专利名称：一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量pcr检测方法及试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于鸭乙型肝炎病毒检测技术领域，涉及一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂。
背景技术：
1980年Mason等从家养的北京鸭体内发现鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis BVirus, DHBV), DHBV属于禽嗜肝DNA病毒，其嗜肝性、毒粒形态、结构和基因复制等方面与HBV很相似，目前，感染DHBV的北京麻鸭已成为HBV复制、感染机制研究与治疗策略评估的重要实验动物模型]。DHBV DNA的定量检测成为应用此模型的一个重要指标，以往多采用Southern blot杂交、斑点杂交等方法对DHBV DNA进行定量，由于这些方法灵敏度较低、稳定性差、操作复杂，已被定量PCR方法取代。但是，由于缺乏标准的实验动物和统一、通用的DHBV DNA定量检测方法，各地研究者往往选择本地麻鸭感染的DHBV，针对DHBV基因的不同区域建立检测方法。由于不同地区、不同鸭种感染的DHBV基因存在差异，造成了研究者实验结果缺乏可比性，借鉴已有方法也存在不确定性。既往研究针对DHBV的P基因或S基因设计引物，建立DHBV PCR检测方法，缺乏通用性，因为DHBV有不同的亚型，编码外膜蛋白和聚合酶蛋白的S基因和P基因容易变异。·
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试齐U，该方法适于不同地区、不同鸭种的定量检测，具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明是通过以下技术方案来实现:—种鸭乙型肝炎病毒的突光定量PCR检测方法,包括以下操作:I)以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增；所述的上游引物为:ggactcgaacctagaaga ；所述的下游扩增引物为:ttatttccta ggcgaggg ；所述的检测探针为:accacagttg tctatgggag aag ；2)在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧光信号；3)根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型肝炎病毒的含量。所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中。所述的DHBV Core区基因序列的获得为:以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物Fl和下游引物Rl进行PCR扩增，所述的上游引物 Fl 为:gggatccata tcaatgcttc tag ；
下游引物Rl 为:gctcgagtta tttcctaggc gag。所述的待检品的获取为:血清中加入其体积I 2倍的DNA提取液，充分混匀，100°C煮沸5 15min，4°C放置过夜，离心取上清液，得到待检品；所述的DNA提取液包括0.1 0.5mol/L的Na0H、2 1.5mol/L的NaCl、以及质量浓度为0.5 1.0%的SDS。所述的扩增体系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mMTris-HCl, 50 IOOmM KC1、1.5 3mM MgCl2，上游引物25 IOOmM,下游扩增引物25 lOOmM，检测探针5 20mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10 20%。所述的扩增体系为25 μ 1，包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/μ I,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3，IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ；上游引物0.5μ l、50mM ；下游扩增引物0.5 μ 1、50mM ；检测探针0.5 μ l、10mM ;DEPC-H209 μ I ；标准品或待检品2 μ I。所述的荧光标记物为FAM，其对应的检测波长为490nm。所述的扩增程序为:94°C预变性2min ；94°C 15s，49°C 30s，72°C 30s ；40 个循环。一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，包括标准品和PCR扩增体系；所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中；所述的PCR扩增体系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mM Tris-HCl，50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2，上游引物 25 50mM，下游扩增引物 25 50mM，检测探针5 10mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10 20%。所述的pGEM-T/DHBV Core重组质粒中的DHBV Core区基因是以以上游引物Fl和下游引物Rl对DHBV Core区基因进行PCR扩增，所述的上游引物Fl为:gggatccatatcaatgcttc tag ；下游引物Rl 为:gctcgagtta tttcctaggc gag ；所述的扩增体系为25 μ 1，包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/μ I,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3，IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ；上游引物0.5μ l、50mM ;下游扩增引物0.5 μ 1、50mM ；检测探针0.5 μ l、10mM ;DEPC-H2O 9 μ I ;模板2 μ I。