专利名称：一种人参pdr跨膜转运蛋白基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种人参PDR跨膜转运蛋白基因的启动子。
背景技术：
人参0°.ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物,是名贵中药材。人参中含有多种药用成分，其中人参皂苷是人参最主要的活性成分。目前已从人参根中分离出50余种人参皂苷，现代医学研究证明各皂苷单体具有重要的药用价值，且已广泛应用于临床，但其中一些具有抗肿瘤、抗衰老、抑制细胞凋亡和增强免疫力等活性强的皂苷含量极低。因此，利用人参皂苷合成代谢相关的基因调控技术促进人参皂苷的合成与积累具有重要的理论价值和应用前景。基因的有效转录和表达是发挥其基因功能的重要条件，基因成功转录和表达需要依靠启动子对其调控。启动子与RNA聚合酶、转录调控因子等相互作用发挥其调控功能。真核生物中的TATA和CAAT框，它们决定了转录的起始位点和效率，负责和RNA聚合酶结合，启动基本转录过程。启动子组件有许多不同的类型，包括病原诱导型作用元件、组织特异型作用元件和化学诱导作用元件等。其中化学物质诱导型作用元件在促进次生代谢产物合成方面起重要作用。在次生代谢产物合成与积累相关基因的表达过程中，顺式作用元件通过与转录因子的相互作用发挥着重要调控作用。环境刺激经过一系列信号转导、传递后，激活防卫相关转录因子与特异顺式作用元件的相互作用，从而实现相关防卫功能基因的表达。鉴于顺式作用元件的上述重要调控作用，使用诱导型启动子介导的抗性基因无疑具有多方面的优势，因此鉴定次生代谢产物合成与积累相关的诱导型启动子已成为目前植物分子生物学研究的热点之一。在人参次生代谢 调控中，可以通过导入关键酶等基因调控合成途径中的多步限速反应，或者通过顺式作用元件在转录水平调控人参皂苷合成、转运和积累相关基因的表达，从而提高人参皂苷的含量。植物ABC (ATP-binding cassette transporter)转运蛋白是目前已知最大，功能最广泛的蛋白家族，ABC转运蛋白属跨膜运输蛋白，利用水解ATP释放的能量转运有机酸、生物碱、细胞代谢产物和药物等。参与细菌耐药性、次生代谢产物积累、胁迫反应和肿瘤抗药性等。ABC转运蛋白家族包括多向耐药性蛋白(pleiotropic drug resistance,PDR),多药耐药性蛋白(multidrug resistance, MDR)等。PDR是其中最大的亚族,是植物和真菌中特有的一种ABC转运蛋白。但目前对植物PDR基因相关研究甚少，离体细胞培养中，香紫苏醇可诱导層基因上调表达，在细胞内NpTORl蛋白累积增强了细胞向胞外转运香紫苏醇以及其类似物的能力。拟南芥(A细胞内香紫苏醇的累积亦能诱导
基因上调表达，同时在细胞外检测到AtH)R12蛋白向胞外转运的香紫苏醇，推测萜类物质可能是基因表达的上游调控物质。矮牵牛中PhTORl蛋白可以转运一种新发现的植物激素-独角金内酯，进而促进矮牵牛分枝。因而，PDR转运蛋白基因在调控次生代谢产物的积累方面具有重要的潜力。然而，在本发明的研究之前，尚无人参PDR蛋白基因启动子及其调控元件的报道。
发明内容
本发明旨在从人参中分离出一种人参PDR跨膜转运蛋白基因启动子，从而提供一种能够调控人参皂苷转运与积累相关的基因资源。为了达到上述目的，本发明提供了一种调控人参皂苷转运与积累的基因的启动子ProPDR2，其序列如SEQ ID N0.1所示，或是与SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。本发明所述的启动子ProH)R2的制备方法为:提取人参根基因组总DNA，以人参根总DNA为模板，构建四个启动子文库-.Dral文库、￡boR V文库、Pvu II文库和Stu I文库；分别以构建的文库、AcoR V文库Ira II文库和泣w I文库为模板，根据人参基因的5 '端序列设计引物；进行PCR扩增；胶回收PCR产物，该产物即得本发明所述的ProPDR2启动子。在本发明的启动子的制备中，用于扩增ProH)R2启动子的引物对如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 所示。本发明还提供了含有ProH)R2启动子的重组载体pBI121_ProroR2::⑶S，具体构建方法为:选择植物表达载体PBI121，将ProPDR2启动子连接到空载体pBI121中，获得ProPDR2启动子驱动的⑶S报告基因的重组载体pBI121-ProTOR2::⑶S。ProTOR2启动子亦可克隆到其他空载体中，或制备成转基因细胞及重组菌。本发明还通过异源表达鉴定证明启动子ProPDR2驱动的⑶S基因表达具有组织特异性且受茉莉酸甲酯和人参皂苷等化学物质的诱导，这表明本发明的启动子Pr0H)R2可在植物基因工程领域中用于调控人参皂苷转运与积累，并可用于优良人参品种的培育。