专利名称：一种人羊膜的脱细胞方法
技术领域：
本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种人羊膜的脱细胞方法。
背景技术：
脱细胞技术是指通过一系列方法处理人和动物的组织和/或器官，使该组织和/或器官的细胞完全去除，而保留相应的细胞外基质的方法。它在组织工程支架的构建中起着重要的作用。羊膜，即人胎盘粘膜，是一光滑的、无血管、神经及淋巴的、具有弹性的半透明膜，厚约0.02、.5mm,由单层上皮细胞层、致密的基底膜以及无血管的基质等成份组成。羊膜基质中含有大量的胶原、纤粘连蛋白和层粘连蛋白等成份，是一种廉价易得、性能优良的组织工程支架材料。但将其作为一种切实可用的支架材料应用于组织构建的主要问题在于要克服其内在细胞所带来的免疫原性。目前对羊膜组织的脱细胞处理的方法，主要在于采用表面活性剂或表面活性剂结合机械力刮除等，这些方法无法完整地保留羊膜细胞外基质，对羊膜基质的力学和化学等性能均有不同程度的损伤，而且脱细胞效率比较低，适用范围比较窄。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效脱细胞的同时可完整地保留细胞外基质的人羊膜的脱细胞方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种人羊膜的脱细胞方法，包括以下具体过程:
(1)、将新鲜的人胎盘羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，并以PH值为7.4的磷酸缓冲液(简称PBS)清洗，得到一干净半透明的羊膜；
(2)、取体积浓度为75%的酒精将上述得到的半透明羊膜漂洗I 2次，再用PBS漂洗2 4次,然后将青霉素和链霉素混合到PBS中形成双抗/PBS溶液，所述的青霉素和链霉素又叫双抗，其中青霉素与链霉素在PBS中的含量均为100 300U/L，再将半透明羊膜按体积比为1:1 3的比例置于双抗/PBS溶液中浸泡震荡，每12小时换液一次，共两次；
(3)、将双抗、表面活性剂混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中:青霉素与链霉素在PBS中的含量均为100 300U/L，表面活性剂占PBS的重量比为1%，并将半透明羊膜按体积比为1:1 3的比例置于综合PBS溶液中浸泡震荡，每6 8小时换液一次，共两次，然后将半透明羊膜取出，用PBS漂洗I 2次；
(4)、将半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量为500 5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜与胰脂酶/PBS溶液的体积比为1:1 3，并在溶液温度为30 40°C下处理10 20小时，然后将半透明羊膜取出用PBS漂洗I 2次，再将半透明羊膜浸泡在DNA酶(又叫脱氧核糖核酸酶)含量为1000 3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜与DNA酶/PBS溶液的体积比为1:1 3，在溶液温度为30 40°C下处理3 5小时；(5)、将半透明羊膜从DNA酶/PBS溶液中取出，并将半透明羊膜置于青霉素与链霉素含量均为100 300U/L的双抗/PBS溶液中震荡漂洗，每12小时换液一次，共两次，最后将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的温度下保存待用。所述的表面活性剂采用Triton X-100 (曲拉通100)。与现有技术相比，本发明的优点在于该方法采用表面活性剂结合胰脂酶和DNA酶共同来脱除羊膜中的细胞，脂类是细胞膜的主要成份，DNA存在于细胞核中，是遗传信息的携带者，胰脂酶和DNA酶能针对性地分别降解细胞膜和细胞核中的DNA，将二者结合起来使用可以促使羊膜中的细胞被高效彻底地脱去，同时最大程度地保留细胞外基质，使其不受损伤。另一方面，本发明针对真核细胞共同具有的结构成份进行处理，因此本发明适用于任何真核细胞的脱除，其使用具有普适性。
具体实施例方式以下对本发明作进一步详细描述。实施例一:一种人羊膜的脱细胞方法，包括以下具体过程:
(1)、将新鲜的人胎盘羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，并以PH值为7.4的磷酸缓冲液(简称PBS)清洗，得到一干净半透明的羊膜；
