专利名称：人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是利用狂犬病毒PM株在人二倍体细胞上制备病毒液的方法。
背景技术：
狂犬病在100多个国家均有流行。全世界超过33亿人居住在狂犬病流行地区，尤其是亚洲和非洲。人类感染狂犬病病毒后，一旦出现临床症状几乎100%死亡，99%的死亡由犬狂犬病造成，除家犬外很多肉食动物和蝙蝠也可以向人类传播狂犬病病毒。亚洲是狂犬病高发地区，约占全球因犬伤所致人狂犬病死亡病例的90%。2000年，在亚洲15个狂犬病流行国家生活的31.1亿人口中，约37000人死于狂犬病。大多数人由于暴露于狂犬病病毒潜在感染，而没有接受治疗或者注射任何疫苗而导致死亡。卫生部2009年、2010年全国法定传染病报告发病、死亡统计表中，狂犬病的死亡率第一，死亡数第三，狂犬病已成为我国最严重的公共卫生问题之一。
根据我国人用狂犬病疫苗的使用量每年被动物伤害的人数超过1000万人。为满足我国国内市场的需求，国内很多厂家都在生产狂犬疫苗，主要包括原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和Veix)传代细胞疫苗。这些疫苗都存在异源蛋白，外源因子，DNA污染等各种不同的风险因素。另外原代细胞培养需每批疫苗须检查培养器官源的杂质(细菌、支原体、病毒)，并且动物器官的可用量是限制工业化生产的因素；而Veix)细胞属于猴源细胞，宿主 DNA残留比较高，存在致瘤风险。国外生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，如美国Wyeth厂，法国Sanofi Pasteur厂和德国Behring厂生产的二倍体疫苗,具有高免疫原性和良好的耐受性，和无异源蛋白的不良影响，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚洲国家使用。
因目前国内人用二倍体狂犬病疫苗所使用的MRC-5细胞基质来源于ATCC，而ATCC 明确指出仅供研究用，考虑到未来狂犬病疫苗工业化生产，故本研究所使用的MRC-5细胞来源于Sanofi Pasteur的细胞生产库,Sanof i Pasteur的细胞生产库是从NIBSC得到早代细胞建立而成的，狂犬病毒PM株亦购买于Sanofi Pasteur的病毒生产库，MRC-5细胞和PM 病毒签订协议允许可用于狂犬病疫苗的生产。为本发明的大规模生产提供了有力的保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法。
本发明提供一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，是在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒PM株，培养病毒感染的人用二倍体细胞得到狂犬病毒液，所用的人用二倍体细胞是MRC-5。
本发明的人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，包括如下步骤
( I) MRC-5细胞的复苏与扩培；
(2 )在MRC-5细胞上接种狂犬病病毒PM株；
(3)接种PM毒株后的MRC-5细胞继续传代扩培；
(4)冲洗细胞，之后加入病毒培养液
(5)收获病毒液。
其中，步骤(I)的MRC-5细胞在15 25°C的水浴中复苏，5 9h后更换细胞培养液。
其中步骤(I)细胞扩增按照1:2 1:4的比例传代扩增培养，得到细胞悬液。
其中，步骤(2)按照O. 05-0.1MOI接种狂犬病毒至细胞悬液，36°C _38°C水浴保温 13-17min，之后继续培养。
步骤(2)按照1:2 1:4的比例分种36 38°C培养20-25h后，调温至33 36 °C继续培养。
其中，步骤(3)的方法是先用PBS溶液洗涤细胞面，再用胰酶消化细胞，用细胞培养液重悬细胞，制成病毒细胞悬液。按照1:2 1:4的比例分种。
本发明的制备方法中，步骤(I)、(2)、(3)中MRC-5细胞培养液为含10°/Γ20%胎牛血清的BME培养液，pH值为6. 90 7. 20，渗透压为30(T340mosm/kg，不含抗生素。
进一步地，步骤(I)、(2)、(3)细胞培养温度为33 38°C。
进一步地，步骤(4)、(5)细胞培养温度为33 36°C。
其中，步骤(4)中使用的冲洗液为BME液，pH值为6. 80^7. 10，渗透压为 290-320mosm/kg,不含抗生素。
本发明方法步骤(4 )冲洗细胞分两步，目的在于去除牛血清白蛋白，第一次冲洗细胞面，先用冲洗液冲洗表面，然后加入人白培养液培养细胞16_20h后，进行第二次冲洗，用冲洗液冲洗细胞表面之后，加入病毒培养液培养3 4d,所述人白培养液为含O. 2%" . 5%人血白蛋白的BME液，pH值为6. 80-7. 10，渗透压为290-320mosm/kg，不含抗生素。
本发明的制备方法中，步骤(4)中病毒培养液为含O. 29ΓΟ. 5%人血白蛋白的BME培养液，PH值为7. 30 8. 00，渗透压为31(T350mosm/kg，不含抗生素。
本发明的步骤(5)中病毒液收获是指经过增殖收获病毒细胞的上清液。单次收获后，继续补加O. 6-0. 9ml/cm2的病毒培养液继续33°C _36°C培养。可连续收获3至5次。
本发明提供的人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，还包括病毒液收获后进行浓缩的步骤。
其中，本发明的实施例中使用IOKB超滤膜包超滤进行浓缩，浓缩倍数为 10. (Γ20. O倍。浓缩后的浓缩液过滤后存放于2 8°C保存，不超过30天。
本发明方法中，步骤(5)中病毒液的滴度不低于6. 51gCCID5(l/ml，浓缩后病毒液的滴度不低于7. 51gCCID50/ml且效价不低于4. 0IU/ml。
本发明提供的在人用二倍体细胞MRC-5上接种狂犬病毒PM株，培养病毒感染的人用二倍体细胞得到狂犬病毒液的方法适合大规模工业化生产 ，病毒液滴度稳定。本发明的制备方法由于采用带毒细胞连续传代的工艺，延长了细胞的带毒时间，提高了病毒液中病毒的收获量，短时间内达到希望的病毒量，从而缩短了制备工艺的时间，节省了狂犬病毒PM 株毒种的用量。另外，本发明制备得到的病毒液抗原含量高，病毒效价、滴度高，达到了本领域内对人二倍体狂犬病疫苗病毒液质量标准和效果的要求。本发明方法适合推广使用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法(I)