本发明利用现有 的植物基因工程技术，根据已克隆的人参PgPDR2基因的5'端序列，采用Genomewalker技术分离ProF1DI^启动子序列，构建ProPDR2::⑶S报告基因的重组表达载体，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过异源表达鉴定证明启动子ProPDR2对⑶S报告基因转录与表达的驱动功能，ProH)R2驱动的⑶S基因表达具有组织特异性且受茉莉酸甲酯和人参皂苷等化学物质的诱导。这表明所述启动子Pr0H)R2具有促进调控人参皂苷转运和积累方面的功能。因此，通过本发明的启动子或其衍生物能调控或改良人参及其它植物，获得人参皂苷含量高的优良植物品种。这为后续克隆人参皂苷转运信号途径中的关键的调控转录因子基因，以及通过转基因方法调控人参皂苷等萜类化合物的转运与积累等奠定了基础。
图1是本发明扩增的人参ProPDR2启动子片段电泳结果；图中，I表示PCR扩增产物，M表不Marker ；
图2是本发明扩增的人参Pr0H)R2启动子顺式作用元件分析 图3是转基因烟草中扩增的人参Pr0H)R2启动子片段电泳结果；图中，广5表示PCR扩增产物，M表示Marker ；
图4是本发明的启动子Pr0H)R2启动⑶S报告基因在转基因烟草不同组织中的表达水平 图5是本发明的启动子ProPDR2启动⑶S报告基因在IOOiiM MJ,50uM SA,20uM ABA和20mg/L人参总皂苷诱导下表达水平图；其中:MJ为茉莉酸甲酯、SA为水杨酸、ABA为脱落酸、GS为人参皂苷。
具体实施例方式以下详细说明本发明的具体实施，所有对实施例的说明不应理解为对本发明保护范围的限制。实施例1启动子ProPDR2的获得
1、人参根DNA提取及其启动子文库的构建
取吉林长白山人参产 区四年生人参根，自来水浸泡45min后冲洗2次，先用75%乙醇浸泡30秒(sec)，无菌水冲洗2次。参考Omega Plant DNA Kit (Omega公司)说明提取基因组DNA,以人参根总DNA为模板,按照Genomewalker试剂盒(Takara公司)说明书构建DraI文库(DLl) ,BcoR V 文库(DL2)、Pvu II 文库(DL3)和泣w I 文库(DL4)。2、引物设计和PCR扩增 (I)引物设计与合成
根据已克隆的人参PGPDR2基因(登录号为KC013237，专利申请号为201210462288.5)的5'端基因序列，设计外侧引物和和巢式引物,采用Primer Premier 5.0软件设计引物如下:
Pro2-SP:5' -GTCAAAGGTCGGGAGTTTCTCAAGGGA-3' ；(SEQ ID N0.2)
Pro2-Nest-SP:5' -GACCTCCATTCCATTGCTCCTCCATAC-3'。(SEQ ID N0.3)
引物由上海英骏生物有限公司合成。(2) PCR 扩增
分别以构建的DL1、DL2、DL3和DL4四个启动子文库为模板，利用Prol-SP引物与试剂盒中外侧引物 APl (5’ - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’)进行第一轮 PCR 扩增。反应体系为:10XPCR缓冲液 L、MgCl2 (25mmol/L) 5 y L、dNTP (2.5mmol/L)8 ii L、Prol-SP (10 u mol/L) 2 u L, API (10 u mol/L) 2 u L、文库 DNA I u L、ddH20 26.5 u L和 LA Taq DNA polymerase (5 U/U L) 0.5 U L0反应条件为:94°C变性25sec，72°C延伸3min，7个循环；94°C变性25sec、67°C退火3min、32个循环；72°C延伸IOmin0将上述第一轮PCR产物稀释50倍，再以试剂盒中提供的巢式引物AP2(5，- ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3，)和 Prol-Nest-SP 引物，以上述同样体系，94 °C 变性25sec，72°C 延伸 3min，5 个循环；94°C 变性 25sec，67°C 退火 3min、25 个循环；72°C 延伸IOmin0 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。(3)扩增片段胶回收、连接、测序及分析
