一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法
【专利摘要】一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法，本发明的基础培养基为DMEM培养基或其与F12培养基的混合；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。与现有技术相比本发明优点为：未添加动物源性或重组白蛋白，避免了可能携带的安全隐患，降低培养基成本；适用于成纤维细胞的原代和传代培养，并保持较好的细胞形态，与血清组细胞的状态和功能相似；不需采用贴壁因子包被，原代24h贴壁率＞60%，传代24h贴壁率＞80%，与血清组细胞无差异；能满足多次传代需要，且传至15代后生长状况仍保持与血清组细胞状态相似；将成纤维细胞从含血清培养中直接转入本发明培养，细胞可顺利贴壁伸展，不需逐渐适应过程。
【专利说明】一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学材料【技术领域】，具体涉及一种无血清成纤维细胞培养基及其制备方法。
【背景技术】
[0002]组织工程皮肤是目前组织工程领域的热点，近年来已经有许多产品应用于临床。组织工程皮肤研发中需要解决的一大问题是种子细胞(即表皮细胞与成纤维细胞)的大规模体外培养。
[0003]传统的成纤维细胞培养是在基础培养基中添加血清，但是血清的使用会带来风险隐患:①血清中含有细胞生长抑制因子和毒性因子，有潜在细胞毒性血清组分复杂，批次间质量存在差异，增加了产品质量控制的难度和不稳定性；③目前血清中各组分及其含量对细胞生长、增殖的作用机制尚不清楚，给研发和应用带来不便；④从安全性角度考虑，血清中潜在的病原微生物(如引起牛海绵状脑炎的朊病毒)，给血清的使用带来了不容忽视的安全隐患；⑤由于血清培养基中的蛋白质很难通过普通分离方法彻底去除，，从而造成细胞表达产物分离纯化难度较高，严重影响产品的最终质量。这些不利因素促使了培养方法的改进，用无血清细胞培养基替代血清培养基。
[0004]目前针对无血清培养基的研发主要集中在以下几种细胞:疫苗生产细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞、杂交瘤细胞等)、干细胞(例如间充质干细胞、胚胎干细胞、表皮干细胞等)和其他细胞(如神经细胞、内皮细胞、软骨细胞等)。无血清培养基针对性很强，没有广泛的适应性，同类型的细胞、甚至不同细胞系或细胞株都可能有各自的无血清培养基，对无血清培养基的适应往往不同。成纤维细胞因其增殖具有血清依赖性，在无血清条件下培养较为困难，所以目前针对成纤维细胞的无血清培养基很少，仅有少数外国企业的无血清培养基，主要有:ATCC 公司的 Fibroblast Growth Kit Serum-Free, Sciencell 公司的 FibroblastMedium-serum free (FM_sf)和 HyClone 公司的 FetalClone? III 等产品。国内尚无同类产品，也未见文献或专利公开有用于成纤维细胞的无血清培养基的详细资料。[0005]目前，用于其他细胞培养的无血清培养基存在的共同问题:①白蛋白作为血清的主要成分，是无血清培养基中普遍的添加成分，由于牛血清白蛋白(BSA)为动物源性蛋白，可能携带致病因子；目前的无动物源性培养基多是采用重组白蛋白(HSA)替代BSA，导致培养基成本较高。②血清中含有多种贴壁因子，依赖血清的细胞在无血清培养时则不易贴壁，所以在无血清培养贴壁细胞时，需要提前包被贴壁因子，增加了操作的复杂性，而且常用的贴壁因子(如胶原、多聚赖氨酸、纤连蛋白、层粘连蛋白等)价格昂贵，提高了培养基成本。③多数无血清培养基的使用需给细胞一个适应过程，逐步降低培养基中血清浓度，最终过渡到无血清培养；另外，在用于原代培养时，还需要额外添加2%的血清，使其不成为真正意义上的无血清培养。④无血清培养基传代次数较少，例如，ATCC公司的Fibroblast GrowthKit Serum-Free培养基在说明书中明确指出，培养10代之后细胞增殖速率减缓。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种针对成纤维细胞培养的无血清培养基，其中不添加白蛋白和贴壁因子，能够避免血清中复杂成分造成的潜在隐患，使成纤维细胞接近在含血清培养基中的生长增殖状态，从而满足规模生产和应用的需要。
