专利名称：一种醛脱氢酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种醛脱氢酶，尤其是涉及来源于深海的太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica) H2的新型醒脱氢酶基因,及其重组表达所得到的醒脱氢酶及其制备方法。
背景技术：
醒脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase) (ECL 21.3)是能够催化内源和外源醒氧化的NAD(P)+依赖型的酶超家族。迄今为止，已经从人类发现了 19种醛脱氢酶基因，这些基因参与内生和外生乙醒的代谢(Crabb, Matsumoto, Chang, &You, 2004)。研究者发现，醛脱氢酶在植物及微生物抗环境压力(干旱，高盐)方面也具有重要的作用(Huang et al.,2008; Li, Gao, Yu, Wang, Mn, 2003), Yang 等(Yang, Zhang, Wang, Wood, &Zhang, 2012)将齿肋赤藓中的醛脱氢酶基因转化到大肠杆菌中，转化菌得到重组菌也具有抗干旱和高盐的倉泛力。Tomohisa kato 等(Kato, Miyanaga, Kanaya, &Morikawa, 2010)从 Geobacillusthermoleovorans B23得到了能够降解长链链烧的醒脱氢酶基因,Jyumpei Kokayashi等从Rhodobacter sphaeroides可以在低浓度醋酸盐中提高氢产量的醒脱氢酶。在专利方面,不同来源的醛脱氢酶基因已经被克隆、测序和表达，主要应用于利用L-山梨糖酮生产维生素C或2-KGA，解酒的保健品等。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种新型醛脱氢酶基因fwaldh。本发明的第二目的是提供一种由所述醛脱氢酶基因fwaldh编码的醛脱氢酶Fwaldh。
本发明的第三目的是提供醛脱氢酶Fwaldh的制备方法。所述醒脱氢酶Fwaldh的生产菌株为太平洋火色杆菌(Flammeovirga Pacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为=CCTCCN0:M2012229，地址为武汉，武汉大学，邮编430072。所述新型醛脱氢酶基因fwaldh的序列(SEQ ID N0.1)如下:
atggaaaatg taattattac ttctgatcag ascgttcaaa atattgaaga tatattcatt60
权利要求
1.醒脱氢酶Fwaldh的生产菌株为太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2,该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC NO:M2012229。
2.醛脱氢酶基因fwaldh的序列(SEQID N0.1)如下:
3.醛脱氢酶基因fwaldh编码的醛脱氢酶Fwaldh的氨基酸序列(SEQID N0.2)如下:
4.醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)克隆所述醛脱氢酶基因fwaldh； 2)将所述醛脱氢酶基因fwaldh插入表达载体，构建携带所述醛脱氢酶基因fwaldh的重组表达载体； 3)将所述重组表达载体转化到E.coli BL21中； 4)选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养； 5)离心收集发酵后的E.coli BL21细胞，重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解； 6)将步骤5)中裂解后的悬液进行离心，收集上清液； 7)将上清液与N1-NTAAgarose混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述醛脱氢酶 Fwaldh0
5.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述表达载体为PET-His载体。
6.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述培养基为含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基。
7.如权利要求6所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于所述培养基，当诱导时补加100 μ g/mL氨苄青霉素。
8.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述发酵条件为:37°C下振荡培养至4_ = 0.6，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为.50 μ g/mL,并添加0.2%葡萄糖,而后于28°C诱导至A6tltl = 0.8,再改至在16°C诱导至A6tltl =.1.2。
9.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述裂解缓冲液配方为:0.3mol/L NaCl，IOmmoI/L 咪唑，50mmol/L NaH2PO4, pH 8.0。
10.如权利要求4所述醛脱氢酶Fwaldh的制备方法，其特征在于在步骤6)中，所述离心的条件为18000g,离心20min。
全文摘要
一种醛脱氢酶及其制备方法，涉及一种醛脱氢酶。所述醛脱氢酶Fwaldh的生产菌株为太平洋火色杆菌H2。克隆所述醛脱氢酶基因fwaldh；将所述醛脱氢酶基因fwaldh插入表达载体，构建携带所述醛脱氢酶基因fwaldh的重组表达载体；将所述重组表达载体转化到E.coli BL21中；选取转化后E.coli BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；离心收集发酵后的E.coli BL21细胞，重悬所述E.coli BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解；将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；将上清液与Ni-NTA Agarose混匀，按照纯化试剂盒说明书进行纯化，得所述醛脱氢酶Fwaldh。
文档编号C12R1/01GK103114056SQ201310026030
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者曾润颖, 刘洋, 丁志新 申请人:国家海洋局第三海洋研究所