具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法

专利名称：具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法
具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法本申请是申请日为2007年5月30日、发明名称为“具有增强的产量相关性状的伸展蛋白受体样激酶受调节表达的植物和用于产生该植物的方法”的中国专利申请200780028066.X(国际申请号 PCT/EP2007/055238)的分案申请。本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码GRP(生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码GRP的核酸的受调节表达的植物，其中所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有期望特征的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源性遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的所希望性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后引入该遗传物质至植物中。此类技术具有给予作物或植物多种经济学、农学或园艺学改良性状的能力。具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。种子产量是特别重要的性状，因为众多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡拉诺油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用众多类型代谢物的来源。种子 含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及幼苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。对于众多作物的另一个重要性状是早期萌发势。改进早期萌发势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在将稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的茎与萌发势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期萌发势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期萌发势已经限制了基于玉米带种质(Corn Belt germplasm)的玉蜀黍(Zea mayes L.)杂种在欧洲大西洋地区的引种。另一重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50% (Wang等、Planta(2003)218:l-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民是极大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。作物产量因而可以通过优化前述因素之一而增加。取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其他产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，增加种子参数可能是尤其希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其他参数，这取决于应用。多种机制可以对增加种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是增加的种子数目。增加植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期，或参与植物生长或参与防御机制的多种信号途径。现已发现可以通过调节编码GRP(目的生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进植物中的多种生长特征。GRP可以是如下蛋白质之一:伸展蛋白受体样激酶(ERLK)、F-框WD40 (FBXff)多肽、RAN-结合蛋白(RANBP)、金色2-样转录因子(Golden2_likeTranscription Factor, GLK)、REV δ同源域亮氨酸拉链结构域多肽、CLE蛋白质和种子产量调节物(Seed Yield Regulator, SYR )蛋白质。