[0007]本发明所提出的无血清成纤维细胞培养基是由基础培养基与外源添加物组成，其中，基础培养基为DMEM商用培养基，或DMEM商用培养基与F12商用培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。
[0008]所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为I~3份、F12培养基为1份；所述的外源添加物为:胰岛素或胰岛素样生长因子(IGF)为I~20 mg/L，转铁蛋白为I~20 mg/L,谷氨酰胺为I~10 mM，三碘甲状腺氨酸(T3)为0.01~5 μ Μ，氢化可的松为0.01~5mg/L，地塞米松为0.01~10 μ g/L,乙醇胺为5~30 μ M，腺嘌呤为5~30 mg/L,葡聚糖为10~30g/L,亚硒酸钠为I~15 μ g/L, 2_巯基乙醇为50~100 μ Μ,维生素E (Ve)为2~20mg/L，维生素C (Vc)为2~50mg/L，脂类浓缩剂为lmL/L，碱性成纤维生长因子(bFGF)为I~50 μ g/L，表皮生长因子(EGF)为I~10μ g/L，转化生长因子(TGF-β )为I~10μ g/L，血小板衍生生长因子(PDGF)为I~10 μ g/L。[0009]本发明的无血清成纤维细胞培养基，不添加动物源性白蛋白和重组白蛋白以及贴壁因子，适用于人成纤维细胞的原代和传代培养，以及由血清环境直接转入无血清环境的人成纤维细胞体外培养，所培养细胞的生长状态与含血清培养的效果一致。
[0010]细胞在无血清培养时必须加有活性因子，以取代血清支持细胞生长，如各种激素、生长因子和转运蛋白等，其中起主要作用的有3~4种，普遍认为胰岛素、转铁蛋白、谷氨酰胺和亚硒酸钠是无血清培养中的必需成份。
[0011]本发明组分中激素的作用为:激素是血清的重要成分之一，无血清培养基中激素缺乏会导致细胞无法正常增殖。本发明组分中包含了血清激素的几种主要组分，能最大限度的模拟血清环境，满足细胞生长，其中所含激素类化合物的作用如下。
[0012]胰岛素和IGF:在无血清培养条件下，缺乏血清会使细胞的有丝分裂停止在细胞周期的Gl期，使细胞失去分裂能力，最终衰老死亡；胰岛素及IGF能够激活包括小分子G蛋白Ras在内的几种信号通路,最终激活MAPKs (Mitogen-activated protein kinases),启动DNA、蛋白质和脂肪酸的合成，使细胞由Gl期进入S期，促进细胞分裂增殖；
T3是甲状腺激素的主要活性成分，在细胞分化、生长、发育及维持机体平衡稳态等方面发挥着关键作用，能够促进DNA合成和细胞对葡萄糖的吸收，近年来研究发现T3还具有调节细胞铁代谢的作用；
地塞米松和氢化可的松:属于糖皮质激素，对成纤维细胞的增殖作用是双向的，受细胞来源、接种密度、细胞代谢状态、激素作用时间长短等因素影响，对细胞起促进或抑制作用；在本发明的浓度范围内，这两种糖皮质激素能够促进成纤维细胞的生长。
[0013]本发明组分中的抗氧化剂的作用为:细胞的生理代谢会产生自由基，自由基在细胞内聚集会导致细胞膜上的不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物，这种过氧化物能破坏细胞膜及其亚细胞器膜的结构，使膜肿胀、融合从而导致细胞死亡。在无血清培养时，因缺少血清中的抗氧化体系，细胞更容易积累自由基，因此需要通过添加抗氧化剂保护细胞不受自由基损伤。本发明与其他无血清培养基相比，抗氧化剂种类从常用的一两种增加至四种，依靠多种抗氧化剂之间的协同作用，能有效控制细胞氧化损伤，大大延长细胞培养代数。
[0014]Ve和V。:维生素E能阻止类脂的氧化作用，清除脂质自由基，防止不饱和脂肪酸过氧化物的生成，对生物膜起保护作用。Ve与硒共同使用，能降低组织中过氧化物的水平。维生素C能中和体内所产生的自由基，从而减轻自由基所造成的氧化损伤，参与生物氧化和还原及细胞呼吸过程，同时有促进酪氨酸和色氨酸代谢以及胶原合成作用。V。与Ve共同使用具有协同效应，Vc能将生育酚氧自由基再生转化为VE，同时通过清除氧自由基来减少Ve的消耗；
