专利名称：一种枯草芽孢杆菌耐高温β-淀粉酶分离纯化的方法
技术领域：
本发明涉及一种野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis6_7耐高温β -淀粉酶生产工艺，具体地涉及一种发酵液高效地分离纯化高酶活力β -淀粉酶的方法，属于发酵及酶工程领域。
背景技术：
β -淀粉酶(I, 4_ a-D-glucan maltohydrolase,EC3.2.1.2),是外切型糖化酶，作用于淀粉或糖原时，从α-1，4糖苷键的非还原性末端依次切下麦芽糖单位，水解产物有麦芽糖、麦芽三糖、极限糊精及少量的葡萄糖。麦芽糖同时发生瓦尔登转位反应(Waldeninversion),由α -型变为β-型,故称β-淀粉酶。理论上β _淀粉酶能将所有的直链淀粉转变为麦芽糖而将大约60%的支链淀粉转变为麦芽糖剩下的转变为糊精。β -淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、燕麦、大豆、甘薯等植物中，及芽孢杆菌属(Bacillus)、耐热梭状芽孢杆菌属(Clostridium)及霉菌等微生物中。β _淀粉酶主要用于食品工业，如高麦芽糖浆、超高麦芽糖浆、麦芽糖醇的生产。将淀粉水解为麦芽糖，麦芽糖可作为甜味剂、品质改良剂、 防腐剂、稳定剂、麦芽糖醇的前体及糖尿病治疗的静脉注射剂。β_淀粉酶还可用于啤酒行业，是麦芽最为理想的取代品。适量β_淀粉酶作用于不同玉米淀粉，可以增加抗性淀粉含量，如HylonV玉米淀粉经β -淀粉酶水解4小时后抗性淀粉RS含量高达70.7%。目前国内淀粉酶主要从植物中直接提取，如大豆、大麦、小麦、甘薯，属于天然产品，安全，但仍存在许多不足。先将植物原料进行清洗、磨碎或碾碎，再进行浆渣分离，用水或缓冲液进行提取，操作复杂、成本高。这种从植物中直接提取纯淀粉酶的方法得率低，酶的产量低，酶活力低，费时费力，而且含有一些其他可溶性成分，品质粗糙。并且植物来源的β -淀粉酶受季节影响，来源有限，不能实现工业大规模连续生产，难以实现持续化的商业利润。且大麦、大豆等价格持续高涨,其成本愈来愈大,满足不了对淀粉酶的需求。植物来源的β_淀粉酶耐热性比微生物来源的差，所以开发微生物来源的β_淀粉酶分离纯化方法非常重要。微生物深层发酵生产，可以实现大规模工业化自动化生产。随着人们生活水平的提高，食品行业和啤酒行业生产的迅速发展，开发生产高质量耐高温淀粉酶是当前研究工作的重点。针对上述植物来源生产淀粉酶存在成本高、产品杂质含量高、耐热性差等问题，本发明提供一种野生型枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis6-7发酵液高效地分离纯化耐高温β-淀粉酶的方法。同时，本发明利用来源广泛的木薯粉、豆柏粉作为培养基成分发酵生产β -淀粉酶，显著降低了生产成本，为工业化生产奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术是通过一系列分离纯化手段的实施，提供一种从B.subtilis6-7发酵液分离纯化耐高温β -淀粉酶的方法，该菌株在申请人此前的发明申请中(相关专利申请号:201010167019.7)已经公开了，并且此前已经提交了保藏证明和存活证明。该方法能够得到电泳级纯度的β_淀粉酶。并且纯酶可以用于酶学性质的研究，能够用于进一步的质谱鉴定分析及其他理化性质研究。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案:以木薯粉、豆柏粉为培养基原料，配制培养基，利用优化的产酶条件进行摇瓶发酵培养。分离纯化工艺特征是:(I)发酵液经4°C冷冻离心分离，收集上清液，即为粗酶液；(2)硫酸铵沉淀:在粗酶液中添加硫酸铵至饱和度为30%，4°C静置4h，冷冻离心，去除沉淀，收集上清液；继续添加 硫酸铵至饱和度为60%，4°C静置4h，冷冻离心，去除上清液，收集沉淀，用pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液复溶；(3)透析除盐:在同样的pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液进行透析，用相对分子截留量为IOKDa的透析袋；(4) HiTrap Q Fast Flow:将透析样品上样到 HiTrap Q Fast Flow 柱阴离子交换层析积累浓缩，A 液为 pH8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，B 液为 pH8.0、20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4/lmol/L NaCl缓冲液，用O lmol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，在B液为20% 30%时，目的蛋白淀粉酶洗脱下来(如附图1)；(5)超滤除盐:使用超滤离心管在冷冻低温低速下离心超滤除盐，4°C、3800r/min离心；(6)MonoQ5/50GL:将保留液进一步通过高效率的MonoQ5/50GL柱离子交换分离(如附图2)；(7)凝胶分子筛分离:对收集到的洗出液进一步的凝胶分子筛S^hadex G_75柱分离，去除小的杂蛋白。