背景技术：
伸展蛋白受体样激酶受体样激酶(RLK)参与将胞外信号传递至细胞内。RLK蛋白质具有始于N-末端，带有被加工的分泌信号的模块结构、胞外结构域、单个跨膜结构域和胞质激酶结构域。动物受体样激酶大多具有酪氨酸激酶活性，而植物RLK通常具有Ser/Thr激酶特异性，或者有时候可能具有双重特异性。在动物中，大多数RLK作为生长因子受体起作用，而植物受体样激酶可能在多种过程中发挥功能，所述过程包括发育、激素感知或病原体反应。有关植物受体样激酶的发育功能如分生组织发育、花粉-雌蕊相互作用、激素信号传导、配子体发育、细胞形态发生和分化、器官形态、器官脱落和体细胞胚胎发生等的综述，由Becraft (Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，18，163-192，2002)提供。或者，受体样激酶可以依据其胞外或胞内结构域的结构进行分类(Shiu和Bleecker, Proc.Natl.Acad.Sc1.美国 98，10763-10768，2001)。

图1 给出概述。PERK RLK和ERLK具有富含脯氨酸的胞外结构域，该结构域具有一般用于伸展蛋白和富含羟脯氨酸的细胞壁蛋白质的基序。伸展蛋白是一组在植物细胞壁中发现的富含羟脯氨酸的糖蛋白。它们通常富含羟脯氨酸(Hyp)、丝氨酸，以及Val、Tyr、His和Lys的组合。伸展蛋白中典型的基序是SPx基序，其中X代表(羟)脯氨酸重复的数目，一般是2、3、4或更多。伸展蛋白最多可占细胞壁干重的20%。它们是高度糖基化的，可能反映了它们与细胞壁糖类的相互作用。它们的功能中对机械压力的应答是加强细胞壁(例如，在有害物攻击期间、风中植物弯曲期间等)。伸展蛋白基序也可在伸展蛋白受体样激酶的小组(例如拟南芥At5g56890基因)中发现。Shiu和Bleeker (2001)在拟南芥中鉴定了 5个家族成员；在稻和其他物种中发现了多个直向同源物(Shiu等，Plant Celll6, 1220-1234，2004)。然而伸展蛋白RLK尚未表征。
F-框 TO40 多狀(FBXff)植物必须针对外部和内部的刺激调节它们的新陈代谢，以保证最佳生长。这些细胞过程中涉及的调节蛋白的水平常由蛋白酶解机制控制。在此方面，最重要的选择性蛋白质降解途径是依赖遍在蛋白的蛋白酶解途径。该途径在植物、动物和酵母中是保守的，它控制错折叠的多肽和短寿蛋白质的降解。后者是调控诸如防御反应和胁迫反应、细胞周期进展或信号传导的重要调控蛋白质。将要降解的蛋白质共价标记几个遍在蛋白单元。遍在蛋白化的蛋白质随后被26S的蛋白酶体识别，所述26S的蛋白酶体降解目标蛋白质但是再循环遍在蛋白单体。目标蛋白质的选择和随后的遍在蛋白化发生在不同的步骤中。涉及的三类蛋白质基于它们的连续作用，已被命名为El至E3。El酶，也称为遍在蛋白活化酶，其消耗ATP而“活化”游离的遍在蛋白分子，并以硫酯键与遍在蛋白复合。接着，活化的遍在蛋白分子从El酶转移至遍在蛋白缀合的酶E2的半胱氨酸。该E2酶一般与称为遍在蛋白蛋白连接酶的E3酶连接。遍在蛋白连接酶催化遍在蛋白从遍在蛋白缀合的酶转移至目标蛋白质，所述目标蛋白质最终由聚遍在蛋白链标记。E2酶和E3酶的复合体确定待遍在蛋白化的蛋白质的特异性。而在不同的组织中，存在一个或仅几个El酶，存在几个可以和几个E3酶结合的E2种类。遍在蛋白蛋白连接酶本身也是不同蛋白质的复合物。迄今，已知5种不同类型的E3酶。其中，SCF复合物在调控过程中起主要作用(Ciechanover (1998) EMBOJ.17:7151-7160; Hershko 和 Ciechanover (1998) Annu.Rev.Biochem.67:425-479)。该复合物由四个亚基组成:cdc53/滞蛋白、Skpl> Rbxl和F-框蛋白质。Skpl蛋白质，以及滞蛋白和Rbxl形成SCF复合物的核心连接酶单元。在该复合物中，Rbxl负责结合负有活化的遍在蛋白的E2酶。F-框蛋白质N-末端包含40-50个氨基酸的简并基序，称为F-框，在人细胞周期蛋白F之后命名。该F-框蛋白质负责和SCF复合物的Skpl亚基连接。在C-末端，不同的蛋白质相互作用结构域确定结合的目标蛋白质。此类蛋白质相互作用结构域之一是WD40重复结构域。与其他生物相比，在拟南芥中F-框蛋白质代表迄今为止在植物中发现的最大的超家族中的一个(Gagne 等，(2002)Proc Natl Acad Science99:11519_11524;Kuroda 等，(2002) Plant Cell Physiol43 (10): 1073-85)。