R112w型酮胺氧化酶及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种R112W型酮胺氧化酶及其编码基因和应用。本发明提供的R112W型酮胺氧化酶，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列3自N末端第1至438位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）由序列表中序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白质。与现有的酮胺氧化酶相比，本发明提供的R112W型酮胺氧化酶的酶活性大大提高，具有重大的应用价值。
【专利说明】R112W型酮胺氧化酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种R112W型酮胺氧化酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]美拉德反应，又称为非酶催化糖基化反应，是一类自然界常见的反应。还原糖(最常见的是葡萄糖)与氨基化合物在常温或是高温下发生反应，生成Amadori产物，并进一步交联得到高级糖基化终产物以及类黑素类物质。该反应在食品的加工和储存过程中发挥着重要的作用，对食品的色泽，风味和营养成分等都有重要的影响。近年来的研究发现，在生物体内也存在美拉德反应，反应的产物与人类的衰老，糖尿病并发症等病症有密切的关系，从而受到广泛的关注。
[0003]酮胺氧化酶(fructosyl amine oxidases,缩写为FAOXs)是一类存在于微生物体内的去糖基化酶，可以催化降解Amadori产物，通常生成氨基化合物、葡糖醛酮和过氧化氢。在该酶发现之初，最先应用于糖尿病的检测，目前基于FAOXs的检测已经成为糖尿病检测和诊断中的一项“金指标”。同时，这类蛋白酶在食品质量控制，洗涤剂添加剂以及糖尿病治疗等方面也展现出了巨大的应用前景。但是，目前已知的酮胺氧化酶都只能作用于小分子底物，如糖基化氨基酸或是糖基化二肽，这也极大地限制了该酶的应用。
[0004]来源于烟曲霉Aspergillusfumiga tus 的酮胺氧化酶 Amadoriase II于1997年首次被分离，可以直接作用于一种较大分子量的底物糖基化金刚烷胺(fructosyl-adamantanamine)。该酶的晶体结构在2008年被报道，晶体结构显示，在该酶表面有两个柔性的Loop区域(氨基酸残基序列自N末端第58-66位的残基区域以及第110-119位的残基区域)，位于底物通道入口附近，在底物结合过程起到重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种R112W型酮胺氧化酶及其编码基因和应用。
[0006]本发明提供的R112W型酮胺氧化酶，是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列3自N末端第I至438位氨基酸残基组成的蛋白质；
[0008](b)由序列表中序列3所示的氨基酸残基组成的蛋白质。
[0009]编码所述R112W型酮胺氧化酶的基因也属于本发明的保护范围。
[0010]所述基因为可如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子:
[0011]I)编码区如序列表中序列4自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；
[0012]2)编码区如序列表中序列4自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；
[0013]3)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子；
[0014]4)在严格条件下与I)或2)或3限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子;
[0015]5)与I)或2)或3限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。[0016]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I XSSC,0.1%SDS 各洗膜一次。
[0017]含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0018]可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0019]所述的重组载体具体可为将所述基因插入pEAS-la质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
[0020]所述重组菌具体可为将所述重组载体导入大肠杆菌BL21得到的重组菌。
[0021]本发明还保护所述蛋白质在制备酮胺氧化酶中的应用。
[0022]本发明还保护所述蛋白质在降解糖基化底物中的应用。所述糖基化底物具体可为糖基化多聚赖氨酸或糖基化金刚烷胺。
[0023]本发明还保护所 述重组菌在生产所述蛋白质中的应用。
[0024]应用所述重组菌制备所述蛋白质时，可采用如下方法:将所述重组菌进行发酵，收集发酵产物，发酵产物中即含有所述蛋白质。
[0025]所述方法具体包括如下步骤:
[0026](I)将所述重组菌培养至OD6tltlnm为0.5时加入IPTG并使其浓度为0.5mM,继续30°C、250rpm培养6小时，收集菌体；
[0027](2)将步骤(1)得到的菌体进行超声破碎，收集上清液；