将纯化的酶液进行SDS-PAGE电泳分析纯度(如附图3)、酶学性质研究及基质辅助激光解析飞行时间质谱鉴定分析。所述的枯草芽孢杆菌耐高温β -淀粉酶分离纯化方法，所述的优化培养获得高产β-淀粉酶发酵液包括:(I)本发明所用的菌种为枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7，种子培养基为LB培养基:I %胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、I % NaCl。(2)将甘油冻管保藏的菌株在10mL/50mL的LB培养基中活化培养12h，再转接至新鲜的50mL/250mL的摇瓶LB培养基中培养12h作为二级种子。(3)优化培养基:2%木薯粉、4%豆柏粉、0.1%磷酸氢二铵、0.00139%硫酸亚铁、
0.6%柠檬酸钠、0.4%磷酸二氢钾、0.0005%硫酸锌、0.0123%硫酸镁、0.0111 %氯化钙，pH7.00 500mL摇瓶装液量为250mL培养基，121°C灭菌20min。(4)将二级种子按接种量4%接种于发酵优化培养基中。转速160r/min、培养温度37 °C摇瓶培养60h。所述的枯草芽孢杆菌耐高温β -淀粉酶分离纯化获得的纯β -淀粉酶进行酶学性质研究包括:(I)最适反应温度及温度稳定性:在分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80°C测定淀粉酶活力，确定最适反应温度；在50、55、60、65、70、751:不同温度下处理酶液不同时间，测定残留酶活力(如附图4)。
(2)最适反应pH及pH稳定性:将酶液于pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中测定β -淀粉酶的活力，确定最适反应PH ;在pH3.0,4.0,5.0,6.0,7.0、
8.0下处理酶液不同时间，测定残留酶活力(如附图5)。(3)金属离子及EDTA对酶活的影响:在酶反应体系中分别加入lmmol/L的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+等8种金属离子和EDTA。并设置不加金属离子空白组，然后测定各组的酶活(如附图6)。通过本发明，成功分离纯化到电泳纯的淀粉酶，建立了一种野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7发酵液高效地分离纯化β -淀粉酶的方法，回收率高达18.66%,纯化倍数为4.83，酶活达245395U/mg。
附图1是HiTrap Q Fast Flow(强阴离子交换树脂)离子交换层析谱图，峰A为β -淀粉酶附图2是monoQ5/50GL (强阴离子交换树脂)层析谱图，峰A为β -淀粉酶附图3是SDS-PAGE电泳图，甬道I 10分别为:1.B10-54发酵液；2.硫酸铵沉淀；3.DEAEpH8.0 ；4.HiTrap Q FF ρΗ8.0 ；5.HiTrap Q FF ρΗ7.5 ；6.SP ρΗ6.0 ；7.marker ； 8.sephadex G-75 ；9.monoQ ρΗ8.0 ；10.marker附图4是β -淀粉酶温度稳定性附图5是β -淀粉酶pH稳定性附图6是金属离子及EDTA对酶活影响
具体实施例方式枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7耐高温β -淀粉酶分离纯化方法，本发明将用实施例进行进一步的详细说明，但不以任何方式限制本发明。实施例1微生物枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7发酵制备发酵液粗酶液。将甘油冻管保藏的菌株B.subt i I i s6-7在10mL/50mL的LB培养基中活化培养12h，再转接至新鲜的50mL/250mL的摇瓶LB培养基中培养12h作为二级种子。优化培养基:2%木薯粉、4%豆柏粉、0.1 %磷酸氢二铵、0.00139%硫酸亚铁、0.6%柠檬酸钠、0.4%磷酸二氢钾、0.0005%硫酸锌、0.0123%硫酸镁、0.0111%氯化钙，？!17.0。500mL摇瓶装液量为250mL培养基，121 °C灭菌20min。