将PCR产物胶回收后连接至pGEM-T Easy载体上，并转化大肠杆菌DH5 a，将重组质粒pGEM-Pi~0roR2送上海英骏公司测序。测序后获得的序列长度为1362bp的基因片段，对获得的基因序列与基因5’端重叠区序列进行比对，经比对准确无误后，对克隆的序列米用 PlantCARE(http://bioinformatiCS.psb.ugent.be/webtools/plantCare/html/)在线分析工具对所克隆的启动子片段进行顺式元件分析，分析结果见图2，结果表明克隆的序列含有启动子应有的基本元件(TATA-Box和CAAT-Box)和多种顺式作用元件。其序列表中SEQ ID N0.1 所示。实施例2植物表达载体的构建及转化
1、植物表达载体的构建
(I)根据启动子序列设计片段相对应的包含III/Bam HI酶切位点的特异性引物，上下游引物分别命名为Pl和P2。Pl:5' -CGCGGATCCTCATTCACCCATCGTAGTCCA-3' ；(SEQ ID N0.4)
P2:5' -CCCCAAGCTTACATGTAGATCCCAACAATAA-3'。(SEQ ID N0.5)
分别用历'fld III取Bam HI双酶切pBI121和ProPDR2，回收pBI121载体和ProPDR2启动子片段。将两片段连接并转化DH5a，通过卡那霉素筛选、PCR和"i/ d III/Bam HI双酶切鉴定获得重组子，重组质粒命名为pBI121-ProPDR2::⑶S。(2)根癌农杆菌感受态细胞的制备
①在含有IOOii g/mL利福霉素的YEB平板上划线培养农杆菌EHA105，28°C暗培养2d。②挑取单菌落接种到含有100 U g/mL利福霉素的YEB培养基中，28°C振荡培养过夜。③将过夜活化的农杆菌按1:50的比例稀释到50mL含有100 U g/mL的卡那霉索的YEB培养基中，28°C振荡培养至0D600约为0.4-0.6，冰浴30min。④于4°C, 5000rpm 离心 IOmin,弃上清液,用 10mT, 0.15mM NaCl 悬浮菌体。⑤于4°C, 5000rpm离心IOmin,弃上清液,用2mL 20 mM CaCl2悬浮菌体。⑥每管200 ii L分装，液氮速冻，_70°C保存。(3)根癌农杆菌感受态细胞的转化
①将根癌农杆菌感受态细胞置于冰上，缓慢解冻。②加入0.5 ii g pBI121- ProPDR2 质粒 DNA，轻轻混匀，冰浴 30min。③置液氮中冷冻2min，迅速移入37°C水浴中热激5min，再迅速冰浴2min，之后加A 800 u L YEB液体培养基，于28 °C振荡培养3_4h。④5000rpm离心5min沉淀菌体,弃掉800ii L上清后重新悬浮菌体,均勻涂布于含有100 u g/mL利福霉素和50 u g/mL卡那霉素的YEB培养基上，28°C培养2_3d。(4)根癌农杆菌质粒提取和鉴定 ①PCR鉴定
挑取转化的农杆菌单菌落接种于1.5mL含卡那霉素的LB液体培养基中37°C振荡培养，用Pi*0roR2启动子特异性引物进行鉴别，引物如下:
P3:5' -AATTTGTTGGGGGCAGTAGGT-3' ；(SEQ ID N0.6)
P4:5' -GGTCGGTCTTTCACGCTTTG-3' ；(SEQ ID N0.7)
PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测是否含有预期片段。PCR反应程序如下:94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 30sec，35 个循环；72°C 2min。②酶切鉴定
挑取PCR鉴定为阳性的农杆菌单菌落接种于含有100 u g/mL的利福霉素和50 u g/mL的卡那霉素的YEB培养基中， 28°C培养过夜培养，提取重组质粒pBI121-ProroR2::⑶S，采用上述方法以历id III/Bam HI双酶切提取的质粒。经过酶切鉴定正确后获得含重组质粒pBI121-ProPDR2: AUS 的农杆菌。2、基因转化和转基因烟草的筛选
(I)含pBI121-ProroR2::⑶S质粒的根癌农杆菌培养
28°C划线培养含有pBI121-ProroR2::⑶S质粒的农杆菌约2d。挑取单菌落接种于含有100mg/L利福霉素和50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28°C振荡培养过夜，至0D600约为0.6时收集菌液，4000rpm离心lOmin，沉淀重悬于1/2MS液体培养基中。(2)叶盘法侵染烟草
将烟草benthamiana )幼叶置于自来水中冲洗3_4次,然后在70%乙醇中浸泡30-60sec，10%次氯酸钠中消毒10_20min，再用无菌水充分冲洗，然后置于无菌培养皿中，将叶片切成0.5-1 cm2的小片，将剪好的叶片分别放入含有pBI121-ProroR2::⑶S质粒的农杆菌菌液中侵染5min，将叶片上的菌液用无菌滤纸吸干。(3)共培养