亚硒酸钠:硒是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的必需成分，参与过氧化物的分解，通过添加亚硒酸钠增加GSH-Px的活性，能对细胞产生抗氧化保护作用；
2-巯基乙醇:常用于二硫键的还原，在培养基中可以作为抗氧化剂，使谷胱甘肽维持在还原状态，有效提高细胞内还原性谷胱甘肽(GSH)的含量，从而通过GSH抵御过氧化氢对细胞的损伤。
[0015]本发明中所含细胞生长因子的作用为:血清中含有多种细胞生长因子，生长因子能加强蛋白质基因的转录，加速细胞由G0-G1、Gl-S期的转换，缩短细胞群体倍增时间，促进细胞分裂与增殖；缺乏细胞生长因子，成纤维细胞会出现增殖缓慢，传代次数减少的现象。
[0016]本发明中所含合成前体的作用为:脂类浓缩剂能提供细胞膜合成及细胞生长所需的脂质，本发明使用的商用脂类浓缩剂主要成分包括:花生四烯酸、亚油酸、豆蘧酸、亚麻酸、油酸、胆固醇、棕榈烯酸、棕榈酸、硬脂酸。腺嘌呤是核酸的组成成分，在体内参与RNA和DNA合成，在促进细胞分裂中起活化作用。乙醇胺是磷脂和细胞膜合成的前体物质，对细胞生长有促进作用。
[0017]本发明中所含转金属蛋白的作用为:成纤维细胞表面有转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白复合物结合是细胞获取必需微量元素铁的主要来源，转铁蛋白还具有生长因子的性质，促进细胞增殖，并与其他微量元素如钒等结合，有助于细胞吸收。缺少转铁蛋白，细胞将因无法吸收微量元素而死亡。
[0018]本发明中所含谷氨酰胺的作用为:谷氨酰胺是细胞培养基中的必需成分，可作为细胞生长的主要能源和氮源，是细胞合成嘌呤、嘧啶、蛋白质及多肽必需的氨基酸，谷氨酰胺的缺乏会导致细胞生长不良甚至死亡。
[0019]本发明中所含葡聚糖的作用为:细胞渗透压对细胞的生长至关重要，培养基中渗透压的改变会导致细胞收缩或溶胀，使DNA和蛋白遭到破坏，细胞周期停滞，最终导致细胞死亡。本 申请人:通过实验发现，葡聚糖具有渗透压缓冲能力，可用于维持培养基中的正常渗透压，使细胞免受损伤；葡聚糖同时对激素、生长因子等也具有非特异的保护作用。
[0020]本发明无血清成纤维细胞培养基的制备方法为:采用超纯水配制基础培养基；为使培养效果更好，可在DMEM培养基中混入F12培养基，得到基础培养基；在基础培养基中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入三碘甲状腺氨酸、氢化可的松、地塞米松、腺嘌呤、亚硒酸钠、2-巯基乙醇、VE、Vc、脂类浓缩剂、谷氨酰胺、乙醇胺、bFGF、EGF、TGF- β、TOGF、胰岛素或胰岛素样生长因子、转铁蛋白；调PH至7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4°C保存。
[0021]采用本发明 无血清成纤维细胞培养基培养原代成纤维细胞按以下操作:1)将消化后获得的成纤维细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清成纤维细胞培养基重悬，按
0.5X IO4~5X IO4个/cm2的细胞密度接种培养；2)培养I天后换液，之后每2~3天换液一次；3)待细胞生长汇合至60%时，可进行传代。
[0022]采用本发明无血清成纤维细胞培养基培养传代成纤维细胞按以下操作:1)将消化获得的细胞用PBS溶液清洗，离心后用无血清培养基重悬细胞，按IX IO4~5X IO4个/cm2的细胞密度接种培养；2)每2~3天换液一次，待细胞生长汇合至80%时，进行下一次传代。
