专利名称：一种异麦芽酮糖的制备方法
技术领域：
本发明属于生物发酵法制备食品添加剂的技术领域，具体涉及一种异麦芽酮糖的制备方法。
背景技术：
异麦芽酮糖，又称帕拉金糖、益寿糖，是一种类似蔗糖的双糖分子，由一分子葡萄糖和一分子果糖以α-1，6-糖苷键方式形成，是蔗糖(α-1，2_)的异构物，其甜度为蔗糖的40 50wt%。它最早被发现在甘鹿、蜂蜜等产品中天然存在；1954年,它最先以鹿糖为原料转化生产成功；1957年，德国SUZUKER发表专利以活菌体P.rubrum及其酵素大量转化生产；1984年，日本新三井公司成功地开发出特殊酵素技术将其大量工业化生产。之后，由于其健康特性，在日本、欧美、台湾、韩国等国家和地区被大量应用于健康功能食品中。近年来随着生活水平的提高，人们对异麦芽酮糖的特殊功能的了解，异麦芽酮糖作为一种新型功能性食品添加剂越来越受到人们的欢迎。异麦芽酮糖具有稳定的化学结构，在口腔中不能够被微生物利用，从而防止了龋齿的产生。日本相关法规规定，食品甜味剂中异麦芽酮糖含量在70wt%以上的食品，可标注为“益牙”食品；以异麦芽酮糖为原料的食品可以给运动者获得更持久的耐力，也给长时间的脑力劳动者提供了能量供应的保障，使脑力更充沛，工作效率更高。目前，全世界有四十多个国家和地区使用异麦芽酮糖作为食品甜味剂，其产品达近千种。异麦芽酮糖的销量在欧美和日本等发达国家呈直线上升趋势。在我国，年销量也有几万吨，且需求量正日益扩大。我国对异麦芽酮糖的生产和应用研究虽有一定的进展和成就，但总的来说，异麦芽酮糖的生产、应用还处于较低的发展水平。只有极少数厂家对异麦芽酮糖进行了工业化生产，普遍存在生产成 本高、生产工艺复杂、产品质量不稳等问题，如何改善这些问题仍是国内普遍存在的难点。对国内市场的高端客户群体以及国际市场上对质量要求日渐严格的情况下，国内厂家由于生产工艺落后，产品质量不稳定，含量、颜色等多项指标无法达到很多客户群体要求的标准。目前国内生产异麦芽酮糖发酵法主要采用蔗糖为原料，使蔗糖溶液通过固定化的α -葡糖基转移酶反应柱或罐，制得含有由酶转化而成的异麦芽酮糖和其他杂糖的转化液，将所制得的转化液通入其中装有固定化酵母的去杂糖反应罐，以去除转化液中异麦芽酮糖以外的杂糖，再将去杂糖后的转化液离心去残渣后得到含异麦芽酮糖的清液。所得的转化液通过固定化酵母去掉杂糖，再将这种转化液经过脱色压滤、离子交换、浓缩、高温真空结晶、离心除去残余的杂糖及其它杂质，获得异麦芽酮糖的结晶体，这种方法杂质较多，难以分离，过程繁复，生产成本极高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种直接利用微生物转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法。其技术解决方案是:一种直接利用微生物转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤:发酵转化由产蔗糖异构酶的菌株出发，以蔗糖为原料，通过深层通风发酵转化培养，在发酵转化过程控制温度、溶解氧、转速、PH值等参数，得到含异麦芽酮糖的发酵转化液。将所得发酵转化液由絮凝剂絮凝后，经板框过滤除去菌体等杂质后脱色，得到澄清透明的过滤液。滤液经浓缩结晶、离心干燥工序得到终产品。本发明中所述的克雷伯菌(Klebsiella singaporensis),其保藏号为DSM16265,是2003年03月 06 日获赠于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH,以下简称克雷伯菌DSM16265。本发明涉及一种异麦芽酮糖的制备方法，技术方案具体的步骤如下:其包括深层通风发酵转化培养方法，所述发酵转化培养方法中使用的发酵菌种为克雷伯菌DSM16265;发酵转化培养基的组成成分及比例为:糖液12 20g，酵母浸粉0.05 0.15g，硫酸镁
