专利名称：一株高效转化黄姜皂苷为薯蓣皂苷元的菌种及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,具体涉及鞘氨醇单胞菌属sp.) ST-O3及其高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法。
背景技术：
薯蓣皂苷苷元是生产留体激素类药物的重要基础原料。留体激素药物是仅次于抗生素的第二类药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。近年来，甾体药物在医疗领域的应用范围不断扩大，被广泛用于治疗风湿病、心血管、胶原性病症、淋巴白血病、人体器官移植、抗肿瘤、细菌性脑炎、皮肤病、内分泌失调、老年性疾病等。目前大概有超过一千种留体激素类药物是由薯蓣皂苷元合成或者半合成的。国内外薯蓣皂苷元的提取工艺主要是直接酸水解法和预发酵法，以及一些在此两种方法基础上的改进等方法，这些方法中均有酸水解这一工序，产生大量含酸废液，对环境的污染比较严重。利用微生物进行薯蓣皂苷元的转化可以实现绿色高效的生产，能够有效的克服化学合成方法的毒性大、专一性不强和转化效率不高的弊端。
黄姜中的皂苷成分复杂，而且多数是脂溶性化合物，水溶性很低，因此转化过程中底物投料浓度和转化效率都非常低，相对于研究者已经发现木霉属和曲霉属的一些微生物，虽然将黄姜中的皂苷转化为薯蓣皂苷元进行生物转化的条件温和，环境友好，但是这些微生物的转化效率低，副产物多，并不能真正的进入工业生产。因此筛选一株高效转化生产薯蓣皂苷元的微生物具有非常重要的意义，而目前关于鞘氨醇单胞菌属用于转化生产薯蓣皂苷元的研究未见报道，其生产薯蓣皂苷元的高收率更是工业生产的一大优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高效转化产生薯蓣皂苷元的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.) ST-03,以及利用该菌株转化生产薯菌阜苷元的方法,可达到高产物得率的要求。本发明的发明人从实验室保存的真菌中筛选到一株转化产生薯蓣皂苷元的微生物，该菌株为鞘氨醇单胞菌属sp.)ST_03,保藏在位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6836，分类命名为Sphingomonas sp.,保藏日期为2012年11月19日。应用上述微生物转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法，其步骤如下:
(1)米用保藏号为CGMCCN0.6836的鞘氨醇单胞菌属sp.) ST-03为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到查氏培养基上；
(2)制备ST-03菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(I)的查氏固体培养基上的ST-03菌株一环，接种于已灭菌的装有30-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为30-40°C，置摇床上以170-220 r/min的转速培养24-28 h至对数生长中期，即得到ST-03菌株的细胞液体培养物；
(3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以3-7%(w/w)的接种量接入发酵培养基，装液量为500 mL锥形瓶中装60-90 mL发酵培养基，培养温度为30_40°C，在170-210 r/min的转速下培养24-28 h，获得发酵液。(4)生物转化:精确称取适量黄姜皂苷，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为3-5 g/L，在转化温度37°C，170-210 r/min的转速下转化140-170 h，即得转化液。(5)产物检测:将步骤(4)的转化液在7000-11000 r/min下离心4-9 min，沉淀用与转化液同体积的60 0C _90°C石油醚抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μ m的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析薯菌阜苷兀的含量。其中步骤(I)中所述的查氏固体培养基的成分及配比为:蔗糖30 g/L，硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾I g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，水1000 mL,自然pH。在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:蔗糖18 8/1，硫酸铵1.5 g/L，硝酸钠1.5 g/L，氯化钠4 g/L，磷酸氢二钾0.8 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.4 g/L，七水硫酸铁0.02 g/L，水1000 mL，自然pH，在121°C高压蒸汽下灭菌20 min;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:蔗糖18 g/L，硫酸铵1.5 g/L，硝酸钠1.5 g/L，氯化钠4 g/L，磷酸氢二钾0.8 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.4 8/1，七水硫酸铁0.02 g/L，黄姜皂苷4 g/L，水1000 mL，自然pH，121°C高压蒸汽下灭菌20 min。本发明所述的鞘氨醇单胞菌属sp.)ST_03菌株首次发现可转化生成薯蓣皂苷元，并且能达到高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