侵染过并吸干表面菌液的叶盘，气孔面朝上，紧靠着放在共培养基上(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L)，黑暗处培养 2d。(4)筛选及分化培养
暗培养2d后，转换到筛选分化培养基上(MS+6-BA 1.0mg/L+IAA 0.lmg/L+Kan IOOmg/L+Cef 300mg/L),每15d换一次筛选分化培养基,至分化出的烟草长至3_5cm时转至生根培养基中。 (5)生根培养
将分化至3-5cm的烟草分别切下，转移至生根培养基(1/2MS+IBA 2.0mg/L)。(6)移栽
当再生植株的根长至5-8cm时，打开封口膜炼苗2-3d，将幼苗移栽至花盆内，移栽后最初的5-10d罩上透明塑料，保持90%-100%的湿度，并在罩上打些小孔以利于气体交换。移栽的基质以及花盆均预先消毒。(7)转基因植株PCR鉴定
以转基因植株的基因组DNA为模板，采用上述重组质粒鉴定所用的ProroR2基因特异性引物(P3和P4)进行PCR扩增，PCR反应体系和反应条件同上。转基因烟草植株PCR检测结果见图3，其中广4号为转化pBI121-ProroR2::⑶S成功并分化成苗的Ttl代阳性转基因植株，5号为转空载体pBI121成功并分化成苗的Ttl代阳性转基因植株。(8 ) ProPDR2启动⑶S表达及其活性检测
利用GUS能与底物MUG (3,4-甲基伞型酮-￠-葡萄糖醛酸苷)反应产生荧光物质MU(4-甲基伞型酮)。MU的激发波长为365nm,发射波长为456nm,其含量可由突光分光光度计测出。根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测GUS含量。试剂配制:lmol/LNa2HPO4 溶液:35.814g Na2HPO4 溶于 IOOmL 水。lmol/L NaH2PO4溶液:15.601g NaH2PO4溶于 IOOmL水。0.1M磷酸缓冲液(pH7.0): lmol/L 似2册04取5.1lmL,lmol/L NaH2PO4 取 4.23mL，定容至 100mL。10% SDS 溶液:将 90mL水稍微加热，加 IOg SDS,搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节pH至7.2，然后加水定容至IOOmL150.5 M EDTA (pH8.0):在80mL水中加入18.61g Na2EDTA*2H20,用NaOH调pH至8.0 (约需2g左右的固体NaOH)，溶解后定容至IOOmL0 GUS酶提取液:0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)取50mL ；10% SDS取ImL ；0.5MEDTA(pH8.0)取 2mL;Triton X-100 取 100 y L ; 3 -巯基乙醇 IOOyL;用水定容至 IOOmL0MUG底物:称8.8mg MUG，溶于IOmL⑶S酶提取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。反应终止液(0.2 mol/L Na2CO3):称2.12g Na2CO3，用水定容至100mL。考马斯亮蓝G250溶液:考马斯亮蓝G250 IOmg, 95%乙醇5ml, H3PO4 IOmL,定容至IOOmL,过滤后4°C保存。I mg/mLBSA:20mg BSA，用GUS提取缓冲液定容至20mL。①植物总蛋白的提取
取转基因植株新鲜的植物组织IOOmg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于_80°C冰箱。将研磨破碎的组织转到Ep管里，并立即加入ImL的⑶S提取缓冲液，充分混匀。12，000rpm，4°C离心5min，将上清转至另一洁净的Ep管，冰上放置待用。②蛋白浓度的测定
取 7 个 Ep 管，分别加入 0 ii L、2 ii L、4 ii L、8 u LU2u L、16u L,20u L 的 BSA 标准液，用水补至相同体积20 u L0加入980 u L的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度(mg/mL)对吸收值A595做标准曲线。取待测蛋白样品10 iiL，加IOii L水，加入980 ii L的考马斯亮蓝G250溶液，充分混匀，冰上静置5min，用紫外分 光光度计测定595nm处的吸收值，计算蛋白样品的浓度。③⑶S表达水平的定量测定