0.03 0.lg，磷酸氢二钾 0.05 0.lg, 7jC IOOmL, ρΗ6.8 7.2 ;其中， 所述糖液为蔗糖、白砂糖、绵白糖、冰糖、赤砂糖中的至少一种。对于上述技术方案中，优选条件下，所述的发酵转化培养方法的条件为:发酵温度25 35°C，转速130 160转/分钟，通风量50 80m3/小时，培养4小时，停止通风，继续培养，直至发酵产物中不含有蔗糖为止。对于上述技术方案中，优选条件下，所述的发酵转化培养方法的条件为:发酵温度为28 30°C，转速为150转/分钟，通风量为50 70m3/小时。对于上述技术方案中，优选条件下,所述的发酵菌种克雷伯菌DSM16265在接种发酵转化培养基之前，先接种 种子培养基制备种子活化液，其步骤包括:用接种环从克雷伯菌DSM16265菌种斜面取3 4环菌于IOmL种子培养基中，制成菌悬液，接种1.5mL该菌悬液至250mL种子培养基中，30°C条件下150转/分钟培养活化4飞小时后得菌悬液；再将该菌悬液按3wt%接种量接至种子培养基中，在28 30°C，150转/分钟，通风量5(T70m3/小时条件下培养，直至波长在600nm处的吸光度值为0.8 1.0时，获得种子活化液；其中，所述种子培养基的组成成分及比例为:糖液2g，酵母浸粉0.15g，硫酸镁0.lg，磷酸氢二钾 0.05g，水 IOOmL, ρΗ6.8 7.2 ;所述糖液为蔗糖、白砂糖、绵白糖、冰糖、赤砂糖中的至少一种。发酵转化液中是否含有蔗糖的检测方法有很多种，本发明的实施例中列出了使用高效液相色谱法检测:在4° C、10000Xg条件下，将发酵转化液离心15分钟，取ImL上清液，用去离子水稀释15倍后，用孔径为0.2um的滤膜过滤，用高效液相色谱分析，色谱条件为:层析柱C18 (250X4.6nm)，折光指数检测器，流动相为超纯水，流速ImL/分钟。对于上述技术方案中，优选条件下，通过权利要求1所述方法获得的产物发酵转化液，还经过以下步骤处理:加絮凝剂絮凝、板框过滤、活性炭脱色过滤、双效蒸发器浓缩后梯度降温冷却结晶、离心后流化床干燥。对于上述技术方案中，优选条件下，所述的絮凝剂与发酵转化液的体积比为
1.5^2.5:100，絮凝剂为壳聚糖溶液溶液，所述的壳聚糖溶液为向1.0wt%的醋酸水溶液中添加lwt%的壳聚糖，所述的絮凝的条件为5(Γ60转/分钟条件下搅拌3(Γ40分钟。
对于上述技术方案中，优选条件下，所述的板框过滤使用的过滤介质微孔滤膜的孔径为0.8 μ m。对于上述技术方案中，优选条件下，所述的活性炭脱色过滤的条件为:活性炭添加量0.1 0.5wt%,脱色温度75 80°C，搅拌速度为50 60转/分钟，搅拌30分钟。对于上述技术方案中，优选条件下，所述的双效蒸发器浓缩的产物中的糖浓度为65 70被％;所述的降温冷却结晶的步骤为:提升双效蒸发器浓缩产物的温度至70° C，加入
0.3wt%平均粒度为IOOym的异麦芽酮糖，控制降温速度为3 7°C /小时，搅拌直至温度为 30。 C。对于上述技术方案中，优选条件下，所述的离心后流化床干燥的步骤为:离心速度2000转/分钟，将结晶异麦芽酮糖于60° C干燥，直至获得含水率为7 8wt%的异麦芽酮糖。对于本发明上文所述的技术方案中各操作步骤的工艺条件的要求解释如下:①发酵转化工序:本发明采用三级发酵，首先将糖液与营养无机盐按一定比例混合，分别配制成种子培养基及发酵转化培养基，种子培养基及发酵转化培养基中的糖液与营养无机盐比例不同，种子培养基中的糖较发酵转化培养基中的糖比例低，其原因是:种子培养基中的糖液是菌体生长过程中所需要的碳源，消耗较低，2%左右已足够其生长需要，而发酵转化培养基的糖液，除少部分用于菌体生长外，大部分都是作为转化底物而生产异麦芽酮糖的，因此需要提供比菌种活化更多的蔗糖。