取含有MRC-5细胞的冻存管，迅速放入20°C水浴中融化，然后加入到预温至25°C 的含20%胎牛血清细胞培养液(BME培养液，pH值为6. 90，渗透压为300mosm/kg，不含抗生素)中，置于37°C培养，连续扩增至细胞长成致密的单层细胞。将单层细胞制备为细胞悬液，将狂犬病毒PM毒种按照O. 07M0I接种，37°C水浴保温15分钟后分装按照1:3比例分装培养22小时，然后调温至35°C继续培养，待病毒细胞长成单层后，先用PBS溶液洗涤细胞面，再用O. 01%胰酶消化细胞，消化病毒细胞制备成病毒细胞终悬液，按照1:2比列分装 37°C培养23小时，然后调温至35°C继续培养48小时用冲洗液(BME液，pH值为7. 10，渗透压为320mosm/kg，不含抗生素)第一次冲洗细胞面，加入人白培养液(含O. 5%人血白蛋白的 BME液，pH值为7. 00，渗透压为300mosm/kg，不含抗生素)35°C培养19小时，再进行第二次细胞面冲洗，加入病毒培养液(含O. 5%人血白蛋白的BME培养液，pH值为7. 60，渗透压为 320mOsm/kg，不含抗生素)35°C培养。病毒经过4d增殖收集病毒细胞上清液.收集的病毒细胞上清液即为狂犬病毒液。
按以上方法，将狂犬病毒PM株连续在MRC-5细胞上传7代，将病毒液做10倍系列稀释至10_2后，再5倍系列稀释，取12-14g的小鼠接种，每个稀释度腹腔接种(IP)小鼠10 只，每只接种O.1ml ;每个稀释度脑腔接种(IC)小鼠10只，每只接种O. 03ml。逐日观察， 观察14天。计算IC滴度LD5Q/0. 03ml和IP滴度LD5(l/0.1ml的比值，IC/IP比值应不低于 1000。
将病毒液系列稀释，在96孔微量培养板中和一定浓度的BHK21细胞共培养一段时间后，通过异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬糖蛋白的单克隆抗体检测每孔中是否存在病毒， 通过荧光显微镜观察，以计算病毒对细胞的半数感染剂量，用IgCCID5ciAil表示。
表I不同PM株代次传代结果
权利要求
1.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，其特征在于，在人用二倍体细胞上接种狂犬病毒PM株，培养病毒感染的人用二倍体细胞得到狂犬病毒液，所述的人用二倍体细胞是MRC-5。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)MRC-5细胞的复苏与扩培；(2)在MRC-5细胞上接种狂犬病病毒PM株；(3)接种PM毒株后的MRC-5细胞继续传代扩培；(4)冲洗细胞，之后加入病毒培养液(5)收获病毒液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)的MRC-5细胞在15-25°C的水浴中复苏，5_9h后更换细胞培养液。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)按照O.05-0.1MOI接种狂犬病毒至细胞悬液，36°C _38°C水浴保温13-17min，之后继续培养。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)的方法是先用PBS溶液洗涤细胞面，再用胰酶消化细胞，用细胞培养液重悬细胞，制成病毒细胞悬液，培养2 3d。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)、(2)、(3)中MRC-5细胞的培养液为含10% 20%胎牛血清的BME培养液，pH值为6. 90-7. 20，渗透压为300-340mosm/kg， 不含抗生素。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中病毒培养液为含O.29ΓΟ. 5% 人血白蛋白的BME培养液，pH值为7. 30-8. 00，渗透压为310-350mosm/kg，不含抗生素。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)冲洗细胞的方法为先用冲洗液冲洗细胞表面，所述冲洗液为BME液，pH值为6. 8(Γ7. 10，渗透压为290-320mOsm/kg，不含抗生素；然后加入人白培养液培养16_20h，所述人白培养液为含O. 29ΓΟ. 5%人血白蛋白的BME液，pH值为6. 80-7. 10，渗透压为290-320mosm/kg，不含抗生素；用冲洗液进行第二次细胞面的冲洗，之后加入病毒培养液培养3 4d。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括病毒液收获后进行浓缩的步骤。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中病毒液的滴度不低于.6.5LgCCID5Q/ml，浓缩后病毒液的滴度不低于7. 5LgCCID50/ml且效价不低于4. 0IU/ml。
全文摘要
本发明提供了一种人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法，涉及生物技术领域，是利用狂犬病毒固定毒PM-1503-3M株接种于MRC-5细胞，生产人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液。本发明方法工艺简单，节约成本，制得的病毒液抗原含量高，病毒效价和滴度高，适合于大规模工业化生产，且可满足国内外市场对人二倍体狂犬病疫苗的需求。
文档编号C12N7/00GK103060276SQ20131000968
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者左静, 高正伦, 刘海文, 方群, 季振涛, 郑森远, 张骞, 刘勇, 张芮铭, 代凡, 吴淞, 张雪, 戴会忠, 刘雅静, 王云达, 樊鹏 申请人:北京民海生物科技有限公司