但是，仅两个 F-框蛋白质含有 WD40 重复结构域,而在其他生物的F-框蛋白质中发现了多个WD40重复结构域。WD40重复(也称为β-转导素重复)是短的约40个氨基酸的基序，通常以Trp-Asp(W-D) 二肽结束。包含WD40重复的蛋白质(或WD40蛋白质)具有4至16个重复单元(其全部为WD40结构域)，所有这些被认为形成环化的β -螺旋桨式(propeller)结构。所有WD40蛋白质的基本共同功能是调整多-蛋白质复合物的装配，其中重复单元作为蛋白质相互作用的刚性支架。蛋白质的特异性通过重复自身表面(outside)的序列确定。公开的欧洲专利申请EP 1033405提供来自拟南芥的编码部分FBXW多肽(N-末端氨基酸序列，长约350个核苷酸) 的DNA序列(SEQ ID NO: 39903)。RAN-结合蛋白质(RANBP)Ran是小的信号传导GTP酶(GTP结合蛋白质)，其参与核质转运。已报导拟南芥中的Ran结合蛋白质、At-RanBPla> At-RanBPIb> AtRanbplc与GTP-结合形式的拟南芥 Ran1、Ran2 和 Ran3 蛋白质相互作用(Haizel T、Merkle T、Pay A、Fejes E、NagyF.Characterization of proteins that interact with the GTP—bound form of theregulatory GTPase Ran in Arabidopsis.Plant J.1997 年 I 月；11 (I):93-103)。所有的RanBPl蛋白质含有大约150个氨基酸残基的Ran结合结构域。Ran BPl以高亲和性直接与RanGTP结合。该结构域稳定GTP-结合形式的Ran (Ras-样核小GTP酶)。 国际专利申请W002/18538描述了具有破坏的RAN/Ran-结合蛋白质介导的细胞过程的转基因植物；这被报导产生具有增加的产量和生物量的植物。金色2-样(GLK)转录闵子植物中可发生两种光合循环:最常见的是C3植物的卡尔文循环，其中3-磷酸甘油酸是最稳定的产物，核酮糖二磷酸是CO2的受体。第二种循环是C4植物中的Hatch-Smack途径，其中草酰乙酸盐是最稳定的产物，烯醇丙酮酸磷酸是CO2的受体。在C3草类中，仅叶肉细胞是光合作用的，而在C4植物中，维管束鞘(bundle sheet)和叶肉细胞均是光合作用的。C4植物呈现区室化的光合作用，叶肉细胞通过烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、丙酮酸磷酸二激酶和苹果酸脱氢酶进行碳固定，并将苹果酸转移至维管束鞘细胞，在维管束鞘细胞中苹果酸脱羧基为丙酮酸，释放的碳之后在卡尔文循环中进一步加工。因而，在C4植物中存在3类叶绿体:C3植物的典型叶绿体存在于某些组织中，且在某些发育阶段中存在，而在维管束鞘中和叶肉细胞中存在形态迥异的叶绿体。玉米中叶绿体的起源需要两个转录调节物:金色 2(G2)和金色-样(GLK) (Rossini 等，Plant Celll3, 1231-1244，2001)的参与。转录因子通常定义为显示序列特异性DNA结合，并能够激活和/或抑制转录的蛋白质。拟南芥基因组编码至少1533个转录调节子，这占其估计的基因总数的约
5.9% (Riechmann 等，Science290, 2105-2109, 2000)。玉米金色(G2)基因是 GARP 转录因子组的代表，所述GARP转录因子组除金色2外，由拟南芥接受响应调节物(Acc印tingResponse Regulator) -B (ARR-B)和来自衣藻(chlamydomonas)的 ￡srl 定义。所有 GLK 蛋白质分类为GARP家族的成员。GLK基因是单源的，且基因复制独立发生在单子叶植物和双子叶植物中。GLK蛋白质一般包含GARP DNA结合结构域和C-末端金色2框。拟南芥GLK蛋白质在叶绿体的发育中是多余 的(Fitter等，Plant J.31，713-727，2002)。另外，该基因的功能在球蒴藓(Physcomitrella patens)和拟南芥中是保守的,这表明GLK-介导的叶绿体发育的调节是植物中古老的调节机制(Yasumura等，Plant Celll7, 1894-1907,2005)。在G2的情况中，大多数转录因子的四个确定的特征中的三个已在异源系统中得到实验证实。G2定位于核(Hall等，1998)，能够反式激活报道基因的表达，并可以同源二聚化，以及和 ZmGLKl 异源二聚化(Rossini 等，2001).
