专利名称：一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌菌群结构的解析方法，尤其是指利用特定rDNA长片段来进行解析。
背景技术：
DGGE (变性梯度凝胶电泳)和TGGE (温度梯度凝胶电泳)是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，目前已经成为微生物分子生态学的重要手段，被广泛用于菌群多样性研究。这两种技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，其分离原理基本一致一是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度(DGGE)或者温度梯度(TGGE)的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。各种类的微生物都拥有其特有的rDNA序列，这些序列可以作为 它们的标识，并且均可以通过DGGE和TGGE进行分离。因此这两项技术通常和rDNA分子鉴定技术相结合用于将微生物菌群多样性信息转化为微生物菌群结构信息。而对于真菌菌群结构的解析而言，常采用18S rDNA序列或ITS序列上的某一段可变区做为目标片段。上述两项技术虽然是微生物生态研究中解析菌群多样性的重要手段，但是它们也存在着难以分析长片段(>500bp)的不足，这对于菌群结构信息的准确获取是十分不利的。具体来说，DGGE和TGGE均对200_500bp的DNA片段具有较好的分离效果，超过500bp则分辨率都会显著下降一这样就会影响到菌群多样性的解析。虽然小于500bp的短片段有利于DGGE和TGGE的分离，但是这样的片段却无法满足之后分子鉴定的需要。因为这样的片段(200-500bp)携带的序列信息有限，即使是500bp也分别只占到作为常用的真菌分子鉴定标准——18S rDNA全长序列的1/4和ITS序列的2/3左右，因此往往无法获得精准的分子鉴定结果。
发明内容
为了克服上述DGGE和TGGE技术在真菌菌群结构解析中的不足，本发明提供了一种基于特定rDNA长片段的分析方法可以在保证分离效果的情况下，同时获得18S rDNA近全长序列和ITS序列用于分子鉴定，因此将会得到十分精准的真菌菌群结构信息，这样DGGE和TGGE技术就可以更加有效地用于真菌菌群结构的解析。准确获知样品中微生物种属信息是微生物生态研究中最基本也是最重要的一环，因此本发明对真菌菌群结构研究领域具有较大的意义。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下
一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，所述特定rDNA长片段是指一段包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段(图1)，它是由靶向18S rDNA序列的上游引物NSl和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的；所述18S rDNA近全长序列是指一端起始于引物NSl对应区域直至另外一端的序列，长约1780bp,相当于cererisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的20-1800位点；所述靶向ITS序列的下游引物必须与NSl构成引物对特异性地扩增两者结合位点之间的片段，并且扩增片段长度大于2000bp。
本发明用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构时采用的是DGGE或TGGE技术。所述方法包括如下步骤
a、提取样品中微生物总基因组DNA；
b、采用靶向18SrDNA序列的上游引物NSl和靶向ITS序列的下游引物扩增所述特定rDNA长片段；
C、将步骤b中扩增的特定rDNA长片段进行DGGE或TGGE分析；
d、割胶回收特定rDNA长片段条带，采用同样的引物扩增特定rDNA片段全长序列或者分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段；所述同样的引物是指步骤b中用于扩增特定rDNA长片段的引物； e、将步骤d中获得的特定rDNA长片段或者18SrDNA片段和ITS片段进行测序，再将测定的18S rDNA序列和ITS序列分别提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，最终结合两者的结果综合判定对应菌株的种属。其中，关于靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对的选取，是将扩增特定rDNA长片段所采用的靶向18S rDNA序列的上游引物NSl和靶向ITS序列的下游引物分别作为靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对之一。其中，对特定rDNA片段进行直接测序，如前所述可以得到长约1780bp的18S rDNA序列和剩下的ITS序列。本发明的显著效果利用特定rDNA长片段的DGGE或TGGE分析方法，可以在保证电泳分离效果的情况下同时获得18S rDNA近全长序列和ITS序列，这样就可以在保证真菌菌群多样性得到良好解析的同时获取十分精准的菌群结构信息，因此本发明可以使DGGE和TGGE技术更加有效地用于真菌菌群结构的解析。
图1是特定rDNA长片段示意图。图中展示出18S rDNA片段及与其相邻的ITS片段，其中黑色区带部分表示的是18S rDNA片段，白色区带部分表示的是ITS片段，双箭头区域表示的是18S rDNA远离ITS序列的末端区域。图2是16种真菌的18S rDNA末端区域的序列比对图谱。图中1_16表示16种菌的编号，所代表的种属详见表I，图中NSl表不引物；图中ruler标识的1-160区域为低GC含量片段，而160-280区域含有三个高GC含量片段，分别用三个方框大致标出。引物NSl的靶向位点位于18S rDNA远离ITS序列的末端区域中。虽然收集到的各真菌的18S rDNA序列在远离ITS序列的末端起始情况不一，但至少起始于第20位点，为了分析方便，部分真菌的18S rDNA序列末端以引物NSl序列补齐，这样并不会影响到其低GC含量的序列特性。图3为引物对NS1-1TS4扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱。图4为引物对NS1-1TS4扩增片段的DGGE分析图谱，图中四条可识别条带分别用
a、b、c和d在所在位置处进行标识。图5为由引物对FRl-NSl扩增得到的18S rDNA片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱，图中M表示DNA Marker, a、b、c和d分别对应于图4中DGGE的四条条带。此处a、b、c和d 四条条带测序结果分别如 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 所示。图6为ITS片段的琼脂糖凝胶电泳检测图谱，图中M表示DNA Marker, a、b、c和d分别对应于图4中DGGE的四条条带。此处a、b、c和d四条条带测序结果分别如SEQ IDNO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12 所示。图7为条带b片段的18S rDNA序列的分子鉴定结果截图。图8是为条带b片段的ITS序列的分子鉴定结果截图。