具体实施例方式实施例1醇提法得到黄姜皂苷
将鲜黄姜切成0.5 Cm左右小块，80 °C烘干，粉碎机粉碎。圆底烧瓶中加入1000 ml无水乙醇，再倒入100 g黄姜粉末，加热至微沸，回流提取3次，每次4 h，过滤，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩，得到醇溶皂苷。称取圆底烧瓶和皂苷的重量a，加入150 mL去离子水，超声使皂苷与水充分混溶，倒出皂苷，称量圆底烧瓶的重量b，a-b即是醇溶皂苷的重量。实施例2酶解法得到黄姜皂苷
称取100 g干黄姜粉，加入3000 mL水中，煮沸I h，冷却，调整pH为6.0，加入中温淀粉酶0.5 mL,65 °C温育I h。冷却后调整pH为6.5，加入耐高温淀粉酶0.5 mL,80 °C温育I h。冷却，调整pH为5.5，加入液体糖化酶I mL，60 °C温育8 h。冷却，5000 rpm离心20min,取沉淀，60°C烘干至恒重，称重。实施例3得到黄姜皂苷
称取鲜黄姜312 g (约合100 g干黄姜)粉碎，磨浆。加去离子水150 mL洗涤，经两层纱布挤压过滤。滤渣加150 mL去离子水洗涤，重复过滤。①滤液静置5 h，物料分为3层，上层为清液(红褐色)，中间层为黄姜悬浊液，下层为淀粉(白色)。吸取上清液，倾倒悬浊液，可得到下层的淀粉，60 °C烘干称重。②滤渣，即纤维渣，重复水洗6次(每次用水150 mL)，得纤维素，105°C烘干，称重。水洗液抽滤，滤渣与①所得悬浊液合并。调整悬浊液pH为6，加入耐高温淀粉酶0.12mL和糖化酶1.8 mL, 60 °C酶解6 h。酶解结束后7000 rpm离心15 min，取沉淀60 °C干燥得皂苷，称重。
实施例4利用鞘氨醇单胞菌属sp.) ST_3转化产生薯菌阜苷元
(I)制备鞘氨醇单胞菌属sp.) ST-3菌株的细胞液体培养物
挑取固体查氏培养基上的鞘氨醇单胞菌属sp.)ST_3菌株一环,接种在装有25 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以180 r/min的转速培养24-28 h至对数期，即制得鞘氨醇单胞菌属sp.)ST_3菌株的细胞液体培养物。(2)发酵培养基的成分及配比为:蔗糖18 8/1，硫酸铵1.5 g/L，硝酸钠1.5 g/L，氯化钠4 g/L，磷酸氢二钾0.8 g/L，七水硫酸镁0.4 g/L，氯化钾0.4 g/L，七水硫酸铁
0.02 g/L，水1000 mL，pH自然，121°C高压蒸汽下灭菌20 min。(3)摇瓶发酵:将上述鞘氨醇单胞菌属sp.)ST_3菌株的细胞液体培养物以3-7%(w/w)的接种量接种在装有已灭菌的25 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在30-40°C条件下，置于摇床上以140-170 r/min的转速培养，发酵24-28 h，菌体进入对数中后期。(4)生物转化:精确称取适量黄姜皂苷，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使黄姜皂苷终浓度为5 g/L，在转化温度30°C，200-220 r/min的转速下转化140-170 h。实施例5石油醚提取转化产生的薯蓣皂苷元
7000-11000 r/min离心转化液15 min,取沉淀,加入石油醚(沸点60 °C 90 °C ) 15mL超声提取3次，每次4 h，合并提取液，80 °C浓缩至15 mL左右。所得即是薯蓣皂苷元的石油醚溶液。
权利要求
1.一株高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的菌株，该菌株为鞘氨醇单胞菌属(.Sphingomonas sp.) ST-03,保藏在位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6836，分类命名为Sphingomonas sp.,保藏日期为2012年11月19日。
2.利用鞘氨醇单胞菌属sp.) ST-03 (保藏编号为CGMCC N0.6836)转化生产薯蓣皂苷元的方法，其特征为:500 mL三角瓶装60-90 mL的发酵培养基，接种量按体积比为3-7%，培养温度30-40°C，摇床转速170-210 r/min，培养26 h后投入一定量的底物黄姜皂苷，继续转144 h ;所用发酵培养基组成如下:葡萄糖18-40 g/L，NaNo3 0.2-1.9g/L, (NH4)2SO4 0.2-1.9 g/L，NaCl 1.5-4.5 g/L, K2HPO4 0.2-1.2 g/L, MgSO4 0.2-1.2 g/L,FeS04.7 H2O 0.02-0.12 g/L`, pH 6.0_7.5，121°C高压蒸汽下灭菌 20 min。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体涉及鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)ST-03及其高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法，能达到高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
文档编号C12P33/20GK103103154SQ20131004061
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月3日 优先权日2013年2月3日
发明者李会, 史劲松, 张佳佳, 许正宏, 马洋, 谢婉玲, 张晓梅, 李恒 申请人:江南大学