糖液为克雷伯菌DSM16265的转化底物，实施例中糖液以蔗糖为例，但其他可选择的多种糖还包括以蔗糖为主要成分的物质均可。利用种子培养基制备种子活化液的目的是为后续扩大培养的步骤提供大量的菌种，再将种子活化液二次接种至种子培养基中，控制风量、温度等工艺条件制备足量的种子活化液，直至种子活化液的检测600nm吸光度值为0.8 1.0时为止。种子活化液转种发酵转化培养基中，控制风量、温度等工艺条件，是为进行蔗糖异构酶生产，直至发酵转化液的检测600nm吸光度达到2.0时，停止通风，然后每隔2小时从转化罐中取样，用高效液相色谱法测定转化液中各种糖分含量，当发酵转化液中不含有蔗糖时，停罐放料。此过程中，“通风”条件可依据菌体生长情况选择，因为通风是菌体生长产酶所必不可少的条件，因此在发酵转化工序的前半段蔗糖异构酶生产时必须通风；当菌体生长产酶结束并转入蔗糖转化过程时，由于是酶催化蔗糖转化反应，不再需要通风，因此在发酵转化的后半段停止通风，且停止通风是本发明工艺的有益效果之一，因其可以降低能源消耗。絮凝过滤工序:使用絮凝罐加絮凝剂絮凝后，经过板框过滤后的滤液注入脱色罐。其目的是将菌体凝聚并降低发酵转化液的粘性，以提高板框过滤的效率。 本发明的有益技术效果是:本发明直接采用产蔗糖异构酶的 微生物作为催化剂，催化蔗糖生产异麦芽酮糖，转化效率高，不需要进行菌体或者酶的提取及固定化等工序，产物中无蔗糖残留，仅有极低的葡萄糖和果糖形成，提取纯化难度小。与其他技术相比具有工艺简单、产品质量高、废弃物少等优点。
图1为实施例1的克雷伯菌DSM16265发酵制备异麦芽酮糖的发酵曲线图；图2为实施例2的克雷伯菌DSM16265发酵制备异麦芽酮糖的发酵曲线图。本发明实施例中所用的克雷伯菌(Klebsiella singaporensis),其保藏号为DSM16265,是 2003 年 03 月 06 日获赠于 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,简称克雷伯菌 DSM16265。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施例中所述方法中涉及的溶液，如无特殊说明，均由商业途径获得或者常规方法方法配制。实施例1( I)种子活化液的制备 取4° C冰箱保藏的一支克雷伯菌DSM16265菌种斜面，用接种环从斜面中取3 4环菌于IOmL种子培养基中，制成菌悬液，接种1.5mL该菌悬液至250mL种子培养基中，共接种6瓶，30°C摇床(150转/分钟)培养活化约4.5小时。种子培养基组成为:蔗糖2g，酵母浸粉0.15g，硫酸镁0.lg，磷酸氢二钾0.05g，水IOOmL, ρΗ6.8 7.2。(2)接种发酵转化取制备好的种子活化液按3被％接种量接至含有50L种子培养基的种子罐中，控制种子罐的培养温度28 30°C，转速150转/分钟，通风量70m3/小时。培养约4小时，从种子罐中取样，测定种子活化液在波长在600nm处的吸光度值，当吸光度值为0.8 1.0时，将种子罐中的种子活化液，按5wt%接种量转种至含有500L发酵转化培养基的转化罐中，控制转化罐的培养温度为28 30°C，转速150转/分钟，通风量70m3/小时，培养4小时，停止通风，继续培养8 10小时(在此过程中，前4小时中通风使其产酶并催化转化，后8 10小时酶生产已停止，仅剩转化过程，酶催化蔗糖转化时不需要通风)，每隔2小时从转化罐中取样，用高效液相色谱法测定转化液中各种糖分含量，当发酵转化液中不含有蔗糖时，停罐放料。发酵转化培养基的组成为:蔗糖18g，酵母浸粉0.lg，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾
0.05g,水 10OmT,, pH6.8 7.2。高效液相色谱法:在4° C、10000 X g条件下，将发酵转化液离心15分钟，取ImL上清液，用去离子水稀释15倍后，用孔径为0.2um的滤膜过滤，用高效液相色谱分析，色谱条件为:层析柱C18 (250X4.6nm)，折光指数检测器，流动相为超纯水，流速ImL/分钟。(3)絮凝过滤工序量取IOOmL冰醋酸溶液，加水至10L，配成1.0wt%的醋酸溶液。称取IOOg壳聚糖于上述醋酸溶液中，充分溶胀后制成1.0wt%的壳聚糖溶液。按壳聚糖溶液与发酵转化液的体积比例为2:100的比例，将上述IOL壳聚糖溶液加入到500L发酵转化液中，搅拌速度为60转/分钟，搅拌30分钟，用板框过滤机过滤，将菌体滤除,收集滤液备用。过滤介质微孔滤膜的孔径为0.8 μ m。
(4)脱色过滤工序本实施例中使用了脱色罐脱色，加入活性炭脱色，即按0.2wt%的比例向装有发酵转化滤液的脱色罐中加入302活性炭，脱色温度为75 80°C，搅拌速度为60转/分钟，搅拌30分钟，再经板框压滤后将发酵脱色清液打入清液罐,用板框过滤机过滤,将菌体滤除，收集滤液备用。过滤介质微孔滤膜的孔径为0.8 μ m。(5)浓缩结晶工序本实施例中，清液罐中的液体使用双效降膜蒸发器浓缩过滤合格的清液，并将浓缩液转入结晶罐中，控制降温梯度进行结晶。实施例中给出了具体的控制条件，本领域技术人员也可以根据现有技术对其进行等效替换。即:采用双效降膜蒸发器，对脱色后的发酵转化液进行蒸发浓缩，控制出料浓度为65 70wt%，并将浓缩液转入结晶罐中，提升料液温度为70° C，加入0.3wt%平均粒度为IOOum的异麦芽酮糖，控制降温速度为0.1度/分钟，搅拌速度60转/分钟，降温结晶，直至结晶罐温度为30° C，转入下道工序。(6)离心干燥工序采用三足离心机，对结晶罐中的料液进行离心收集异麦芽酮糖晶体，离心速度2000转/分钟，用螺旋输送器将结晶异麦芽酮糖送入沸腾流化床连续干燥，加热温度60° C，生产出符合要求含水率为7 8wt%的异麦芽酮糖的产品，离心后的母液回收重复循环利用。包装工序:将干燥出来的终产品按照包装要求进行包装储存。(7)发酵转化罐实验数据及结果表1实施例1发酵转化数据
权利要求
1.一种异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，包括深层通风发酵转化培养方法，所述发酵转化培养方法中使用的发酵菌种为克雷伯菌(Klebsiella singaporensis)DSM16265 ;发酵转化培养基的组成成分及比例为:糖液12 20g，酵母浸粉0.05 0.15g，硫酸镁0.03 g，磷酸氢二钾 0.05 0.lg, 7jc IOOmL, ρΗ6.8 7.2 ;其中， 所述糖液为蔗糖、白砂糖、绵白糖、冰糖、赤砂糖中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵转化培养方法的条件为:发酵温度25 35°C，转速130 160转/分钟，通风量50 80m3/小时，培养4小时，停止通风，继续培养，直至发酵产物中不含有蔗糖为止。
3.根据权利要求2所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵温度为28 30°C，转速为150转/分钟，通风量为50 70m3/小时。