(2)、取体积浓度为75%的酒精将上述得到的半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗2次，然后将青霉素和链霉素混合到PBS中形成双抗/PBS溶液，其中青霉素与链霉素在PBS中的含量均为100U/L，再将半透明羊膜按体积比为1:1的比例置于双抗/PBS溶液中浸泡震荡，每12小时换液一次，共两次；
(3)、将双抗、表面活性剂混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中:青霉素与链霉素在PBS中的含量均为100U/L，表面活性剂占PBS的重量比为1%，并将半透明羊膜按体积比为1:1的比例置于综合PBS溶液中浸泡震荡，每6小时换液一次，共两次，然后将半透明羊膜取出，用PBS漂洗2次；
(4)、将半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量为1000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜与胰脂酶/PBS溶液的体积比为1:2，并在溶液温度为30°C下处理20小时，然后将半透明羊膜取出用PBS漂洗I次，再将半透明羊膜浸泡在DNA酶含量为1000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜与DNA酶/PBS溶液的体积比为1: 2，在溶液温度为40°C下处理3小时；
(5)、将半透明羊膜从DNA酶/PBS溶液中取出，并将半透明羊膜置于青霉素与链霉素含量均为100U/L的双抗/PBS溶液中震荡漂洗，每12小时换液一次，共两次，最后将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的温度下保存待用。实施例二:一种人羊膜的脱细胞方法，包括以下具体过程:
(1)、将新鲜的人胎盘羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，并以PH值为7.4的磷酸缓冲液(简称PBS)清洗，得到一干净半透明的羊膜；
(2)、取体积浓度为75%的酒精将上述得到的半透明羊膜漂洗I次，再用PBS漂洗4次，然后将青霉素和链霉素混合到PBS中形成双抗/PBS溶液，其中青霉素与链霉素在PBS中的含量均为200U/L，再将半透明羊膜按体积比为1:3的比例置于双抗/PBS溶液中浸泡震荡，每12小时换液一次，共两次；
(3)、将双抗、表面活性剂混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中:青霉素与链霉素在PBS中的含量均为300U/L，表面活性剂占PBS的重量比为1%，并将半透明羊膜按体积比为1:2的比例置于综合PBS溶液中浸泡震荡，每7小时换液一次，共两次，然后将半透明羊膜取出，用PBS漂洗I次；
(4)、将半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量为3000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜与胰脂酶/PBS溶液的体积比为1:1，并在溶液温度为35°C下处理15小时，然后将半透明羊膜取出用PBS漂洗2次，再将半透明羊膜浸泡在DNA酶含量为2000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜与DNA酶/PBS溶液的体积比为1:3，在溶液温度为30°C下处理5小时；
(5)、将半透明羊膜从DNA酶/PBS溶液中取出，并将半透明羊膜置于青霉素与链霉素含量均为200U/L的双抗/PBS溶液中震荡漂洗，每12小时换液一次，共两次，最后将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的温度下保存待用。实施例三:一种人羊膜的脱细胞方法，包括以下具体过程:
(1)、将新鲜的人胎盘羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，并以PH值为7.4的磷酸缓冲液(简称PBS)清洗，得到一干净半透明的羊膜；
(2)、取体积浓度为75%的酒精将上述得到的半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗3次，然后将青霉素和链霉素混合到PBS中形成双抗/PBS溶液，其中青霉素与链霉素在PBS中的含量均为300U/L，再将半透明羊膜按体积比为1:2的比例置于双抗/PBS溶液中浸泡震荡，每12小时换液一次，共两次；