[0028](3)将步骤(2)得到的上清液上样于结合Ni2+的HiTrapTM Chelating HP柱，先用洗脱液甲(含500mM氯化钠和30mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)去除杂蛋白，然后用洗脱液乙(含500mM氯化钠和400mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)洗脱目的蛋白，收集洗脱液乙的过柱后溶液，即为含有所述蛋白质的溶液。
[0029]本发明还保护所述蛋白质作为酮胺氧化酶的应用。
[0030]与现有的酮胺氧化酶相比，本发明提供的R112W型酮胺氧化酶的酶活性大大提高，具有重大的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为重组质粒pEAS-la-CT-AMAII的结构示意图。
【具体实施方式】
[0032]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0033]pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB 质粒，简称 pEAS-la 质粒，是一种热诱导自裂解质粒。提及pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB质粒的参考文献:Xu，L.，etal., Heat-1nducibleautoIytic vector for high—throughput screening.BioTechniques，2006.41(3):p.319-322.。
[0034]大肠杆菌BL21:购自 Novagen。
[0035]野生型酮胺氧化酶Amadoriase II由序列表的序列I自N末端第I至438位氨基酸残基组成。野生型酮胺氧化酶Amadoriase II基因的编码区如序列表的序列2自5’末端第I至1314位核苷酸所示。
[0036]实施例1、重组质粒的构建
[0037]一、重组质粒 pEAS-la-CT-AMAII 的构建
[0038]1、合成序列表的序列2自5’末端第I至1314位核苷酸所示的双链DNA分子。
[0039]2、将步骤I合成的双链DNA分子作为模板，用AMA-for和CT_AMA-rev组成的引物对，采用高保真的Deep Venti DNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0040]AMA-for:5’ -AGAGGGATCCGATGGCGGTAACCAAGTCA-3，(其中下划线部分为 BamHI 内切酶识别位点)；
[0041]CT-AMA-rev:
[0042]5，-ATTC CTGCAGT t a JgtggtggtggtggtggtgIggaagcagctcc
TAACTTGGAAATATCTC-3’(其中下划线部分为Pst I内切酶识别位点，方框内是His6标签的编码序列，粗体表示连接肽)。
[0043]3、用限制性内切酶BamH I和Pst I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0044]4、用限制性内切酶BamHI和Pst I双酶切pEAS_la质粒，回收约5400bp的载体骨架。
[0045]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒
[0046]pEAS-la-CT-AMAII (野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII基因的表达载体)。根据测序结果，对重组质粒pEAS-la-CT-AMAII进行结构描述如下:在pEAS-la质粒的BamHI和PstI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。重组质粒
[0047]pEAS-la-CT-AMAII的结构示意图见图1。
[0048]二、重组质粒 pEAS-la-CT-AMAII (R112W)的构建
[0049]1、以重组质粒pEAS-la-CT-AMAII为模板，用ΕΡ-for和R112W_rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0050]EP-for:5’-TTA CGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3’ ；
[0051 ] R112ff-rev:5’ -CTCACCGGGCCTGACCCAGACTCCAAGGCGGTCCA-3’。
[0052]2、以重组质粒pEAS-la-CT-AMAII为模板，用R112W_for和EP-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0053]R112ff~for:5’ -GACCGCCTTGGAGTCTGGGTCAGGCCCGGTGAGG-3’ ；
[0054]EP-rev:5’-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3’。
[0055]3、同时将步骤I的PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物作为模板，用EP-for和EP-rev组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0056]EP-for和ΕΡ-rev分别对应于重组质粒pEAS-la-CT-AMAII中序列2所示双链DNA分子的上游和下游。