REV δ ( A )同源域亮氡酸柃链结构域(REV Λ HDZip/START)本发明涉及使用特定类型的转录因子增加植物的产量。转录因子多肽通常定义为显示序列特异性DNA结合亲和性，并能够激活和/或抑制转录的蛋白质。同源域亮氨酸拉链(HDZip)多肽组成转录因子家族，其特征在于存在DNA-结合结构域(同源域，HD)和邻近的亮氨酸拉链(Zip)基序。该同源域通常包含大约60个保守氨基酸残基，所述氨基酸残基形成结合DNA的螺旋1-环-螺旋2-转角-螺旋3。此DNA结合位点通常为假回文结构(pseudopalindromic)o亮氨酸拉链邻近于同源域的C-末端(在一些情况下有几个氨基酸的重叠)，包括几个七个氨基酸的重复(至少4个)，其中通常每隔6个氨基酸就出现亮氨酸(偶尔为缬氨酸或异亮氨酸)。亮氨酸拉链对于蛋白质二聚化非常重要。二聚化是DNA结合的前提条件(Sessa等(1993) EMBO J12(9): 3507-3517)，并且可以发生在两个相同的HDZip多肽之间(同源二聚体)，或者两个不同的HDZip多肽之间(异源二聚体)。同源域编码基因存在于所有真核细胞中，并构成拟南芥中至少89个成员的基因家族。亮氨酸拉链多肽本身也见于来自除植物外的真核细胞的多肽中。不过，在同一个多肽中同源域和亮氨酸拉链两者同时存在却是植物所特有的(在拟南芥89个成员中的至少47个中发现)，并且除了维管植物之外,还已经在藓类植物(moss)中遇到(Sakakibara等(2001)Mol Biol Evol18 (4):491-502)。基于序列相似性标准，已将拟南芥HDZip基因分为四个不同的类别=HDZip I至IV (Sessa 等，(1994),在:Puigdomene P、Coruzzi G (编著)，Springer, Berlin HeidelbergNew York,第411 - 426页)。在拟南芥中，至少有5个III类HDZip多肽(REVOLUTA(REV/IFL)、PHABULOSA (PHB)、PHAVOLUTA (PHV)、CORONA (CNA/AtHB15)和 AtHB8)，所有的一般都很大(大于800个氨基酸)。类似地，在稻中已鉴定了至少5个III类HDZip多肽。除了同源域和亮氨酸拉链，III类HDZip多肽C-末端至亮氨酸拉链还包含用于脂质/sterol结合的START (类固醇生成急性调节(STAR)相关脂质转移)结构域，以及未知功能的突出(extensive) C-末端区(CTR,超过多肽长度的一半)(Schrick等，(2004)GenomeBiology5:R41)另外，在编码III类HDZip多肽的mRNA转录物的START结构域的编码转录物区中发现微小RNA的互补位点(MIR165/166)，所述微小RNA用于调控通过miRNA-介导的转录物剪切(Williams 等，(2005)Developmentl32:3657-3668)。在拟南芥中，REV、PHB和PHV多肽已显示参与茎端分生组织和腋生分生组织的形成和功能，三种双向结构(例如胚或叶)的图式形成(patterning),以及维管发育(木质化输导(lignified conducting)和支持组织的分化)。在拟南芥中，系统发育分析揭示这三种密切相关的III类HDZip多肽形成REV进化枝，剩余的III类HDZip多肽(CAN和AtHB8)属于CNA进化枝(Floyd等，(2006) Geneticsl73:373-388)。当在系统发育分析中组合稻和拟南芥时，两种稻III类HDZip多肽(OsHoxIO和OsREV多肽)聚簇于REV多肽。拟南芥phb、phv、can和athb8的功能失去突变是显性的(aphenotypic) (Baima等，(2001)Plant Physioll26:643_655;Prigge 等，(2005)Plant Celll7:61_76)，但是rev的功能失去突变形成缺陷侧生分生组织和花分生组织，且发育为异常的茎维管结构和卷曲的(外卷的)叶(Otsuga 等，(2001)Plant J.25，223-236; Talbert 等，(1995)Developmental: 2723-2735)。由于在跨越MIR165/166结合位点(在START结构域中)的序列中的核苷酸取代，玉米中显性等位基因卷曲的叶l(rldl) (Juarez等，(2004)Nature428:84-88)、拟南芥中的phb-d 和 phv_d(McConnell 等，(2001)Nature411:709-713),以及拟南芥中的 rev_d(Emery等，(2003)Curr Biol 13:1768-1774)表现相似的突变表型(卷曲的叶)。在授权的美国专利US7056739(以及相应的国际专利申请W001/33944)中描述了用包含编码SEQ ID NO: 2 (该授权的美国专利)所示的REV多肽的拟南芥REV核酸序列的转基因转化的植物和植物细胞。该转基因被报导为还包含与编码多肽SEQ ID N0:2的核酸序列有效连接的异源启动子。通过使用CaMV启动子，转基因拟南芥植物超量表达REV核酸序列，表现出增加的叶、茎和种子大小。提供来自番茄、稻、玉米和大麦的部分III类HDZip基因组序列和CDNA5’末端序列。描述了设计用于分别在 稻和玉米中降低内源拟南芥、稻和玉米III类HDZip多肽表达，以再现rev功能失去表型的载体的实例。