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:本发明提供的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，针对C基因设计诊断PCR的引物与探针。由于DHBV核心抗原稳定性强，免疫原性强，编码核心蛋白的C基因不易变异，具有高保守性，因此，针对C基因设计诊断PCR的引物与探针可以避免S基因和P基因容易变异的缺陷，所建立的PCR方法具有通用性。本发明提供的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，所设计的引物及检测探针与多达44条序列逐一进行了比较，使所设计的引物与44条序列最大程度的匹配，使引物与DHBV序列尽可能的吻合。从而保证了能够最全面的检测世界各地不同基因型和不同鸭种感染的DHBV病毒。本发明提供的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，是一种通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好，适于不同地区、不同鸭种的DHBV DNA的Taqman实时荧光定量PCR方法。
图1为重组质粒pGEM-T/DHBV Core酶切鉴定；其中，泳道I为重组质粒pEGM_T/DHBV Core，泳道2为pEGM-T/DHBV core重组质粒BamH I和XhoI双酶切，泳道3为DNAmarker ；图2为PCR扩增产物电泳图，其中，泳道I为DNA marker，泳道2为PCR扩增产物；图3为FQ-PCR标准品扩增曲线；图4为标准品回归曲线；图5为ABI7300与Bio-RAD IQ5检测结果相关性分析；图6ABI7300与Bio-RAD IQ5检测结果差值与均值分布图。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明提供的一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，包括以下操作:I)以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增；所述的上游引物为:ggactcgaacctagaaga ；所述的下游扩增引物为:ttatttccta ggcgaggg ；所述的检测探针为:accacagttgtctatgggag aag ；2)在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧光信号；3)根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型肝炎病毒的含量。具体的，所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到PGEM-T载体中。所述的DHBV Core区基因序列的获得为:以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物Fl和下游引物Rl进行PCR扩增，所述的上游引物 Fl 为:gggatccata tcaatgcttc tag ；
下游引物Rl 为:gctcgagtta tttcctaggc gag。所述的扩增体系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mMTris-HCl, 50 IOOmM KC1、1.5 3mM MgCl2，上游引物25 IOOmM,下游扩增引物25 lOOmM，检测探针5 20mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10 20%。相应的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，包括标准品和PCR扩增体系；所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中；所述的PCR扩增体系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mM Tris-HCl，50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2，上游引物 25 50mM，下游扩增引物 25 50mM，检测探针5 10mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10 20%。下面以具体的实施例对各部分进行详细的说明。实施例1:鸭乙肝病毒荧光定量PCR诊断方法引物、探针的设计在GenBank中共检索到44条鸭乙肝病毒全基因组序列，分别来自中国(包括北京、湖北、上海、重庆、四川、桂林、河南、广东等地)和外国(美国、德国、印度、加拿大、南非、澳大利亚等)，通过DNASIS软件比较，各地DHBV基因序列存在很多差异，而不同地区报道的Core区序列bp241-414处序列基本一致，两两比较一致率最小为98%，最闻可达100%。所以，以该区域为模板，设计引物，并将多对引物与所有DHBV Core区核酸序列匹配，获得最大程度匹配的引物与探针。所设计的引物序列及荧光探针序列如下:上游引物F:DHBV bp 256-273 GGACTCGAACCTAGAAGA (Tm 值 54°C )，下游引物R:DHBV bp 397-414 TTATTTCCTAGGCGAGGG(Tm 值 54°C )，荧光探针DHBV-Probe: DHBV bp 286-308 (FAM):ACCACAGTTGTCTATGGGAGAAG (TAM RA)(Tm 值 68°C )。为使引物与44条序列最大程度的匹配，将设计的多对引物进一步与各序列进行逐一比较，尽可能使获得的引物与发布的DHBV序列吻合，上、下游引物及探针序列均斜体划线表示，不同的核酸序列大写标注。
检测结果如表I所示，引物、探针与42条DHBV Core基因序列100% —致，上游引物仅与DQ276978.1有两处差异(bp261C — T, bp270A — G)，下游引物与X12798.1有一处差异(bp397C —A)。因此可以以所设计的引物对以此区域为模板，建立用于检测DHBV DNA的通用、准确的实时荧光定量PCR方法。表1:GenBank所有DHBV全基因组core序列bp241 414展不
权利要求