[0057]4、用限制性内切酶BamH I和Pst I双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0058]5、用限制性内切酶BamHI和Pst I双酶切pEAS_la质粒，回收约5400bp的载体骨架。
[0059]6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W)。根据测序结果，对重组质粒pEAS-la-CT-AMAI I (R112W)进行结构描述如下:在pEAS-la质粒的BamH I和Pst I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子。与序列表的序列2相比，序列表的序列4的差异仅在于将序列表的序列2所示双链DNA分子自5’末端第334-336位核苷酸由“cgt”突变为了“TGG”。序列表的序列4所示的DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质。与序列表的序列I相比，序列表的序列3的差异仅在于将序列表的序列I自N末端第112位氨基酸残基由“R”突变为了 “W”。将序列表的序列3自N末端第I至438位氨基酸残基组成的蛋白质命名为R112W型酮胺氧化酶Amadoriase II。
[0060]实施例2、野生型酮胺氧化酶Amadoriase II和Rl 12W型酮胺氧化酶AmadoriaseII的制备
[0061]一、野生型酮胺氧化酶Amadoriase II的制备
[0062]1、将重组质粒pEAS-la-CT-AMAII导入大肠杆菌BL21，得到重组菌。
[0063]2、将步骤I得到的重组菌的单菌落接种于15ml含50 μ g/ml氨苄西林的LB液体培养基，30°C、250rpm过夜培养。
[0064]3、将步骤2得到的培养体系以1:40的体积比接种于400ml含有50 μ g/ml氨苄西林的LB液体培养基；30°C、250rpm培养至OD6tltlnm为0.5时加入IPTG并使其浓度为0.5mM,继续30°C、250rpm培养；从加入IPTG开始计时，6小时后收集菌体。
[0065]4、将步骤3得到的菌体进行超声破碎(超声破碎功率200W，超声4秒停3秒，共99次)，然后15000rpm离心25min,收集上清液。
[0066]5、用0.22 μ m低蛋白质结合的滤膜过滤步骤4得到的上清液，收集滤液。
[0067]6、取步骤5得到的滤液,利用蛋白纯化设备(:AKTA explorerTM station),上样至已结合 Ni2+的 HiTrapTM Chelating HP 柱(购自安玛西亚(Amersham Biosciences,体积lmL)，先用15ml洗脱液甲(含500mM氯化钠和30mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲液，pH7.4)去除杂蛋白，然后用3ml洗脱液乙(含500mM氯化钠和400mM咪唑的20mM磷酸钠缓冲液，PH7.4)洗脱目的蛋白，收集洗脱液乙的过柱后溶液，即为蛋白液甲(含有野生型酮胺氧化酶Amadoriase II和His标签的融合蛋白)。
[0068]二、Rl 12W型酮胺氧化酶Amadoriase II的制备
[0069]用重组质粒pEAS-la-CT-AMAI I (R112W)代替重组质粒 pEAS-la-CT-AMAI I,其它同步骤一，收集洗脱液乙的过柱后溶液，即为蛋白液乙(含有R112W型酮胺氧化酶Amadoriase II和His标签的融合蛋白)。
[0070]实施例3、野生型酮胺氧化酶Amadoriase II和Rl 12W型酮胺氧化酶AmadoriaseII的酶活[0071]一、糖基化模式底物的制备
[0072]1、糖基化多聚赖氨酸的制备
[0073]按照摩尔比5:6称取多聚赖氨酸混合物(购自Sigma-Aldrich,产品目录号为P8954-500MG ;每个聚赖氨酸分子含有3_13个赖氨酸)和葡萄糖，加入200mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)中，葡萄糖的终浓度为0.75M，混合均匀后60°C水浴6小时，得到糖基化产物(含有糖基化多聚赖氨酸)。
[0074]2、糖基化金刚烷胺的制备
[0075]按照摩尔比5:6称取金刚烷胺(购自Sigma-Aldrich，产品目录号为A1260-5G)和葡萄糖，加入水中，葡萄糖的终浓度为0.75M，通过滴加IM的氢氧化钠溶液促使金刚烷胺溶解，混合均匀后121°C反应15分钟，得到糖基化金刚烷胺。
[0076]二、野生型酮胺氧化酶Amadoriase II和R112W型酮胺氧化酶Amadoriase II的酶活测定
[0077]1、制备反应液
[0078]取2.7个红掊酹单位(purpurogallin unit)的辣根过氧化物酶,0.45mM的4-氨基安替比林,0.5mM的N-乙基-N-(2-羟基_3_磺丙基)-m_甲苯胺(N_ethy 1_N_(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine)和100 μ I糖基化底物(即步骤一的I得到的体系或步骤一的2的得到的体系)，溶于3mlIOOmM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)。
[0079]2、制备蛋白 稀释液
[0080]用IOOmM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)将实施例2制备的蛋白液甲稀释至50倍体积，得到蛋白稀释液甲。
[0081]用IOOmM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)将实施例2制备的蛋白液乙稀释至50倍体积，得到蛋白稀释液乙。