(3)、将双抗、表面活性剂混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中:青霉素与链霉素在PBS中的含量均为200U/L，表面活性剂占PBS的重量比为1%，并将半透明羊膜按体积比为1:3的比例置于综合PBS溶液中浸泡震荡，每8小时换液一次，共两次，然后将半透明羊膜取出，用PBS漂洗2次；
(4)、将半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量为5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜与胰脂酶/PBS溶液的体积比为1:3，并在溶液温度为40°C下处理10小时，然后将半透明羊膜取出用PBS漂洗2次，再将半透明羊膜浸泡在DNA酶含量为3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜与DNA酶/PBS溶液的体积比为1:1，在溶液温度为35°C下处理4小时；
(5)、将半透明羊膜从DNA酶/PBS溶液中取出，并将半透明羊膜置于青霉素与链霉素含量均为300U/L的双抗/PBS溶液中震荡漂洗，每12小时换液一次，共两次，最后将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的温度下保存待用。上述实施例中，所用到的PBS (又叫磷酸缓冲液)的pH值均为7.4，表面活性剂采用北京中杉金桥生物技术有限公司提供 的Triton X-100。
权利要求
1.一种人羊膜的脱细胞方法，其特征在于包括以下具体过程: (1)、将新鲜的人胎盘羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，并以PH值为7.4的磷酸缓冲液(简称PBS)清洗，得到一干净半透明的羊膜； (2)、取体积浓度为75%的酒精将上述得到的半透明羊膜漂洗1 2次，再用PBS漂洗2 4次,然后将青霉素和链霉素混合到PBS中形成双抗/PBS溶液，所述的青霉素和链霉素又叫双抗，其中青霉素与链霉素在PBS中的含量均为100 300U/L，再将半透明羊膜按体积比为1:1 3的比例置于双抗/PBS溶液中浸泡震荡，每12小时换液一次，共两次； (3)、将双抗、表面活性剂混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中:青霉素与链霉素在PBS中的含量均为100 300U/L，表面活性剂占PBS的重量比为1%，并将半透明羊膜按体积比为1:1 3的比例置于综合PBS溶液中浸泡震荡，每6 8小时换液一次，共两次，然后将半透明羊膜取出，用PBS漂洗1 2次； (4)、将半透明羊膜浸泡在胰脂酶含量为500 5000U/L的胰脂酶/PBS溶液中，半透明羊膜与胰脂酶/PBS溶液的体积比为1:1 3，并在溶液温度为30 40°C下处理10 20小时，然后将半透明羊膜取出用PBS漂洗1 2次，再将半透明羊膜浸泡在DNA酶含量为1000 3000U/L的DNA酶/PBS溶液中，半透明羊膜与DNA酶/PBS溶液的体积比为1:1 3，在溶液温度为30 40°C下处理3 5小时； (5)、将半透明羊膜从DNA酶/PBS溶液中取出，并将半透明羊膜置于青霉素与链霉素含量均为100 300U/L的双抗/PBS溶液中震荡漂洗，每12小时换液一次，共两次，最后将脱细胞后的半透明羊膜取出放到PBS中，在4°C的温度下保存待用。
2.如权利要求1所述的一种人羊膜的脱细胞方法，其特征在于所述的表面活性剂采用Triton X-1OO。
全文摘要
本发明公开了一种人羊膜的脱细胞方法，特点是先得到干净的半透明羊膜，然后用PBS漂洗半透明羊膜，再将半透明羊膜置于综合PBS溶液中浸泡震荡，取出羊膜后用PBS漂洗，再将羊膜先后浸泡在胰脂酶/PBS溶液和DNA酶/PBS溶液中处理，最后用双抗/PBS溶液漂洗羊膜，最后将脱细胞后的羊膜取出放到PBS中保存待用；优点在于该方法采用表面活性剂结合胰脂酶和DNA酶共同来脱除羊膜中的细胞，将二者结合起来使用可以促使羊膜中的细胞被高效彻底地脱去，同时最大程度地保留细胞外基质，使其不受损伤。
文档编号C12N5/071GK103114073SQ201310023898
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者竺亚斌, 史佩娜, 沈秋霞, 高梦娜, 卢珍珍 申请人:宁波大学