专利名称：茄子est-ssr标记的开发及应用方法
技术领域：
本发明涉及的是一种植物的育种方法，具体涉及茄子EST-SSR标记的开发方法，以及利用该标记进行茄子遗传多样性的评价、分子遗传连锁图谱的构建和茄子重要性状的QTL定位的应用方法，属于育种技术领域。
背景技术：
SSR标记，又称微卫星DNA，由串连重复的短序列组成，重复单位长度一般为1_6个bp。由于SSR标记具有多态性高、共显性、数量丰富、基因组覆盖距离广、高分辨率、易于检测及操作简单等特征，因此在遗传分析中起着重要的作用(Powell et al., 1996 ；Stagelet al.，2008)。爺子(Solanum melongena L.),属于爺科爺属，是许多国家的重要蔬菜作物。爺子含有丰富的矿物质和维生素，茄子中含有的多酚物质具有重要的抗氧化活性(Nisha etal.,2009 ；Sudheesh et al.，1999)。与茄科的两个模式作物番茄和土豆相比，茄子具有大果型和各种抗逆性；而且，茄子具有独特的系统发生特征(Fukuoka et al.，2012)。尽管茄子种植广泛且具有如此重要的价值，但是与同科作物番茄(S.lycopersicum L.)、土豆(S.tuberosum L.)、辣椒(Capsicum spp.L.)相比,它的分子生物学研究仍然比较落后(Nunome et al., 2009 ；Fukuoka et al.,2012)。目前，在茄子研究中，已经报道有一些分子遗传图谱(Barchi et al.,2010 ；Caoet al.,2006 ；Doganlar et al.,2002a ；Doganlar et al.,2002b ;Nunome et al.,2001 ；Nunome et al.,2003；Nunome et al.,2009 ；Sunseri et al.,2003 ；ffu et al.,2009)。然而，这些图谱主要是由标记RAPD(random amplified polymorphic DNA)、RFLP(restrictionfragment length polymorphism) >AFLP(amplified fragment length polymorphism)标记(Nunome et al.,2001 ；DoganIar et al.,2002b ；Nunome et al.,2003 ；Sunseri et al.,2003 ；Cao et al.,2006 ；Barchi et al.,2010)、cos II标记(constructed with conservedortholog set II) (Wu et al., 2009)和 SOL (Solanum orthologous)标记(Fukuoka etal.,2012)构建。2009年，Nunome et al.构建了一个包含236个SSR标记的连锁图，这张图谱是目前茄子研究中包含最多SSR标记的一张。此外，这些图谱的构图群体仍具有局限性。到目前为止，所有构图的种间F2群体均为S.linnaeanun^PS.melongena的杂交后代(Doganlar et al., 2002a ；DoganIar et al.,2002b ；Sunseri et al., 2003 ；ffu et al.,
2009)，其余的图谱则均为种内F2群体，其主要原因是茄子种间杂交种具有各种障碍。在爺子上，已经开发出部分SSR标记(Nunome et al., 2009 ；Stagel et al.,2008)并应用于图谱的构建(Nunome et al.，2009)。然而，在茄子种内，标记的多态性比较低，为了构建一个高密度的连锁图谱，需要开发更多的标记。目前，茄子的研究基础相比茄科其他作物一直比较薄弱，在公共数据库中能得到的序列信息比较有限。在2009年，Fukuoka等上传了大量的EST序列(Fukuoka et al.，
2010)，这大大丰富了茄子数据库，并且为开发SSR标记提供了大量的信息。
为了进一步丰富茄子SSR的标记，用于分子遗传育种，申请人根据NCBI数据库中的爺子EST序列，开发了部分EST-SSR标记,并利用开发的标记对爺子种质进行了遗传多样性、遗传图谱构建及QTL定位研究等应用。
发明内容
