专利名称：梭菌auh-jlc39及其在鸢尾黄素转化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种菌株及其应用，尤其是一种梭菌AUH-几C39及其在鸢尾黄素转化中的应用。
背景技术：
葛花又称葛条花，为豆科植物野葛O0Weraria lobata (Wild.) Ohwi)或甘葛藤iPueraria thomsonii Benth.)的干燥花蕾。据中华人民共和国药典记载，葛花性甘、凉，用于解酒醒脾，治伤酒发热，烦渴，不思饮食，长期以来被用于缓解酒后呕吐等症状。药理学研究结果表明，葛花具有 护肝、降血糖、降血脂以及类雌激素等多种药理活性。葛花是我国传统中药，其主要药效成分是异黄酮类化合物，葛花中的异黄酮主要由葛花苷(kakkalide)、次葛花苷(Kakkalidone)、鳶尾黄素(tectorigenin)、鳶尾苷(tectoridin)、尼泊尔鳶尾异黄酮(irisolidon)等多酹轻基化合物组成,尽管产地不同各组分含量也有明显差异，但一般以葛花苷含量最高。有研究表明，葛花苷、次葛花苷和鸢尾苷等结合型糖苷在酸性条件下可被水解为鸢尾黄素费廣芬，2008，4:24-26);实际上，葛花不管是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，葛花中的众多药理活性成分均存在被胃肠道微生物菌群降解的可能性。Yong Chen等就曾在灌喂鸢尾苷的大鼠尿液中检测到了鸢尾苷代谢产物鸢尾黄素和二氢鸢尾黄素iPharm.Pharmacol.,2008,60:709-716),由于从未有人在天然葛花提取物中检测到二氢鸢尾黄素，因而推测是大鼠肠道微生物菌群将鸢尾苷转化为鸢尾黄素，鸢尾黄素再进一步被转化为二氢鸢尾黄素，但有关二氢鸢尾黄素的生理和药理活性，迄今尚未见任何报道。近年来有大量文献对鸢尾黄素的药理活性进行了报道，2011年中南大学药学院王霆教授等针对鸢尾黄素的药理作用专门撰写了综述(中康麥学，2011，9 (12):913-916)。鸢尾黄素又称鸢尾苷元，其化学名为5，7，4’ -三羟基-6-甲氧基异黄酮，鸢尾黄素在很多方面均表现出了较强的药理作用:如抗氧化和清除自由基、调节内分泌和抗骨质疏松(即类似雌激素样作用)、保护肝脏、抗癌、抗炎、降低血糖和减少糖尿病并发症、抗动脉粥样硬化、抗过敏和治疗肺纤维化等(中康身学，2011，9 (12):913-916)。一方面，代谢产物二氢鸢尾黄素与底物鸢尾黄素在化学结构上极为相似，二者在结构上的唯一差异就在于C2-C3之间是饱和键还是不饱和键。鸢尾黄素的C2-C3之间为不饱和双键，而二氢鸢尾黄素的C2-C3间则为饱和单键。由于二氢鸢尾黄素与底物鸢尾黄素结构类似，通过构效关系可以推测，代谢产物二氢鸢尾黄素应该具有与底物鸢尾黄素相似的生理和药理活性。另一方面，体外清除自由基实验结果表明，在所检测浓度范围内(0.25-1.0毫摩尔/升)，二氢鸢尾黄素对二苯代苦味酰基自由基(1，1-Diphenyl- 2-Picrylhydrazyl,即DPPH)的体外清除能力均极显著高于底物鸢尾黄素(P〈0.01)。尤为值得一提的是，相同浓度下(0.25-1.0毫摩尔/升)二氢鸢尾黄素和鸢尾黄素对DPPH自由基的清除作用均极显著高于高活性植物雌激素雌马酚(p〈0.01)。非天然产物雌马酚为大豆异黄酮黄豆苷原的微生物代谢产物，经研究证实，在一定浓度范围内，代谢产物雌马酚体外清除超氧阴离子自由基和DPPH自由基能力显著高于大豆异黄酮黄豆苷原和染料木素，同时也显著高于二氢黄豆苷原(dihydrodaidzein)、二氢染料木素(dihydrogenistein)、去氧甲基安哥拉紫檀素(0-desmethylangolensin)等大豆异黄酮的其它微生物代谢产物U办.ric.Aooi/ Chem.2010,58:11548-11552)。抗氧化实验结果表明，雌马酹的抗氧化活性是其底物黄豆苷原的100多倍(及/r.J.Cancer,1997，33:2384-2389);药理学研究表明，雌马酚在抗癌、防治骨质疏松和心脑血管疾病等方面的活性在大豆异黄酮及其代谢产物中是最高的。由于自由基常与癌症、炎症等多种疾病直接相关，利用化合物的抗氧化特性有效清除体内过剩自由基已成为一些重大疾病防治的重要手段。二氢鸢尾黄素在相同浓度下表现出远高于其底物鸢尾黄素的体外清除自由基能力，这预示代谢产物二氢鸢尾黄素的生理和药理活性会高于底物鸢尾黄素，与底物鸢尾黄素相比，产物二氢鸢尾黄素将具有更广阔的研发前景和市场竞争力。但迄今未见从自然界中分离和人工合成二氢鸢尾 黄素的报道，也未见将鸢尾黄素转化为二氢鸢尾黄素的单一微生物菌株的报道。