[0082]3、蛋白浓度测定
[0083]分别检测蛋白稀释液甲和蛋白稀释液乙中的蛋白浓度，具体方法如下:
[0084]检测280nm处的光吸收值，然后按照下式计算:
[0085]蛋白浓度(mg/ml)=A280/( ε Xb)；
[0086]A280一蛋白稀释液在280nm处的光吸收值；b—光程，cm ； ε 一消光系数。
[0087]消光系数，可按照下式计算:
5700nTr_ +1300nTvr
[0088]ε =--—
Mw
[0089]nftp—蛋白中色氨酸残基的个数；
[0090]—蛋白中酪氨酸残基的个数
[0091]Mw一蛋白分子量。
[0092]蛋白稀释液甲的蛋白浓度为0.247mg/ml。蛋白稀释液乙的蛋白浓度为0.133mg/ml ο
[0093]4、野生型酮胺氧化酶Amadoriase II和Rl 12W型酮胺氧化酶AmadoriaseII的酶活测定
[0094](I)对于糖基化金刚烷胺的酶活
[0095]将2μ I蛋白稀释液甲(或蛋白稀释液乙)与50 μ I步骤I得到的反应液混匀，用酶标仪检测在37°C条件下，混合液在555nm处吸光光度值随时间的变化。
[0096]通过吸光度计算酶活的机理为:酮胺氧化酶Amadoriase II糖基化底物生成等摩尔比的葡糖醛酮和过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化物酶的催化下与4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺发生反应，每两分子的过氧化氢参加反应可以生成一分子在555nm处有特异吸收的醌类染料。
[0097]醌染料生成速率(μmo I.cnT3.mirT1) =A555/ ( ε Xb)
[0098]A555-反应体系在555nm处的吸光度值随时间变化的曲线，线性部分的斜率，mirT1 ；
[0099]ε —消光系数，对于本反应中生成的醌染料，消光系数为39.2cm2/ μ mo I; b—光矛王? cm ο
[0100]一个酶活性单位定义为在上述反应条件下，Imin内催化生成0.5 μ mo I醌类物质(即I μ mol过氧化氢)所需要的酶量。
[0101]蛋白稀释液甲的酶活为0.124U/ml。蛋白稀释液乙的酶活为0.791U/ml。
[0102](2)对于糖基化多聚赖氨酸的酶活
[0103]将10 μ I蛋白稀释液甲(或蛋白稀释液乙)与30 μ I步骤一得到的反应液混匀，用酶标仪检测在37°C条件下，混合液在555nm处吸光光度值随时间的变化。
[0104]通过吸光度计算酶活的机理和酶活计算方法同步骤(1)。
[0105]蛋白稀释液甲的酶活为1.48mU/ml。蛋白稀释液乙的酶活为2.07mU/ml。
[0106]5、根据步骤3和步骤4的结果,计算野生型酮胺氧化酶Amadoriase II和R112W型酮胺氧化酶Amadoriase II的酶活。
[0107]野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII对底物糖基化金刚烧胺的酶活为0.5U/mg。Rl 12W型酮胺氧化酶 Amadoriase II对底物糖基化金刚烷胺的酶活与野生型酮胺氧化酶Amadoriase II对底物糖基化金刚烷胺的酶活的比值为11.9±1.1。
[0108]野生型酮胺氧化酶Amadoriase II对底物糖基化多聚赖氨酸的酶活为6.0mU/mg。Rl 12W型酮胺氧化酶Amadoriase II对底物糖基化多聚赖氨酸的酶活与野生型酮胺氧化酶Amadoriase II对底物糖基化多聚赖氨酸的酶活的比值为2.6±0.1。
【权利要求】
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列3自N末端第I至438位氨基酸残基组成的蛋白质； (b)由序列表中序列3所不的氣基酸残基组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因为如下I)或2)或3)或4)或5)的DNA分子: 1)编码区如序列表中序列4自5’末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 2)编码区如序列表中序列4自5’末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 3)编码区如序列表中序列4所示的DNA分子； 4)在严格条件下与1)或2)或3限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； 5)与1)或2)或3限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2 或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求2或3所述基因插入pEAS-la质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于:所述重组菌为将权利要求5所述的重组质粒导入大肠杆菌BL21得到的重组菌。
7.权利要求1所述蛋白质在制备酮胺氧化酶中的应用。
8.权利要求1所述蛋白质在降解糖基化底物中的应用。
9.权利要求6所述重组菌在生产权利要求1所述蛋白质中的应用。
10.权利要求1所述蛋白质作为酮胺氧化酶的应用。
【文档编号】C12N15/53GK103937763SQ201310025988
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月22日 优先权日:2013年1月22日
【发明者】林章凛, 钱昱, 郑静 申请人:清华大学