专利名称：基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，具体地说，涉及一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法。
背景技术：
转座元件(transposable element),是广泛分布于真核生物中的一类可移动的DNA片段，最早由美国冷泉港生物实验室著名遗传学家B.Mc Clintock在玉米中发现。MITE(miniature inverted repeat transposable element),即为转座子，是 Bureau 等新近发现的一类转座元件，其结构 与非自主元件相似，具有TIR或TSD结构，但又具有反转录转座元件的高拷贝性。MITE广泛分布在植物和动物的基因组中，并且多存在于基因富集区，推测其对基因组进化和基因表达等具有较大的影响。目前，MITEs已在许多生物体中发现，如水稻、秀丽隐杆线虫、蚊子、人、真菌。MITE的长度较短，一般为100 700bp，不能编码转座酶。它具有末端倒转重复序列(terminal inverted repeats,TIRs)和祀位点重复(target siteduplication,TSD)，并且能形成稳定的发夹式的二级结构。它倾向于插入到基因的内含子区或基因的5'和3'末端，但很少插入基因编码区，有的也能形成巢式结构。不同的MITE家族具有他们特异的TIRs和TSD。根据TSD序列的保守性，植物中的MITE被分为Tourist(具有3bp的TSD，TAA或TTA)和Stowaway (2bpTSD，TA)两大类。TIR是确定MITE不同家族的主要依据，不同物种的MITE元件TIR序列具有同源性。MITE拷贝数多，本身具有多态性并能产生插入多态性，可以揭示出种内和种间丰富的多态性信息，在遗传多样性和系谱分析研究中是一种有效的分子标记，具有一定的开发潜力。MITE在基因组中拷贝数很高，不同的MITE亚族成员具有成百上千个拷贝甚至更高。MITE以多拷贝分布在植物的各条染色体中，因此被视为进行精细多态性及遗传关系分析的良好工具。CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烧基三甲基溴化铵)方法是一种DNA提取经典方法，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种MITE特异性引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，并且该检测方法新颖、灵敏度高、特异性强。本发明的技术方案如下:一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，按照如下步骤完成:(I )、用CTAB方法提取家蚕样本微孢子虫的基因组DNA ；(2)、用MseI酶完全消化步骤(I)所得的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA，并与接头引物混合连接，形成连接混液，具体反应为0.5ml离心管中加入下列反应物并且混合均匀:接头引物:5'-CAGGGTGGGCAAA-3'SEQ NO I ；
权利要求
1.种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，其特征在于，按照如下步骤完成: (1)、用CTAB方法提取家蚕样本微孢子虫的基因组DNA； (2)、用MseI酶完全消化步骤(1)所得的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA，并与接头引物混合连接，形成连接混液，具体反应为0.5ml离心管中加入下列反应物并且混合均匀:
2.据权利要求1所述的基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，其特征在于:所述微孢子虫特异性MITE分型法检测引物核苷酸序列: NbME5 特异引物:5' -AAAGTTTGCCCACCCCTG-3'SEQ N02 ； NbMEl 特异性引物:5' -CCCTTGGGAAACACTG-3'SEQ N03 ； 接头引物:5' -CAGGGTGGGCAAA-3'SEQ NOl ； 锚定引物 1:5' -CAGGGTGGGCAAACT-3'SEQ N04 ； 锚定引物 2:5' -CAGGGTGGGCAAACA-3'SEQ N05 ； 是通过分析测序的家蚕微孢子虫全基因组数据，经过生物信息学分析微孢子虫的基因组而设计得到的该组微孢子虫特异性MITE分型法检测引物。
3.据权利要求1所述的基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，其特征在于:所述步骤(3)中的步骤B，离心的条件转速为3000转，离心时间为8 10s。
4.据权利要求1所述的基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，其特征在于:所述步骤(4)中的步骤B，离心的条件转速为3000转，离心时间为8 10s。
5.据权利要求1所述的基于转座子 的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，其特征在于:所述步骤(I)中，家蚕样本微孢子虫的基因组DNA可以为小量样品。
全文摘要
本发明公开了一种基于转座子的分子引物对家蚕微孢子虫的分型检测方法，按照如下步骤完成(1)用CTAB方法提取家蚕样本微孢子虫的基因组DNA；(2)用MseI完全消化步骤(1)所得的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA，然后与接头引物等混合形成20μl的反应体系；(3)连接有接头的家蚕样本微孢子虫的基因组DNA使用的接头引物和MITE特异性引物在25μl反应体系中进行扩增；(4)预扩增产物稀释20倍在第二轮PCR使用；(5)最终产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。本检测技术对家蚕微孢子虫的检测具有有效性强、特异性高、灵敏性高等特点，并且适用于小量样品操作，操作流程巧妙。
文档编号C12Q1/68GK103088129SQ20131001093
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者许金山, 周泽扬, 潘国庆, 王林玲, 李治, 党晓群 申请人:重庆师范大学