将二级种子按接种量4%接种于发酵优化培养基中。转速160r/min、培养温度37°C摇瓶培养。发酵培养60h后，收集发酵液，进行4°C、8000r/min离心20min，收集上清液作为粗酶液。实施例2微生物枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7耐高温β -淀粉酶的分离纯化。首先绘制硫酸铵盐析曲线。取7个瓶子，分别装等量IOOml粗酶液，按硫酸铵饱和度表加入不同的硫酸铵固体克数，分别达到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%饱和度，静置过夜，离心收集沉淀，用ΡΗ6.0的柠檬酸缓冲液复溶，测定酶活，以初始相对酶活为100%，绘制盐析曲线。粗酶液中加硫酸铵，依据盐析曲线，30 %饱和度离心弃沉淀，除去杂蛋白，60 %饱和度离心收集沉淀，将目的蛋白β -淀粉酶沉淀出来。用pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液复溶沉淀，装入分子截留量为5K的透析袋中，浸没于同样缓冲液中，不断更换缓冲液，透析除盐。将透析后的样品上样到HiTrap Q Fast Flow强阴离子交换柱中，A液:pH8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液、B液:A液中含lmol/L的NaCl用10个柱体积的A液平衡柱子，用ImL进样环进样，流速为lmL/min，接着用5个柱体积的A液洗柱，去除未结合的杂蛋白，然后根据A液、B液配比，进行O 100% B液的线性梯度洗脱。对收集到的每管流出液检测酶活，确定目的蛋白的洗脱特征。接着对目的蛋白的流出液放在一管中，进行超滤离心管离心除盐。将保留液上样到MonoQ5/50GL中进行进一步高柱效的分离，操作步骤与HiTrap Q Fast Flow类似。对收集到的酶液进行凝胶分子筛分子,用pH为6.0的20mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液洗脱，便于酶液储存在pH6.0的缓冲液环境下。对上述纯化步骤计算每一步的酶活、蛋白质含量、回收率、纯化倍数。得到的β_淀粉酶回收率为18.66%，纯化倍数为4.83，酶活达245395U/mg。实施例3微生 物枯草芽孢杆菌B.subtilis6-7耐高温β -淀粉酶的酶学性质分析。最适反应温度及温度稳定性:在分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80°C测定β -淀粉酶活力，确定最适反应温度；在50、55、60、65、70、75°C不同温度下处理酶液不同时间，测定残留酶活力。最适反应pH及pH稳定性:将酶液于pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中测定β -淀粉酶的活力，确定最适反应PH ;在？!13.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0下处理酶液不同时间，测定残留酶活力。金属离子及EDTA对酶活的影响:在酶反应体系中分别加入 lmmol/L 的 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+ 等 8 种金属离子和 EDTA0 并设置不加金属离子空白组，然后测定各组的酶活。对获得的纯酶经SDS-PAGE跑胶，切胶，用100mmol/LNH4HC03/30 % ACN脱色清洗，用100%六0抑兑水，100_01/1順4!10)3、100_01/0)1'1\561:孵化301^11还原蛋白质，去上清用100% ACN 脱水，100mmol/LNH4HC03,200mmol/LIAA 暗处处理 20min，去上清加 100% ACN 脱水，冻干，加2.5ng/l.! L胰蛋白酶液4°C处理lh，再加入2 5mmo I/LNH4HCO3缓冲液，37°C反应过夜，吸出酶解液，点靶板。上机，进行质谱分析。通过质谱图谱，可知纯化的目的条带65K左右下面一条细小条带跟β_淀粉酶时同种蛋白，是β_淀粉酶的降解小蛋白。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌耐高温β-淀粉酶分离纯化的方法，所述的高温β-淀粉酶来自:高产β-淀粉酶的枯草芽孢杆菌6-7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CTCC Μ2009200。