具体实施方式
一、本发明基于特定rDNA长片段的DGGE或TGGE分析原理
经过对目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列进行分析发现，18S rDNA远离ITS序列的末端区域(参见图1)具有特殊的序列特性其一端含有160bp左右的低GC区域，相当子Saccharomyces cereFisiae 标准菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列(Accession Number为Z75578)的20-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域,分别相当于Saccharomyces cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18S rDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解性质差异将十分悬殊。因此包含该末端区域的片段可以在低变性梯度的条件下利用低熔解区差异进行分离，剩下的部分相当于高熔解区则不会发生解链可以充当GC夹板。在本实施例进行之前，以福建红曲黄酒酿造用曲中的真菌菌群的18S rDNA序列为例，对其远离ITS序列的末端区域的序列特性进行分析。实验室前期从四种典型福建红曲黄酒酿造用曲中分离出23株真菌纯菌株，经鉴定共有16种。在Silva数据库中收集这些真菌种属的18S rDNA序列，利用clustalx软件(clustalx1. 8)进行比对,截取引物NSl对应末端区域的比对结果如图2所示；对引物NSl对应末端区域的序列熔解特性进行统计分析，结果如表I所示。结合图2和表I可知，所收集到的18S rDNA序列一端含有160bp左右的低GC区域,相当于cereFisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列(Accession Number为Z75578)的20-183位点，其平均GC含量只有35%左右，并且具有极高的可变性；紧邻低GC区域的另一端含有三个排列紧凑的高GC区域(图2方框部分)，分别相当于cereFisiae 标准菌株 NCYC 505 的 18S rDNA 序列(AccessionNumber为Z75578)的184-202位点、223-244位点和268-291位点，平均GC含量在65%以上，并且具有良好的保守性。这样就导致18S rDNA远离ITS序列的末端区域拥有低熔解区和高熔解区，并且两者之间的熔解性质差异将十分悬殊。因此包含该末端区域的片段可以在低变性梯度的条件下利用低熔解区差异进行分离，剩下的部分相当于高熔解区则不会发生解链可以充当GC夹板。经过分析，目前已知的各主要真菌种属的18S rDNA序列也具有相同的特性。
表I 16种真菌的18S rDNA末端区域的序列特性信息
权利要求
1.一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，其特征在于所述特定rDNA 长片段是指一段包含18S rDNA近全长序列和ITS序列的片段，它是由靶向18S rDNA序列的上游引物NSl和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的；所述18S rDNA近全长序列是指一端起始于引物NSl对应区域直至另外一端的序列，长约1780bp,相当于SaccAaro焊 cerevisiae标准菌株NCYC 505的18S rDNA序列的20-1800位点；所述祀向ITS序列的下游引物必须与NSl构成引物对特异性地扩增两者结合位点之间的片段，并且扩增片段长度大于 2000bp。
2.根据权利要求1所述的一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，其特征在于用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构时采用的是DGGE或TGGE技术。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构方法，其特征在于所述方法包括如下步骤a、提取样品中微生物总基因组DNA；b、采用靶向18SrDNA序列的上游引物NSl和靶向ITS序列的下游引物扩增所述特定 rDNA长片段；C、将步骤b中扩增的特定rDNA长片段进行DGGE或TGGE分析；d、割胶回收特定rDNA长片段条带，采用同样的引物扩增特定rDNA片段全长序列或者分别采用靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对扩增其包含的18S rDNA片段和ITS片段；所述同样的引物是指步骤b中用于扩增特定rDNA长片段的引物；e、将步骤d中获得的特定rDNA长片段或者18SrDNA片段和ITS片段进行测序，再将测定的18S rDNA序列和ITS序列分别提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，最终结合两者的结果综合判定对应菌株的种属。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种利用特定rDNA长片段解析真菌菌群结构的方法，其特征在于关于靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对的选取，是将扩增特定rDNA长片段所采用的靶向18S rDNA序列的上游引物NSl和靶向ITS序列的下游引物分别作为靶向18S rDNA序列的引物对和靶向ITS序列的引物对之一。
全文摘要
DGGE和TGGE这两项技术在微生物菌群结构研究中存在的主要不足是，无法通过用于电泳分离的DNA片段上携带的有限序列信息对其真正代表的微生物进行精准的分子鉴定。针对这一点，本发明提供了一种基于特定rDNA长片段的真菌菌群结构分析方法，所述特定rDNA长片段是指一段包含18SrDNA近全长序列和ITS序列的片段，它是由靶向18SrDNA序列的上游引物NS1和靶向ITS序列的下游引物扩增得到的，扩增产物长度大于2000bp。利用特定rDNA长片段的DGGE或TGGE分析方法，可以在保证电泳分离效果的情况下同时获得18SrDNA近全长序列和ITS序列，这样就可以在保证真菌菌群多样性得到良好解析的同时获取十分精准的菌群结构信息，因此本发明可以使DGGE和TGGE技术更加有效地用于真菌菌群结构的解析。
文档编号C12Q1/68GK103014171SQ20131000401
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月7日 优先权日2013年1月7日
发明者倪莉, 黄志清, 刘志彬 申请人:福州大学