在国际专利申请W02004/063379中提供了拟南芥REV多肽的两种玉米III类HDZip多肽直向同源物的核酸序列。描述了在植物细胞中通过抑制mRNA转录物的表达来调节III类HDZip多肽的水平的方法。在Mendel Biotechnology公司存放的许多国际和美国专利申请中，拟南芥REV多肽为内参G438。T-DNA插入REV基因座后降低的REVOLUTA活性导致转基因拟南芥植物具有减少的分枝和降低的木质素含量，而增加的REVOLUTA活性(使用病毒CaMV启动子)导致转基因拟南芥植物在大致中期具有比野生型植物后期稍大而平的叶。CLE-样多狀虽然植物中细胞与细胞的通讯主要通过植物激素发生，所述植物激素例如生长素、脱落酸、油菜素类固醇、赤霉酸、乙烯，但是现在认识到肽类激素是信号传导事件的重要介质。肽类激素组例如包含系统素、植物硫酸肽、EN0D40、RALF, CLAVATA3、SCR肽和POLARISοCLE-样多肽形成的多肽家族包含拟南芥CLAVATA3和玉米ESR多肽，并共享所述多肽的同源性。假设这些多肽作为配体参与信号传导事件。植物的根和地上部分分别源自活化的根顶端分生组织(RAM)和茎顶端分生组织(SAM)。这些结构含有允许生长成所有植物细胞类型和组织的多能细胞。在SAM中，虽然中央区(central zone)中的细胞比外周区中的细胞分裂慢，存在中央区中茎细胞的分裂和外周区中细胞分化的平衡。CLAVATA3 (CLV3)是CLV3/ESR(CLE)配体基因家族的成员，并由SAM的茎细胞分泌，由此活化CLAVATA1-CLAVATA2受体二聚体并导致WUSCHEL (WUS)基因的受限表达。WUS是同源域转录因子并促进茎细胞的形成；其是茎细胞繁殖所需的。另一方面，CLV3是防止茎细胞不受控制的繁殖所需的。CLV3和WUS因此形成控制茎细胞数目和SAM结构的反馈环。Wus突变体不能发育出茎顶端分生组织，而clv3突变体发育出非常大的茎顶端分生组织。CLE配体基因家族的 另一个成员是CLE2，其功能类似与CLV3，分泌在生长和发育过程的不同途径中活化的信号分子。CLE2和CLE家族成员的其他成员由Cock和McCormick (Plant Physiol.126，939-942，2001)首次表征。所有 CLE 家族成员均是短的多肽(大约7至9kDa)，具有疏水性N-末端序列(假定的信号肽或信号锚)。推定的成熟多肽的主体是高度碱性的(平均PI9.49± 1.57)，它们的整条链均是亲水的，在C-末端或其附近有保守区。该保守区可能参与蛋白质-蛋白质的相互作用。假设CLE家族的成员，例如CLV3和CLE2，由蛋白酶处理为分泌的短肽。虽然CLE蛋白质在长度、电荷和亲水性上具有总体相似性，但在氨基酸序列水平上是高度不同的。据报导CLE2通过加入N03_诱导(Scheible 等,Plant Physiol.136, 2483-2499，2004)。其他的功能性特征(Strabala等，Plant Physiol.140, 1331-1344, 2006)揭示拟南芥中CLE2超量表达导致具有极推迟的开花时间(大约40天，而对照植物为20天)的矮化植物，但其相对于对照具有更长的根。CLE2的超量表达也模拟wus表型。CLE2的类似表型也在CLE3、CLE5、CLE6中CLE7观察到。这些蛋白质也是结构相关的。但是，没有可获得的cle2突变体或CLE2减量调节数据的表型信息。W001/96582描述了配体-样蛋白质(LLP)或其功能片段用于调节植物表型或构造的用途。优选的LLP或片段包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX (其中X可以是任意氨基酸)，更优选的LLP或片段包含氨基酸基序KRXXXXGXXPXHX。该文件还描述多种LLP的异位表达导致不育的转基因植物，或植物最多具有下降的能育性。同样，LLP的反义表达产生具有下降的能育性的转基因植物(每长角果中更少的种子数量)。W003/093450公开了 CLAVATA3-样肽在植物中调节细胞分裂、分化和发育的用途，尤其是调节分生组织发育的用途。假设在开花之前CLV3-样肽降低的活性可导致额外的叶的产生，由此提供具有更多能量产生的植物，并因此增加产量，或增加心皮具有的种子数目，或产生更厚的茎，或改变植物的果实。但是就CLV3表达的减量调节仅提供了假设性的实例，未给出真实的实验数据。另外，所公开的CLV3-样肽落入WOO1/96582公开的LLP种类，因为它们包含基序XRXXXXGXXXXHX，因此显示的是减量调节的表达导致植物具有下降的能育性。类似地,当来自植物寄生线虫大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)的CLE-样蛋白质在拟南芥中超量表达时，转基因植物产生花，但这种花不开放或缺少中央雌蕊群，且根系变短。