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，野生型菌株6-7利用木薯粉、豆柏粉发酵生产胞外β -淀粉酶，在100mL/500mL摇瓶发酵培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分离纯化具体步骤包括: (1)利用优化的高产淀粉酶培养方式发酵，获得的发酵液8000r/min、4°C冷冻离心20min ； (2)离心上清液添加硫酸铵至30%饱和度，静置4小时，8000r/min、4°C冷冻离心20min去沉淀，除去杂蛋白； (3)继续添加硫酸铵至60%饱和度，离心收集沉淀，使β-淀粉酶沉淀出来，用ρΗ8.0、20mmol/L 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液复溶； (4)在同样的pH8.0、20mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液进行透析，用相对分子截留量为IOKDa的透析袋； (5)将透析样品上样到HiTrapQ Fast Flow柱阴离子交换层析积累浓缩，A液为ρΗ8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 缓冲液，B 液为 ρΗ8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4/ImoI/LNaCl缓冲液，用O lmol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，在B液为20% 30%时，目的蛋白β-淀粉酶洗脱下来； (6)将洗脱收集液用分子截留量为5Κ的超滤离心管冷冻低温低速离心脱盐，降低电导至NaCl含量低于50mmoI/L以下，处理保留液上样到MonoQ5/50GL柱，A液为pH8.0、20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4 缓 冲液，B 液为 ρΗ8.0,20mmoI/LNa2HPO4-NaH2PO4/ImoI/LNaCl 缓冲液，进一步高分辨率、高结合率精细纯化； (7)根据目的蛋白分子大小65KDa左右选择合适的凝胶柱，将洗脱收集液上样到Sephadex G-75,进一步去除小分子杂蛋白； (8)对分离到的酶液经SDS-PAGE电泳验证纯度，得到的β-淀粉酶回收率为18.66%,纯化倍数为4.83，酶活达245395U/mg。
4.对纯化的电泳级β_淀粉酶酶学性质分析，其最适温度为65°C、最适pH为6.0。
5.如权利要求4所述最适条件下测定，β-淀粉酶在65°C处理lh、2h、3h后残留酶活分别为 72.34%,33.2%,9.36%，在50°C处理 lh、2h、3h后残留酶活分别为 100%,99.91%,98.86% ;在37°C、4°C放置几天酶活几乎没有损失。
6.如权利要求4所述，β-淀粉酶在ρΗ4、5、6、、7、8处理15h后残留酶活为90%以上，在pH3处理15h后残留酶活为84.95%。
7.如权利要求3所述，经纯化所得β-淀粉酶在添加Mg2+、Ni2+后酶活为对照组的125.34%、123.10%，说明Mg2+、Ni2+对酶具有激活作用；在添加Mn2+、Cu2+、EDTA后，酶活为对照组的43.27%,87.93%、69%，说明Mn2+、Cu2+、EDTA对酶具有一定的抑制作用。
8.如权利要求3所述，纯化的β-淀粉酶目的条带下有一降解小条带，基质辅助激光解析电离质谱(MALD1-T0F)分析鉴定该条带为β-淀粉酶降解蛋白。
全文摘要
本发明属生物工程酶制剂技术领域，涉及建立一种野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis6-7发酵液分离纯化耐高温β-淀粉酶的方法。该菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCC M2009200。其特征在于采用野生型菌株B.subtilis6-7，以木薯粉、豆粕粉为碳氮源，获得的发酵液冷冻离心、硫酸铵沉淀、透析除盐、HiTrap Qff离子柱交换、超滤离心管超滤除盐、monoQ5/50GL离子柱交换、Sephadex G-75分离。得到的β-淀粉酶回收率为18.66％，纯化倍数为4.83，酶活达245395U/mg。对分离纯化的纯β-淀粉酶进行酶学性质研究，其耐热性好，pH5-8条件下稳定，质谱鉴定为β-淀粉酶。所得的产品纯度高，无色，可以达到食品级β-淀粉酶标准的要求。本发明建立的β-淀粉酶分离纯化工艺简单，便于操作，回收率高，酶活达24万单位/毫克。
文档编号C12N9/26GK103224920SQ201310043509
公开日2013年7月31日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者饶志明, 邹艳玲, 徐美娟 申请人:江南大学