专利名称：一种可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的制备与应用方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的制备与应用方法。
背景技术：
赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻类(主要原因种)、原生动物和细菌的过度繁殖或聚集造成海水变色的现象。近年来，由于人类活动的加剧，海洋日趋富营养化，导致赤潮频发，并已成为一种全球性的生态灾害，给水产养殖业、捕捞业和滨海旅游业造成了巨大损失，同时也给海洋生态环境带来负面影响，甚至直接威胁人类健康。有害赤潮在我国呈现出爆发次数增多、面积扩大、持续时间延长和危害加剧的趋势。如在2004年我国爆发赤潮的次数就达120次，特别是1998— 2000年连续3年我国的黄海、渤海和南海就发生面积达上千平方公里的特大赤潮，为世界罕见，因此，赤潮引起了公众和政府的高度重视。对赤潮原因种 进行正确鉴定是研究、认识和防治其引起的赤潮的前提和基础，同时更应建立简单、快速和特异性强的检测方法，监测赤潮高发区的水环境，对可能爆发的有害赤潮进行预警，特别是指导渔业生产者及时采取应对措施，以减少经济损失。特别是由于赤潮藻多种多样，在全世界的4000多种浮游生物中，能形成赤潮的达260多种。因此，在自然水域中多种赤潮藻常常同时存在，在水环境的日常监测中，就有必要建立一种能同时对自然水样中的多种赤潮藻进行检测的技术。当前，对自然水样中的赤潮藻的检测的传统方法，主要是以其分类学特征为基础，借助光镜和电镜对其细胞形态特征进行观察，并最终对其进行鉴定。形态鉴定法的缺点(I)赤潮藻一般个体较小，识别困难，光镜有时只能鉴定到属，而要进一步确定其具体种类，可能需要进行电镜观察，特别是当要对自然样品中的多种赤潮藻进行鉴定时，其工作繁锁且检测成本较高，难以适应日常水环境监测对大量样品的快速、准确处理的要求；(2)赤潮的发生通常是暴发性事件，自然水体中的赤潮藻在赤潮发生早期的细胞浓度较低，并与非赤潮藻混合在一起，一些常规的监测手段，如藻种采集、定性和定量记录等较为困难，因而可能延误赤潮藻的预警；(3)赤潮藻细胞的表观形态极易随生活环境和生理状态发生更改，因此其鉴定的经验依赖度高，这就使得有些赤潮微藻的鉴定成为分类学家的专长，也增加了自然海域中赤潮种源的鉴定、监控以及预警的难度。最近，分子生物学技术为赤潮藻的鉴定提供了新思路。赤潮藻的分子检测技术以藻细胞的基因组核糖体DNA (rDNA)为靶目标，其主要原因是藻类基因相对恒定，不会像其表观形态特征随环境条件的不同而发生变化。因此，其可克服形态学鉴定法的缺点，具有特异性强，检测迅速的特点。近年来，出现了大量有关赤潮藻分子检测方法，包括DNA测序、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、随机扩增多态性DNA (RAPD) (random amplified polymorphic DNA)、全细胞突光原位杂交(fluorescence insitu hybridization, FISH)、实时突光定量PCR和三明治杂交(sandwichhybridization, SHA),但这些方法都只能对自然样品中的单种赤潮藻进行检测。最近，还出现了可对自然样品中的多种赤潮藻进行并行检测的基因芯片法。 现有的分子检测方法的缺点(I)现有的分子检测技术除基因芯片技术外均只能对自然样品的单种赤潮藻进行鉴定和检测，不能对自然样品的多种赤潮藻进行检测；(2)现有芯片检测技术虽然能实现对自然样品中多种赤潮藻的并行检测，但其芯片的制备需要基因芯片点样仪，杂交需要杂交仪，杂交信号结果的判读需要荧光扫描仪，这些仪器极其昂贵，致使其检测费用较高，因而难以成为常规检测技术。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的制备与应用方法。本发明的技术方案如下一种可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的制备方法，包括以下步骤(I)种特异性探针的合成，按下表所示的序列信息合成检测探针探针信息
权利要求
1.一种可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)种特异性探针的合成，按下表所示的序列信息合成检测探针探针信息
