ispA蛋白活性； d. 降低ispA蛋白表达；或者 e. 时序调节ispA表达。
43. 根据权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异 戊二烯合酶多肽或其变体。
44. 根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自葛 属或杨属或杂种银白杨X欧洲山杨的多肽或其变体。
45. 根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述异戊二烯合酶多肽是来自选 自山葛或野葛、美洲山杨、银白杨、黑杨和毛果杨的多肽或其变体。
46. 根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是葛 异戊二烯合酶多肽或其变体。
47. 根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是桉 树异戊二烯合酶多肽或其变体。
48. 根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中编码（b)的一种或多种MVA途径多 肽的所述一种或多种核酸为异源核酸。
49. 根据权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述细胞包含一种或多种编码来 自MVA上游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA上游途径核酸选自AA-辅酶A硫解 酶核酸或乙酰乙酰辅酶A合酶核酸、HMG-辅酶A合酶核酸和HMG-辅酶A还原酶核酸。
50. 根据权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述细胞包含一种或多种编码来 自MVA下游途径的MVA途径多肽的核酸，其中所述MVA下游途径核酸选自MVK核酸、PMK核 酸和MVD核酸。
51. 根据权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述细胞包含一种或多种编码完 整MVA途径的MVA途径多肽的核酸。
52. 根据权利要求40-51中任一项所述的方法，所述方法进一步包含一种或多种编码 异戊烯二磷酸异构酶（IDI)多肽的核酸。
53. 根据权利要求40-52中任一项所述的方法，所述方法进一步包含1-脱氧木酮 糖-5-磷酸合酶（DXS)多肽。
54. 根据权利要求40-53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种编码DXS多肽的核 酸是编码DXS多肽的异源核酸。
55. 根据权利要求40-54中任一项所述的方法，其中所述一种或多种编码DXS多肽的核 酸是编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。
【文档编号】C12N9/10GK104245927SQ201280070444
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2011年12月23日
【发明者】J·C·麦考利夫, R·E·穆尔, A·T·尼尔森, C·M·派瑞斯, D·V·瓦维林, D·H·韦尔斯 申请人:丹尼斯科美国公司, 固特异轮胎和橡胶公司