发明内容
本发明提供一种梭菌AUH-几C39及其在鸢尾黄素转化中的应用，解决了二氢鸢尾黄素的微生物生物合成问题及其资源匮乏问题，对新药研发具有极大的推动作用。本发明所采取的技术方案是:
一种梭菌sp.) AUH-JLC39，保藏号为 CGMCC N0.7221。墙M Clostridium sp.AUH-JLC39 (KC523278)是从鸡粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将中药葛花提取物的酸水解物(即鸢尾黄素)高效转化为二氢鸢尾黄素。有关鸢尾黄素向二氢鸢尾黄素的转化过程，推测是鸢尾黄素在菌株sp.AUH-JLC39 (为方便书写,在这里将菌株sp.AUH-JLC39简称JLC39，以下均使用该转化菌株的简称形式，菌株JLC39与W^Clostridiumsp.AUH-JLC39为同一菌株)分泌的还原酶作用下被加氢还原成二氢鸢尾黄素，根据葛花中所含异黄酮的化学结构、葛花苷在小白鼠体内代谢情况以及实验结果，推测二氢鸢尾黄素的生物合成途径可能如下图所示:
权利要求
1.一种梭菌(C/oWrit/iws sp.) AUH-JLC39，保藏号为 CGMCC N0.7221。
2.根据权利要求1所述的梭菌AUH-几C39在鸢尾黄素转化中的应用，其特征在于包括下述步骤: (1)菌株AUH-JLC39的培养 将低温冷冻保存的梭菌AUH-JLC39融化并按10-15%接种量接种到盛有新鲜BHI液体培养基的试管中，在厌氧工作站内37° C下培养20-24小时；再以10-15%接种量将试管中的菌株AUH-JLC39重新转接到盛有新鲜BHI液体的培养基中，继续在厌氧工作站内培养18-24小时作为种子液； (2)底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养与代谢产物的分离纯化 ①底物鸢尾黄素与菌株AUH-JLC39共培养 将菌株AUH-JLC39的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中培养，根据三角瓶中培养基体积加入浓度为40-60毫摩尔/升鸢尾黄素母液，使得鸢尾黄素在培养基中的浓度为0.8-1.0毫摩尔/升，然后在厌氧工作站内培养48-60小时，即可将底物鸢尾黄素高效转化为二氢鸢尾黄素； ②代谢产物的分离纯化 用等体积的乙酸乙酯将三角瓶内培养物萃取2次，萃取液过滤后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制备柱在HPLC上进行分离制备二氢鸢尾黄素。
全文摘要
本发明公开了一种梭菌AUH-JLC39，保藏号为CGMCCNo.7221，及其在鸢尾黄素转化中的应用。梭菌(Clostridiumsp.)AUH-JLC39在鸢尾黄素转化中的应用包括下述步骤将菌株JLC39的种子液按10-15%接种量转接到液体培养基中并加入底物鸢尾黄素,在厌氧工作站内静置培养48-60小时；用等体积乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液蒸干后用制备柱在HPLC上对产物进行分离制备。本发明的菌株能将鸢尾黄素高效转化为二氢鸢尾黄素，产物二氢鸢尾黄素对二苯代苦味酰基自由基(DPPH)的体外清除率极显著高于底物鸢尾黄素(p<0.01)，解决了二氢鸢尾黄素的微生物生物合成问题及其资源匮乏问题，对新药研发具有极大的推动作用。
文档编号C12P17/06GK103146598SQ20131004508
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者王秀伶, 郭常亮, 邵子强, 刘明月 申请人:河北农业大学