本发明针对目前对爺子遗传育种技术比较薄弱的不足，开发爺子EST-SSR标记的引物序列，并将其应用于茄子遗传多样性、遗传连锁图谱构建和QTL定位的研究。本发明是通过以下技术方案实现的:一种茄子EST-SSR标记的开发和应用方法，其特征在于，具体按照以下步骤完成:I)从NCBI数据库中获得EST序列，对所获得的EST序列进行处理并检测该EST序列中的SSR ；2 )设计SSR标记的弓丨物序列；3)从田间获取如表I所不的编号1-48的爺子材料和爺子F2群体的植株的嫩绿叶片，提取其总DNA ；4)用步骤2)所设计的SSR标记的引物序列扩增步骤3)中表I所示的编号1_12的茄子材料；5)获得在步骤3)中表I所示的编号7-12的茄子材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表所示；6)用步骤5)所获得的EST-SSR标记扩增步骤3)中表I所示的编号13-48的茄子材料和F2群体；7)计算每对引物的多态性信息含量并对步骤3)中表1所示的编号13-48的茄子材料进行遗传多样性的聚类分析；8)对步骤6)所获得的F2群体扩增的标记进行连锁作图和茄子果实性状的QTL定位。表I本发明所用的所有植物材料
权利要求
1.一种茄子EST-SSR标记的开发及应用方法，其特征在于，具体按照以下步骤完成: 1)从NCBI数据库中获得EST序列，对所获得的EST序列进行处理并检测该EST序列中的 SSR ； 2)设计SSR标记的引物序列； 3)从田间获取如表I所不的编号1-48的爺子材料和爺子F2群体的植株的嫩绿叶片，提取其总DNA ； 4)用步骤2)所设计的SSR标记的引物序列扩增步骤3)中表I所示的编号1-12的茄子材料； 5)获得在步骤3)中表I所示的编号7-12的茄子材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表所示； 6)用步骤5)所获得的EST-SSR标记扩增步骤3)中表I所示的编号13-48的茄子材料和F2群体； 7)计算每对引物的多态性信息含量并对步骤3)中表I所示的编号13-48的茄子材料进行遗传多样性的聚类分析； 8)对步骤6)所获得的F2群体扩增的标记进行连锁作图和茄子果实性状的QTL定位。
2.根据权利要求1所述的茄子EST-SSR标记的开发及应用方法，其特征在于，步骤3)中所述的提取总DNA的具体方法步骤如下: 1)将100-200mg所述嫩绿叶片的冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，将研磨的粉末转入2ml离心管中，加`入SOOul新鲜配制的提取缓冲液，涡旋混匀，冰浴保存IOmin, 10000rpm、4°C离心 15min,弃上清； 2)于沉淀中加入700ul65°C预热的裂解缓冲液，并用牙签搅松，涡旋混匀，65°C水浴30min ； 3)加入750ul的氯仿:异戊醇为24:1的混合液，翻转50次以上，10000rpm、4°C离心15min，将上清转入2ml的离心管中； 4)加入750ul的氯仿:异戊醇为24:1的混合液，翻转50次以上，10000rpm、4°C离心15min，将上清转入1.5ml的离心管中； 5)加0.1体积pH5.2的3M醋酸钠，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min，IOOOOrpm离心5min,弃上清液,加700ul70%乙醇洗DNA小团，10000rpm、4°C离心IOmin,倒掉上清液，通风干燥20min ； 6)加200ill的TE缓冲液4°C，30min以上溶解DNA，并保存。
全文摘要
一种茄子EST-SSR标记的开发及应用方法，步骤为1)从NCBI数据库中获得EST序列，进行处理并检测SSR；2)设计SSR标记的引物序列；3)获取表1编号1-48的茄子材料和茄子F2群体的植株嫩绿叶片，提取总DNA；4)用设计的SSR标记引物序列扩增表1编号1-12的茄子材料；5)获得表1编号7-12的茄子材料中有差异的EST-SSR标记，其序列如序列表；6)用所获EST-SSR标记扩增表1编号13-48的茄子材料和F2群体；7)计算每对引物的多态性信息含量并对表1编号13-48的茄子材料进行遗传多样性聚类分析；8)对步骤6)所获F2群体扩增标记进行连锁作图和QTL定位。结果表明G249引物与茄子果实长度及果型性状连锁，分别解释表型变异的4%和5.1%；G192引物与茄子花萼果实大小性状连锁，解释表型变异的5.3%。
文档编号C12Q1/68GK103103268SQ20131002357
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者陈火英, 葛海燕, 刘杨, 王新华 申请人:上海交通大学