[0023]与现有技术相比，本发明的优点是:①未添加动物源性白蛋白和重组白蛋白，避免了可能携带的安全隐患，同时降低了培养基成本，有利于规模化培养；②同时适用于人成纤维细胞的原代和传代培养，而且原代培养不添加血清，原代细胞在本发明培养基中能够保持较好的细胞形态，呈细长梭状、边缘清晰、伸展良好，细胞增殖旺盛，与含血清培养基培养的成纤维细胞状态相似(见附图2);③在培养成纤维细胞前不需要用贴壁因子包被，实验证明，原代和传代成纤维细胞均可以贴壁，原代24小时贴壁率在60%以上，传代24小时贴壁率在80%以上，与含血清培养基培养的成纤维细胞无差异能满足多次传代需要，培养代数较长，本发明培养基能维持成纤维细胞从原代传至15~20代，且传至15代后仍然能保持与含血清培养基培养的成纤维细胞相似的生长状况，细胞在无血清组中伸展良好，形态为长梭形，悬浮细胞少，分布均一，呈单层极性排列(见附图1);实验证明，将相同数量的细胞分别接种至含血清培养基和本发明无血清培养基中，培养6天后，含血清组与无血清组中的细胞密度相差不明显，说明成纤维细胞在本发明培养基中增殖速率与含血清培养基接近或相当，生长前期无血清组细胞增殖速率甚至稍快于血清对照组(见附图3) 将成纤维细胞从含血清培养基中直接转移至本发明培养基中，细胞可顺利贴壁伸展，不需逐渐适应无血清的生长环境；⑥成纤维细胞在无血清培养时能保持与血清组相似的功能，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同培养基中成纤维细胞分泌的角质细胞生长因子(KGF)含量，发现成纤维细胞在本发明培养基中分泌的KGF含量与血清组相差不大，说明本发明培养基中成纤维细胞功能未受到影响(见附图4)。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]附图1为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的传代成纤维细胞效果对比的显微照片，其中A为无血清培养组(无血清组)，B为含血清培养组(血清组)；通过观察两组细胞形态，可知成纤维细胞在本发明培养基中传至15代后依旧保持与血清组相似的生长状况，说明无血清培养基足以维持成纤维细胞的良好生长。
[0025]附图2为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的原代成纤维细胞生长状态对比的显微照片，其中C为无血清组的细胞形态，D为血清组的细胞形态，E为无血清组从原代传至第20代的细胞形态，F为血清组从原代传至第20代的细胞形态；可以看出，本发明培养基能够成功培养原代成纤维细胞，细胞形态与血清组相似，且从原代传至第20代仍保持稳定的细胞形态。
[0026]附图3为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的成纤维细胞生长对比曲线，图中SFM曲线(serum-free medium)为无血清组的，SCF曲线(serum-contentmedium)为血清组的，可见成纤维细胞在无血清培养基中增殖速率与含血清培养的生长状态接近。[0027]附图4为采用本发明无血清培养基与含血清培养基培养的成纤维细胞分泌角质细胞生长因子(KGF)的ELISA检测结果对比表，结果显示，两组之间KGF含量相差不大，无血清组甚至略高，说明本发明培养基所培养成纤维细胞的功能与血清组的相似。
【具体实施方式】
[0028]以下结合实例说明本发明技术方案的【具体实施方式】和使用效果。
[0029]实例中所使用的DMEM商用培养基和F12商用培养基均购自Gibco公司，各种细胞生长因子购自peprotech公司，脂类浓缩剂购自Gibco公司，其余试剂均购自sigma公司。
[0030]实施例1、人成纤维细胞的原代培养
配制培养基:将DMEM培养基与F12培养基按3: I的体积比混合；按30g/L加入葡聚糖搅拌溶解后，再分别加入三碘甲状腺氨酸5 μ Μ、氢化可的松5mg/L、地塞米松5 μ g/L、腺嘌呤20mg/L、亚硒酸钠15 μ g/L、2_巯基乙醇50 μ M、Ve 5mg/L>Vc 50mg/L、脂类浓缩剂ImL/L、谷氨酰胺 5mM、乙醇胺 5 μ M、bFGF 50 μ g/L、EGF 10 μ g/L、TGF-β 10 μ g/L、PDGF 10 μ g/L、胰岛素10mg/L、转铁蛋白10mg/L ;用HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.2 μ m滤膜过滤除菌，得到无血清成纤维细胞培养基。[0031]使用实例:将消化后的人成纤维细胞用PBS溶液清洗；离心后用所配制的无血清成纤维细胞培养基重悬，按2X IO4个/cm2接种至培养瓶中，置入培养箱在37°C、5% CO2条件下培养；24h后换液，继续培养，之后每隔2d换液。原代细胞在无血清培养基中能较快贴壁，24h内贴壁率可达60~70%，10天左右细胞达到60%汇合，即可进行传代培养。