4.根据权利要求1所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的发酵菌种克雷伯菌DSM16265在接种发酵转化培养基之前，先接种种子培养基制备种子活化液，其步骤包括: 用接种环从克雷伯菌DSM16265菌种斜面取3 4环菌于IOmL种子培养基中，制成菌悬液，接种1.5mL该菌悬液至250mL种子培养基中，30°C条件下150转/分钟培养活化4 5小时后得菌悬液；再将该菌悬液按3wt%接种量接至种子培养基中，在28 30°C，150转/分钟，通风量5(T70m3/小时条件下培养，直至波长在600nm处的吸光度值为0.8 1.0时，获得种子活化液；其中， 所述种子培养基的组成成分及比例为:糖液2g，酵母浸粉0.15g，硫酸镁0.lg，磷酸氢二钾 0.05g,水 IO OmL, ρΗ6.8 7.2 ; 所述糖液为蔗糖、白砂糖、绵白糖、冰糖、赤砂糖中的至少一种。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，通过权利要求I所述方法获得的产物发酵转化液，还经过以下步骤处理:加絮凝剂絮凝、板框过滤、活性炭脱色过滤、双效蒸发器浓缩后梯度降温冷却结晶、离心后流化床干燥。
6.根据权利要求5所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的絮凝剂为壳聚糖溶液，壳聚糖溶液与发酵转化液的体积比为1.5 2.5:100，所述的壳聚糖溶液为向1.0wt%的醋酸水溶液中添加lwt%的壳聚糖,所述的絮凝的条件为5(Γ60转/分钟条件下搅拌30 40分钟。
7.根据权利要求6所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的板框过滤使用的过滤介质微孔滤膜的孔径为0.8 μ m。
8.根据权利要求5所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的活性炭脱色过滤的条件为:活性炭添加量0.1 0.5wt%,脱色温度75 80°C，搅拌速度为50 60转/分钟，搅拌3(Γ40分钟。
9.根据权利要求5所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的双效蒸发器浓缩的产物中的糖浓度为65 70wt% ;所述的降温冷却结晶的步骤为:提升双效蒸发器浓缩产物的温度至70° C，加入0.3wt%平均粒度为IOOum的异麦芽酮糖，控制降温速度为3 7V /小时，搅拌直至温度为30° C。
10.根据权利要求5所述的异麦芽酮糖的制备方法，其特征在于，所述的离心后流化床干燥的步骤为:离心速度2000转/分钟，将结晶异麦芽酮糖于60° C干燥，直至获得含水率为7 8wt%的异麦芽 酮糖。
全文摘要
本发明公开一种直接利用微生物发酵转化蔗糖生产异麦芽酮糖的方法，其包括以下步骤以蔗糖为主要成分的原料，采用产蔗糖异构酶生产菌株克雷伯菌DSM16265通过深层通风发酵转化培养，在发酵转化过程控制温度、通风量、转速、pH值等参数，将所得发酵转化液由絮凝剂絮凝，再经板框过滤除去菌体等杂质后脱色，得到澄清的过滤液。滤液经浓缩结晶、离心干燥工序得到终产品。本发明直接采用克雷伯菌DSM16265为催化剂，催化蔗糖生产异麦芽酮糖，无需进行菌体或酶的提取及固定化等。与现有技术相比具有工艺简单、产品质量高、废弃物少等优点。同时，生产全程采用自动化监控，自动化程度高，控制参数稳定可靠，劳动强度小，产品质量稳定。
文档编号C12P19/24GK103103232SQ20131002382
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月22日 优先权日2013年1月22日
发明者李宪臻 申请人:大连工业大学