取IOOiI L蛋白上清，加入400 i! L 37°C预热的⑶S提取缓冲液里，再加入500 i! L MUG底物，37°C温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200 y L加入到800 u L反应终止液，室温避光保存。用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝IOnm时测定不同时间点的荧光强度值。以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。图4和图5分别为不同组织和不同诱导物作用下转基因烟草中GUS活性与对照烟草(转PBI121空载体)的相对值(倍数)。图4显示ProPDR2启动子表达具有明显的组织特异性，其在茎中的活性最高，根中次之。图5结果显示ProPDR2启动子受茉莉酸甲酯(MJ)、水杨酸(SA)和人参皂苷(ginsenosides，GS)的诱导，ProPDR2启动中包含茉莉酸甲酯诱导的顺式作用元件(TGACG-motif)、水杨酸响应顺式作用元件(TCA-element)，因此表明ProPDR2启动子的应答反应与这些顺式作用元件有关，该启动子受人参皂苷的诱导，表明该启动子与人参皂苷转运与积累有关。
权利要求
1.一种人参PDR跨膜转运蛋白基因启动子，其特征在于:所述启动子序列如SEQ IDN0.1所示，或是与SEQ ID N0.1具有99%以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的启动子,其特征在于:所述启动子包括ERE元件、TCA元件、TGACG-Motif 和 W-Box。
3.如权利要求1或2所述的启动子的制备方法，其特征在于依次为下列步骤:(I)提取人参根基因组总DNA，以人参根总DNA为模板，构建四个启动子文库:Dra I文库、EcoR V文库、Pvu II文库和Stu I文库；(2)分别以构建的Dra I文库、EcoR V文库、Pvu II文库和Stu I文库为模板，根据人参PgPDR2基因的5'端序列设计引物，进行PCR扩增；(3)胶回收PCR产物，该产物即得本发明所述的Pr0H)R2启动子。
4.根据权利要求3所述的启动子的制备方法，其特征在于:所述根据人参PgPDR2基因的5 '端序列设计的弓I物包括外侧弓丨物Pro3-SP和巢式弓I物Pr03-Nest-SP，外侧弓I物Pro3-SP 如 SEQ ID N0.2 所示，巢式引物 Pro3-Nest_SP 如 SEQ ID N0.3 所示。
5.含有权利要求1或2所述的启动子的重组载体，其特征在于:所述重组载体为pBI121-ProPDR2::⑶S，所述空载体为pBI121载体，在ProPDR2启动子的下游连接⑶S报告基因。
6.如权利要求5所述的重组载体的构建方法，其特征在于依次为下述步骤:(I)根据启动子序列设计片段相对应的包含历'fld III/Bam HI酶切位点的特异性引物，分别用及 HI和Afco I双酶切pBI121和启动子ProPDR2，回收pBI121载体和ProPDR2启动子片段；(2)将PBI121和ProPDR2两片段连接并转化DH5a ; (3)通过卡那霉素筛选、PCR和及 HI/AfcoI双酶切鉴定，即获得所述重组载体pBI121-ProroR2::⑶S。
7.根据权利要求6所述的方法`，其特征在于:在所述步骤(I)中根据启动子序列设计片段相对应的包含历'fld III/Bam HI酶切位点的特异性引物如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:步骤(3)中PCR鉴定的引物对如SEQID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示。
9.根据权利要求1或2所述的启动子ProPDR2在调控人参皂苷转运积累和人参育种中的应用。
10.根据权利要求5所述的的重组载体pBI121-ProroR2::⑶S在调控人参皂苷转运积累中和人参育种中的应用。
全文摘要
本发明公开一种人参PDR跨膜转运蛋白基因启动子ProPDR2及其应用，所述启动子至少含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或是与SEQIDNO.1具有99%以上同源性的DNA序列，该序列包含ERE元件、TCA元件、TGACG-Motif和W-Box。本发明还构建了启动子表达载体pBI121-ProPDR2::GUS，并研究表明在该启动子启动表达GUS的转基因烟草中可较强地受人参皂苷、水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸的调控，表明该启动子参与调控人参皂苷的转运和积累，可以通过该启动子或其衍生物调控或改良人参及其它植物。
文档编号C12N15/10GK103103193SQ20131004366
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者罗志勇, 张儒, 曹宏哲, 黄景嘉, 陈湘晖, 杨芳 申请人:中南大学