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因此存在的问题是诸如LLP或CLV3-样的CLE-样多肽如何用于增强产量相关性状。种子产量调节物SYR是迄今仍未被表征的新蛋白。SYR与名称为ARGOS的拟南芥蛋白质显示一定的同源性(在DNA水平上大约48%的序列同一性，在蛋白质水平上大约45%的序列同一性)(Hu 等，Plant Celll5, 1951-1961，2003; US2005/0108793)。Hu 等推定 ARGOS 是具独特功能的蛋白质且由单个基因编码。拟南芥中ARGOS过表达的主要表型是增加的叶生物量和延迟的开花。相反，稻中SYR过表达主要增加种子产量，而叶生物量和开花时间未明显改变。发明简述现已惊奇地发现在植物中调节编码伸展蛋白受体样激酶(ERLK)或其部分的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，其中所述部分包含至少激酶结构域和跨膜结构域。因此，本发明提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码ERLK蛋白质或其部分的核酸的表达。现已惊奇地发现在植物中增加编码FBXW多肽的核酸的表达产生了相对于合适的对照植物具有增加的产量的植物。因此，根据本发明的另一实施方案，提供相对于合适的对照植物增加产量的方法，其包括在植物中增加编码FBXW多肽的核酸的表达。研究了 RAN-结合蛋白增强产量相关性状的用途后，本申请的发明人发现启动子的选择是重要的考虑因素。他们发现组成型启动子控制下在植物(稻)中表达RAN-结合蛋白对产量相关表型没有任何影响。然而他们惊讶的发现种子特异性启动子，尤其是胚乳特异性启动子控制下在植物中表达RAN-结合蛋白成功的增加了植物的产量。因此，本发明也提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括优先在植物种子或种子部分中调节编码RANBP的核酸的表达。现已发现在植物中调节编码金色2样(GLK)蛋白质的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，本发明在另一实施方案中提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码GLK蛋白质或其部分的核酸的表达。同样令人惊讶的发现，使用REV δ同源域亮氨酸拉链结构域(HDZip) /类固醇生成急性调节(STAR)相关脂质转化结构域(START)核酸序列降低植物中内源REV基因的表达，产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。本发明因此提供另一个实施方案方法，其通过使用REVAHDZip/START核酸序列降低植物中内源REV基因的表达，相对于对照植物增加
植物产量。现已发现在植物中调节编码CLE样多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。因此，本发明在另一实施方案中提供相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码CLE样多肽或其部分的核酸的表达。现已惊奇地发现在植物中调节编码种子产量调节物蛋白质(此后称为SYR)的核酸的表达产生了相对于对照植物，当在非生物胁迫条件下生长而具有提高的非生物胁迫耐受性的植物。因此，本发明提供相对于对照植物，在非生物胁迫条件下增强植物产量相关性状的方法，其包括在植物中调节编码SYR多肽的核酸的表达。定义多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式中通过肽键连接的氨基酸。多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度非分支聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者组合。对照植物选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是由于分离丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。同源物蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。插入指一个或 多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比氨基端融合或羧基端融合更小，约1-10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FLAG ~表位、lacZ、CMP( |丐调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋结构或折叠结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如 Creighton (1984) Proteins.W.H.Freeman and Company (编著)和下表 I)。表1:保守性氨基酸取代的实例