[0032]原代细胞在本发明培养基中能够保持较好的细胞形态，细胞呈细长梭状、边缘清晰、伸展良好，细胞增殖旺盛，与含血清培养基培养的成纤维细胞状态相似(参见附图2)。
[0033]实施例2、人成纤维细胞的传代培养
配制培养基:以DMEM培养基为基础培养基，按10g/L加入葡聚糖搅拌溶解后，再分别加入三碘甲状腺氨酸I μ Μ、氢化可的松0.05mg/L、地塞米松0.05 μ g/L、腺嘌呤30mg/L、亚硒酸钠2 μ g/L、2-巯基乙醇100 μ M、Ve 5mg/L、Vc 10mg/L、脂类浓缩剂lmL/L、谷氨酰胺2mM、乙醇胺 20 μ M、bFGF 10 μ g/L、EGF 5 μ g/L、TGF- β 2 μ g/L、PDGF 2 μ g/L、胰岛素样生长因子5mg/L、转铁蛋白5mg/L ;用HCI溶液调pH至7.2，定容后用0.2 μ m滤膜过滤除菌，得到无血清成纤维细胞培养基。
[0034]使用实例1:将实施例1原代培养至60%汇合的细胞消化后，用PBS溶液清洗，离心弃上清后用本实例所配制无血清培养基重悬细胞，按I X IO4个/cm2的细胞密度接种，置于37°C、5% CO2条件培养箱进行培养；每隔3天换一次液，待细胞生长汇合至80%时，可进行下一次传代。
[0035]使用实例2:将含血清培养基中培养的人成纤维细胞用PBS清洗以去除残余血清；经胰蛋白酶消化后，用PBS溶液清洗一次，离心弃上清后用本实例所配制的无血清培养基重悬细胞，按2 X IO4个/cm2的细胞密度接种培养；每隔2d换一次液，待细胞生长汇合至80%时，可进行下一次传代。
[0036]传代细胞24h内贴壁率可达80%，细胞生长3~4d后可传代，无论是从原代细胞转入无血清培养的成纤维细胞，还是从血清培养中直接转移至无血清培养的成纤维细胞，均可在无血清培养基中传15代左右，且后期依旧能保持与血清组相似的生长状况，细胞伸展良好，形态为长梭形，悬浮细胞少，分布均一，呈单层极性排列(参见附图1)。
【权利要求】
1.一种无血清成纤维细胞培养基，是由基础培养基与外源添加物组成，其特征在于，基础培养基为DMEM培养基，或DMEM培养基与F12培养基的混合培养基；外源添加物包括激素、转金属蛋白、谷氨酰胺、脂类浓缩剂、抗氧化剂、嘌呤、糖类和细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的混合培养基按体积比DMEM培养基为I~3份、F12培养基为1份。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的外源添加物为:胰岛素或胰岛素样生长因子为1~20 mg/L,转铁蛋白为1~20 mg/L,谷氨酰胺为1~10 mM,三碘甲状腺氨酸为0.01~5 μ M,氢化可的松为0.01~5mg/L,地塞米松为0.01~10 μ g/L,乙醇胺为5~30 μ M,腺嘌呤为5~30 mg/L,葡聚糖为10~30g/L,亚硒酸钠为1~15 μ g/L, 2_巯基乙醇为50~100 μ M，Ve为2~20mg/L, Vc为2~50mg/L,脂类浓缩剂为lmL/L, bFGF为1 ~50 μ g/L, EGF 为 1 ~10 μ g/L, TGF- β 为 1 ~10 μ g/L, PDGF 为 1 ~10 μ g/L。
4.制备权利要求1所述的无血清成纤维细胞培养基的方法，其特征在于，采用超纯水配制基础培养基；在基础培养基中先加入葡聚糖搅拌溶解，再分别加入三碘甲状腺氨酸、氢化可的松、地塞米松、腺嘌呤、亚硒酸钠、2-巯基乙醇、VE、V。、脂类浓缩剂、谷氨酰胺、乙醇胺、bFGF、EGF、TGF-13、H)GF、胰岛素或胰岛素样生长因子、转铁蛋白；调pH至7.2，定容后用滤膜过滤除菌，4°C保存。
【文档编号】C12N5/071GK103911339SQ201310003115
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年1月6日 优先权日:2013年1月6日
【发明者】贺晓静 申请人:陕西博鸿生物科技有限公司