专利名称：小鼠抗人pcna单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及以原核表达的PCNA蛋白免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株12D10，属于生物工程技术领域。
背景技术：
增殖细胞核抗原(ProliferatingCell Nuclear Antigen 简称 PCNA)又称周期蛋白，是一种分子量为36kDa的酸性蛋白，于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中被首次发现并命名。PCNA是一种核内蛋白质,在细胞核内合成,并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白，是DNA合成必不可少的因子。PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA是真核细胞DNA合成所必需的辅酶，具有协调DNA复制、调控细胞周期等多种生物学功能，在调节DNA合成和细胞增殖方面起着重要作用。增殖旺盛的细胞中，PCNA呈强阳性表达，而在静止期细胞中为阴性表达，其合成量与细胞增殖状态成正相关。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化；不溶性PCNA较稳定，在GO Gl期细胞中无明显表达，在细胞Gl期开始升高，于S期达到峰值，G2 M期明显下降，M期降至最低点，其量的变与DNA的合成量曲线相一致。检测PCNA在细胞中的表达,可作为评价细胞增殖状态的一个指标,是细胞增殖的理想标记物。PCNA免疫染色基本完全着色于细胞核上，表现为弥散的或(和)颗粒的形式。PCNA能在增殖细胞中合成和表达，因而PCNA不仅存在于肿瘤组织中，也存在于正常的可增殖组织中，如上皮组织、淋巴组织等。肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。国内外许多学者对肿瘤进行了 PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性。有研究发现，PCNA指数在原位癌组织中明显增高，与癌前病变组织和正常组织比较，存在明显差异。这对判断癌前病变和原位癌有重要意义，可提高肿瘤的早期诊断率。在乳腺癌、肺癌组织中，PCNA被认为是判断预后的可靠指标，PCNA表达高者死亡率高、预后差。检测PCNA是一种比较理想的判断细胞增生的指标，对肿瘤的早期诊断、指导肿瘤的治疗、对肿瘤预后的判断等方面会有越来越广泛的用途。目前，国内外已经获得了多种PCNA的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高， 具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的PCNA的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测PCNA表达的小鼠抗人PCNA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:(I)根据PCNA的基因序列(ΝΜ_002592.2)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增PCNA基因，构建重组表达载体PET28a-PCNA，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。(2)采用经典的细胞融合技术制备PCNA单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。(3)采用免疫印迹法(Western blot)检测PCNA单抗的特异性，通过免疫组织化学分析PCNA单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。(4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体PCNA重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体PCNA的重链和轻链可变区序列。本发明提供的以原核表达的PCNA蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为12D10，分类命名为小鼠抗人PCNA杂交瘤细胞系，该细胞株12D10已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCN0.6914。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株12D10，CGMCC N0.6914产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO =IO0本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本发明的优点和有益效果:本发明应用重组人的PCNA蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗PCNA的杂交瘤细胞株，命名为12D10，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对PCNA单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上。免疫印迹法(Western blot)检测PCNA单抗的效价及特异性，结果显示在分子量36KDa处有一条明显的区带，证明是抗PCNA小鼠单克隆抗体，梯度稀释显示抗体1: 2000稀释后条带依然清晰；乳腺癌石蜡切片经抗PCNA抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到呈均匀着色的棕黄色颗粒，定位在细胞核，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的PCNA单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的PCNA蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测PCNA表达。
图1SDS-PAGE分析纯化后的PCNA单克隆抗体。
图2ELISA法测定PCNA单克隆抗体滴度。
图3是免疫印迹法(Western blot)检测PCNA单抗的纯度及特异性。图4是免疫组织化学检测分析PCNA单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。实施例1:杂交瘤细胞株12D IO及其产生的单克隆抗体的获得1、抗原制备(I)获得目的基因在该实施例中，根据PCNA的基因序列(NM_002592.2)的编码框，设计I对特异引物:引物1:5' -TAGGATCCATGTTCGAGGCGCGCCTGG-3' (SEQIDN0:1)引物2:5' -ACTCGAGCTATGATCCTTCTTCATCC-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增PCNA基因。
(2)构建重组表达载体将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-PCNA。(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。(4)诱导表达和蛋白纯化将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，370C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM IPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化PCNA蛋白。2、单抗的制备和纯化(I)、免疫动物—般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫。纯化的重组蛋白PCNA (用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，100 μ g/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白PCNA(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白PCNA (用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，IOOyg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融(2)、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清:以纯化的PCNA蛋白(10 μ g/ml)包被酶标板，每孔100 μ 1,4°C包板过夜。甩掉包被液,加入200 μ 15%的脱脂奶粉,37°C封闭Ih后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清IOOy I (阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50 μ I，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗PCNA杂交瘤细胞株，命名为12D10，亚型鉴定为IgGl。