权利要求
1.用于相对于对照植物增加植物中非生物胁迫抗性的方法，其包括调节编码SYR多肽的核酸在植物中的表达，所述SYR多肽包含富含亮氨酸结构域，所述富含亮氨酸结构域的前面是保守的三肽基序I (SEQ ID N0:256、257、258或259中的一个)，后面是保守基序2(SEQ ID NO: 260)，其中所述增加的非生物胁迫抗性是相对于对照植物增加的营养摄取效率。
2.根据权利要求1的方法，其中所述SYR多肽与SEQID NO:252所示的SYR多肽具有一定序列同一性，所述序列同一性按照增加的优选顺序为至少27%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更高的序列同一性。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述编码SYR多肽的核酸由表II中给出的任一核酸SEQ ID NO或其部分所代表，或是能够与在表II中给出的任一核酸SEQ ID NO杂交的序列。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表II中给出的任意SEQID NO的直向同源物或旁系同源物。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述SYR蛋白质还包含保守基序3(SEQ IDNO:261)。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述营养摄取效率导致增加的种子产量和/或增加的生物量。
7.根据权利要求6的方法，其中所述增加的种子产量包含至少增加的种子总重量；千粒重和/或增加的饱满种子数。
8.根据权 利要求6的方法，其中所述增加的生物量是增加的枝条生物量和/或增加的根生物量。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述增加的营养摄取效率在轻度干旱条件下发生。
10.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述调节表达通过在植物引入并表达编码SYR多肽的核酸来实现。
11.根据权利要求10的方法，其中所述核酸与组成型启动子有效连接，优选与GOS2启动子有效连接。
12.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述编码SYR多肽的核酸是植物来源的，优选来自单子叶植物，还优选来自禾本科，更优选来自稻属，最优选地来自稻。
13.构建体在制备具有增加的非生物胁迫抗性的植物的方法中的用途，所述构建体包含: (a)编码如权利要求1-5中任一项所定义的SYR多肽的核酸； (b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一种或多种调控序列；和任选地 (C)转录终止序列， 其中所述调控序列中的一种是组成型启动子，优选是GOS2启动子，并且其中增加的非生物胁迫抗性是相对于对照植物增加的营养摄取效率。
14.编码SYR多肽的核酸在用于相对于对照植物，增加植物中非生物胁迫抗性的方法中的用途，其中增加的非生物胁迫抗性是相对于对照植物增加的营养摄取效率。
15.根据权利要求14的用途，其中所述增加的营养摄取效率导致增加的种子产量和/或增加的生物量 。
全文摘要
本发明一般地涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节编码GRP(生长相关蛋白)的核酸在植物中表达而改进多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码GRP的核酸的受调节表达的植物，其中所述植物相对于对应野生型植物或其他对照植物具有改良的生长特征。本发明还提供用于本发明方法中的构建体。GRP可以是如下蛋白之一伸展蛋白受体样激酶(ERLK)、F-框WD40(FBXW)多肽、RAN-结合蛋白(RANBP)、金色2-样转录因子(GLK)、REVδ同源域亮氨酸拉链结构域多肽、CLE蛋白质和种子产量调节物蛋白质。
文档编号C12N15/29GK103103198SQ20131002626
公开日2013年5月15日 申请日期2007年5月30日 优先权日2006年5月30日
发明者V·弗兰卡德, V·米隆诺弗, C·勒佐 申请人:克罗普迪塞恩股份有限公司