1.一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下操作: O以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增； 所述的上游引物为:ggactcgaac ctagaaga ； 所述的下游扩增引物为:ttatttccta ggcgaggg ； 所述的检测探针为:accacagttg tctatgggag aag ； 2)在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧光信号； 3)根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲线，然后根据待检品的荧光信号在标准 曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型肝炎病毒的含量。
2.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM_T载体中。
3.如权利要求2所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的DHBV Core区基因序列的获得为: 以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物Fl和下游引物Rl进行PCR扩增，所述的上游弓I物 Fl 为:gggatccata tcaatgcttc tag ； 下游引物 Rl 为:gctcgagtta tttcctaggc gag。
4.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的待检品的获取为: 血清中加入其体积I 2倍的DNA提取液，充分混匀，100°C煮沸5 15min，4°C放置过夜,离心取上清液,得到待检品； 所述的DNA提取液包括0.1 0.5mol/L的NaOH、2 2.5mol/L的NaCl、以及质量浓度为 0.5 1.0% 的 SDS0
5.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的扩增体系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mM Tris-HCl, 50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2，上游引物25 IOOmM,下游扩增引物25 IOOmM,检测探针5 20mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10 20%。
6.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的扩增体系为25 μ I,包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/ μ I,500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3,IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ； 上游引物0.5μ l、50mM ； 下游扩增引物0.5μ l、50mM ； 检测探针0.5 μ l、10mM ； DEPC-H209 μ I ； 标准品或待检品2 μ I。
7.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的荧光标记物为FAM，其对应的检测波长为490nm。
8.如权利要求1所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的扩增程序为:94°C预变性 2min ；94°C 15s，49。。30s, 72°C 30s ；40 个循环。
9.一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，包括标准品和PCR扩增体系； 所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中； 所述的PCR扩增体系包括0.05 0.1U的聚合酶、250 500 μ M的dNTP，10 20mMTris-HCl, 50 IOOmM KCl、1.5 3mM MgCl2,上游引物25 50mM，下游扩增引物25 50mM，检测探针5 10mM，作为模板的标准品或待检品的体积分数为10 20%。
10.如权利要求9所述的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述的pGEM-T/DHBV Core重组质粒中的DHBV Core区基因是以以上游引物Fl和下游引物Rl对DHBV Core区基因进行PCR扩增，所述的上游引物Fl为:gggatccata tcaatgcttc tag ； 下游引物 Rl 为:gctcgagtta tttcctaggc gag ； 所述的扩增体系为25 μ I,包括:2XHotStart Taq PCR MasterMixl2.5 μ I,包括:0.1UHotStart Taq Polymerase/ μ I,.500 μ M dNTP each,20mM Tris-HCl、ρΗ8.3,IOOmM KCl 和 3mM MgCl2 ； 上游引物0.5μ l、50mM ； 下游扩增引物0.5μ l、50mM ； 检测探针0.5 μ l、10mM ； DEPC-H209 μ I ； 模板2 μ I。
全文摘要
本发明公开了一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，筛选出鸭乙肝病毒Core区最大一致性的保守区核酸序列，以此为模板，设计、合成引物和荧光探针。构建pGEM-T/DHBV Core重组质粒，制备PCR标准品。通过优化反应体系和扩增条件。本发明提供的实时荧光定量PCR检测方法具有通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，适于不同地区、不同鸭种的DHBV DNA的检测。
文档编号C12Q1/70GK103114153SQ20131004625
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者王亚文, 李义平, 刘正稳, 惠凌云, 刘希, 冯艾, 王威, 张琳, 杨广笑, 王全颖 申请人:西安交通大学医学院第一附属医院