专利名称：一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法，属于植物基因工程领域。
背景技术：
自上世纪90年代开始，科学家就开始转基因玉米相关的研究。Gordon-Kamm等[Gordon-Kammet al.Plant Cell, 1990，2(7):603-618]和 Fromm 等[Fromm et al.Biotechnology (NY), 1990, 8(9): 833-839]最先报道通过基因枪轰击法转化玉米悬浮细胞并获得再生植株。Grimsley 等[Grimsley et al.Nature, 1987, 325 (I): 177-179]最早尝试通过使用根癌农杆菌作为介质将玉米条纹病毒浸染玉米。Gould等[Gould etal.Plant Physiol,1991, 95 (2):426-434]和 Shen 等[Shenet al.ProcNatlAcadSciUSA, 1993,90(4): 1488-1492]用根癌农杆菌浸染玉米茎尖并获得少量转基因玉米植株。相对于基因枪法，农杆菌转化法的优点是节省成本，外源基因多以单拷贝或低拷贝整合到植物基因组中，外源基因不易发生沉默，能稳定遗传表达。农杆菌介导的玉米转化里程碑式的工作来自于 Ishida 等[Ishida et al.Nat Biotechnol, 1996，14 (6): 745-750]，他们使用超双元载体通过农杆菌浸染玉米自交系A188幼胚，转化效率达到5-30%，真正使通过农杆菌法获得转基因玉米成为可能。Zhao等[Zhao et al.Maize Genet CoopNewslett, 1998，72:34-37]使用普通双元载体通过农杆菌转化法浸染玉米杂交种HiII，获得了较高的遗传转化效率。Frame 等[Frame et al.Plant Physiol, 2002，129 (I): 13-22]使用普通双元载体转化玉米HiII幼胚，其转化效率稳定在5%左右。但由于不同的受体材料所适用的转化方法并不相同，上述转化方法所采用的玉米受体材料是A188或HiII等易转化的材料，对于我国目前所用的玉米自交系材料而言，需要有针对性的研究影响其遗传转化效率的因素。目前文献报道中关于我国玉米自交系材料的侵染方法研究主要集中在调整乙酰丁香酮浓度、农杆菌浓度、培养基组分等，且转化率较低，因此，提供一 种提高玉米幼胚侵染效率的方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法。为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案:一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法，在侵染过程中对玉米幼胚先进行热激处理，再进行农杆菌侵染、共培养。所述热激处理温度为4(Γ50度，优选为45度。所述热激处理时间为3-7分钟。本发明还在共培养培养基中添加了半胱氨酸。所述半胱氨酸添加量为10(T400mg/L，优选为300mg/L。本发明中热激处理可以使玉米幼胚处于一种感受态的状态，农杆菌更易于粘附于幼胚表面并进入细胞。进入幼胚细胞中的农杆菌数量的增加，相应的提高了侵染效率。但是热激处理温度越高，处理时间越长，幼胚生长受到的影响越大，甚至死亡，因此申请人经大量实验，确定热激处理温度范围在40-50度，最终确定优选温度为45度。半胱氨酸是一种抗氧化剂，可以使玉米幼胚细胞在农杆菌侵染后不容易发生细胞程序化死亡，从而提高农杆菌侵染效率。低浓度的半胱氨酸作用有限，但高浓度半胱氨酸又会影响幼胚生长，因此申请人经大量实验，确定半胱氨酸浓度范围在10(T400mg/L，最终确定优选浓度为300mg/L。本发明提供的侵染方法通过热激处理和添加半胱氨酸，使得玉米幼胚侵染率提高到98%，大大提高农杆菌侵染玉米幼胚的侵染效率。本发明方法简单，操作方便，宜于推广使用。
图1为TO代转化体Bar蛋白的检测图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的试剂和材料，如无特殊说明，均为市售商品。实施例1一、侵染方法优化1、玉米受体材料准备温室或田间种植玉米自交系综31，取授粉后9-12天的玉米穗(幼胚约1.0-1.2mm)，去掉外苞叶，用镊子穿在穗子顶部在70%的乙醇中灭菌I分钟，然后放在超净台上吹干，从穗上剥离1_左右新鲜的幼胚`，作为受体材料，备用。2、农杆菌准备将植物表达载体pCambia3301通过冻融法转化到农杆菌EHA105中，_70°C保存菌株。将保存菌株在含100ug/ml卡那霉素和250ug/ml塞孢霉素的YEB固体培养基上划线，28 °C暗培养，至长出单菌落；第一天，挑取单菌落接种到5-10ml含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28°C振荡培养8小时；再以1:100的比例将震荡培养后的菌液接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28°C振荡过夜；第二天,将震荡培养过夜的菌液分装到2ml离心管中，于5000rpm、离心5min ;用含200uM乙酰丁香酮的侵染培养基(D-1nf-AS)重悬，调整0.D.600=0.3，备用；3、农杆菌侵染条件筛选I)样品1:将受体材料玉米幼胚放到含Iml侵染培养基(配方见表I)溶液的1.5ml离心管中，一个小时后用移液器吸去侵染培养基并加入Iml新的侵染培养基，颠倒混匀I分钟，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培养基溶液，加入Iml含200 μ M乙酰丁香酮的农杆菌菌液，放置5分钟；取出，用灭菌滤纸吸干，放到共培养培养基(配方见表2)上，在26°C黑暗条件下共培养3天，待处理；2)样品2:将受体材料玉米幼胚放到含Iml侵染培养基(配方见表I)溶液的1.5ml离心管中，一个小时后用移液器吸去侵染培养基并加入Iml新的侵染培养基，颠倒混匀I分钟，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培养基溶液，加入0.2ml新的侵染培养基溶液。将装有玉米幼胚的离心管放置在加热器(杭州博日科技有限公司，型号CHB-100)上用48° C热激5分钟；用移液器吸去侵染培养基溶液，加入Iml含200 μ M乙酰丁香酮的农杆菌菌液，放置5分钟；取出，用灭菌滤纸吸干，放到共培养培养基(配方见表2)上，在26°C黑暗条件下共培养3天，待处理；表I侵染培养基配方
权利要求
1.一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法，其特征在于，在侵染过程中对玉米幼胚先进行热激处理，再进行农杆菌侵染、共培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述热激处理温度为4(Γ50度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述热激处理温度优选为45度。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述热激处理时间为3-7分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养培养基中添加半胱氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述半胱氨酸添加量为10(T400mg/L。
7.根据权利要求6所述的方法 ，其特征在于，所述半胱氨酸浓度优选为300mg/L。
全文摘要
本发明涉及一种农杆菌侵染玉米幼胚的方法，在侵染过程中对玉米幼胚先进行热激处理，再进行农杆菌侵染、共培养。本发明提供的侵染方法通过热激处理和在共培养培养基中添加半胱氨酸，使得玉米幼胚侵染率提高到98%，大大提高农杆菌侵染玉米幼胚的侵染效率。本发明方法简单，操作方便，宜于推广使用。
文档编号C12N15/82GK103114106SQ20131002213
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者刘允军, 王国英, 刘艳 申请人:中国农业科学院作物科学研究所