将选出的阳性杂交瘤细胞株12D10克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人PCNA杂交瘤细胞系12D10，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6914。(3)单克隆抗体的大量制备与纯化将步骤(2)获得的细胞株12D10接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。单克隆抗体PCNA的纯化:采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗PCNA的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。(4)直接ELISA法测定纯化抗体的滴度以纯化的PCNA蛋白(10yg/ml)包被酶标板，每孔100μ 1，4°C包板过夜。甩掉包被液，加入200 μ 15%的脱脂奶粉，37°C封闭Ih后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 进行稀释，以每孔 100 μ I 加入酶标板中(阴性对照为PBSlOOy I)，37°C孵育I小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μ 1，室温静置5分钟，加终止液50 μ I。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1: 10000以上(参见图2)。实施例2:单克隆抗体鉴定及应用1、小鼠抗PCNA单克隆抗体的鉴定裂解提取Hela细胞裂解液，上样至10%的SDS-PAGE胶孔中，20 μ g/孔，电泳后将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，封闭后，用抗PCNA抗体进行免疫染色，加入实施例1步骤
(3)制备并纯化的PCNA单克隆抗体，工作浓度分别设为:1: IOOOU: 2000、4°C过夜，力口入HRP标记的羊抗鼠抗体，工作浓度1: 5000，于37°C反应lh，每个浓度梯度均出现分子量为30KDa的条带(参见图3)，与文献报道相符，证明此抗体为抗PCNA的特异性抗体。2、免疫组化应用检测用PCNA单抗，按常规法作病理切片，对人乳腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。具体方法为:(I)脱蜡切片依次置于二甲苯1、I1、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇1、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。(2)抗原修复将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液(pH6.0)，高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。(3)阻断3 % H2O2中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。`(4)滴加一抗甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤(3)制备并纯化的PCNA单克隆抗体，稀释度为1: 1500。放置在孵育盒内4°C冰箱中过夜孵育约12小时。(5)滴加二抗将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37°C恒温箱中孵育30分钟。(6)显色、衬染、封片取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3 5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5 10分钟，苏木素染液复染I分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5 10分钟，脱水、透明、封片、镜检。结果判定:按照国外学者对组织中PCNA的判定标准，PCNA蛋白阳性反应为出现明显棕黄色颗粒，定位于细胞核。人乳腺癌组织(参见图4)经抗PCNA抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到呈均匀着色的棕黄色颗粒，定位在细胞核，背景清晰，无非特异性着色，说明此PCNA小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。实施例3:单克隆抗体可变区测序根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物:zh07 5' -GGGGATATCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3' (SEQ ID NO:3)zhrll 5' -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQ ID NO:4)
zl05 5' -GGGGATATCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO:5)zlr05 5' -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQ ID NO:6)Trizol Reagent试剂分别提取5 X IO6杂交瘤细胞12D10的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhrll为引物进行PCR扩增单克隆抗体PCNA重链可变区，用zlOl和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体PCNA轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94°C 5分钟；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30个循环；72°C 7分钟。PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段(轻链长度391bp，重链长度420bp)。克隆到PGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的LB液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用QIAGEN的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体PCNA的重链和轻链可变区序列。单克隆抗体PCNA可变区的DNA序列和氨基酸序列:单克隆抗体PCNA 重链可变区 DNA 序列(5' —3'，333bp) (SEQ ID NO:7)；单克隆抗体PCNA的轻链可变区DNA序列(5' —3' , 399bp) (SEQID NO:8)；单克隆抗体PCNA重链可变区的推断氨基酸序列(111氨基酸)(SEQ ID NO:9)；单克隆抗体PC NA轻链可变区的推断氨基酸序列(132氨基酸)(SEQ10ID NO:10)。
权利要求
1.一种以原核表达的PCNA蛋白免疫小鼠获得的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株12D10，保藏编号为 CGMCC N0.6914。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株12D10产生的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10o
4.一种DNA分子SEQ ID NO:7，它编码权利要求3中所述的重链可变区氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一种DNA分子SEQ ID NO:8，它编码权利要求3中所述的轻链可变区氨基酸序列SEQID NO:1 0o
全文摘要
一种小鼠抗人PCNA单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌PCNA单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为12D10，保减编号为CGMCC No.6914。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株12D10产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO10。本发明还提供了一种DNA分子SEQ ID NO7，它编码重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO9；一种DNA分子SEQ ID NO8，它编码轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测PCNA表达。
文档编号C12R1/91GK103173418SQ20131004130
公开日2013年6月26日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者张林刚, 郗日沫, 尹芝南 申请人:天津三箭生物技术有限公司