2.根据权利要求1所述的可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的应用方法，其特征在于，包括以下步骤(1)水样的采集及藻细胞的过滤采集自然水样，混匀，用5ml—次性灭菌针头吸取检测样品，将滤膜安置于过滤器上，手推过滤；(2)洗膜及膜的剪切处理用针头吸取去离子水，将含有藻细胞的滤膜洗涤2次，将滤膜从过滤器取下，用灭菌的剪刀将其剪成碎屑，并用镊子将膜碎屑放入1. 5mL离心管中；(3)DNA粗提液的制备用枪头吸取50 - 100 μ I核酸粗提液加入到所述离心管中，IOOOrpm离心30s后，于润旋振荡器上剧烈振荡至少5min, IOOOrpm离心30s后，上清液即为 DNA 粗提液；核酸粗提液2%(m/v) CTAB, O. 5%(ν/ν) β -mercaptoethanol,1. 4MNaCl, 20mM EDTA, IOOmM Tris-Cl ；(4)多重PCR扩增反应用通用引物进行多重PCR反应制备靶核酸，PCR反应体系含 I μ I DNA 粗提液，2. 5 μ 110 XPCR buffer,1. 5μ I MgCl2 (1. 5mM)，I μ I of dNTP (0. 4mM dATP/dTTP/dCTP, 0. 38mM dCTP，0. 02mM DIG-dUTP), I μ I 正向引物 fp :5，-ACCCGCTGAATTTA AGCATA-3 ’ (O. 4mM)和 I μ I 反向引物 rp: 5 ’ -CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA-3 ’ (O. 4mM)，16. 8 μ I PCR级水，O. 2μ I (IU)Taq聚合酶；PCR反应条件为:DNA变性，94° C4min ;94。C变性 lmin， 50或55。C退火50s，72。C延伸50s，29个循环；一个末循环，72° C7min ；(5)核酸杂交将膜分类芯片放入杂交袋中，按膜的大小加入杂交液，杂交液l%(m/v) Blocking Reagent II, O. 75M NaCl, O. 075M 二水柠檬酸三钠，50 μ g/ml 鲑精 DNA，杂交液用量为O. 2ml/cm2膜分类芯片，封口混匀后，于42° C水浴中孵育2 6h ;(6)洗膜剪开杂交袋，按下列次序进行洗膜a.用2XSSC/0.l%(v/v) SDS室温洗膜 5min2 次；b.用 O. 1XSSC/0. 1%SDS42° C 洗膜 15min2 次；c.用 Buffer I 室温洗膜 2min ； d.用 Buffer II 室温洗膜 30min ；Buffer I 为:0.1M Tris, O. 15M NaCl, ρΗ7· 5 ；Buffer II 为1%(m/v)Blocking Reagent II, 0.1M Tris, 0. 15NaCl, ρΗ7· 5。(7)抗体反应剪开含探针的杂交袋一角，加入1/5000体积的碱性磷酸酶标记的DIG 抗体，在室温振荡30min ;在室温下分别用Buffer I洗膜15min2次,Buffer III洗膜2minl 次；Buffer III 为0.1M Tris, 0.1M NaCl, 0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5 ；(8)显色反应在杂交袋中按膜大小加入BufferIII，Buffer III用量0. 2ml/cm2膜分类芯片，并按8/1000 (v/v)的比例加入显色剂，封口混匀，置于暗处，显色15mirT2h，可短时间取出膜观察，勿搅动；在样品明显出现颜色而本底刚刚有所变色时，停止显色，取出膜，置于50ml水中15 30min,将膜置于滤纸上晾干，对光观察结果；(9 )结果判读参照阴性和阳性对照结果进行检测样品的判读，其中阳性对照有紫红色斑点、阴性对照无紫红色斑点；对于检测样品，如果对应点样区域有显色斑点，同阳性对照， 则表明水样中有该种赤潮藻的存在，如果对应区域无显色斑点，同阴性对照，则表 明水样中无该种赤潮藻的存在。
全文摘要
本发明公开了一种可同时检测多种赤潮藻的膜分类芯片的制备方法，包括以下步骤(1)种特异性探针的合成；(2)探针溶液的配制；(3)探针阵列的设计；(4)尼龙膜处理；(5)探针点样及膜处理。现有的基因芯片需要芯片点样仪进行制备，杂交需要芯片杂交仪，杂交信号的检测需要荧光扫描仪，这些均是昂贵的仪器，而膜分类芯片的制备只需要毛细吸管或微量移液器，杂交可在杂交袋中进行，杂交信号可直接通过肉眼观察。现有基因芯片检测属高科技技术，操作复杂，对检测人员的技术要求高，而膜分类芯片制备和应用方法简单，适宜于推广应用。该芯片能同时检测自然样品中的6种常见赤潮藻，其操作流程简单，且不需要昂贵的仪器。
文档编号C12Q1/04GK103045752SQ20131002245
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者陈国福, 张春云, 刘洋 申请人:哈尔滨工业大学(威海)