亚历山大病相关基因突变、其检测方法及其用途
【专利摘要】本发明涉及遗传神经疾病领域，具体而言涉及亚历山大病领域。更具体而言，本发明公开了亚历山大病相关基因突变、其检测方法及其用途。本发明提供了亚历山大病的生物标记物，即突变的GFAP基因或蛋白：c.1289G>A、p.R430H；检测突变的GFAP基因或蛋白的方法；所述方法中使用的引物对和探针；以及包含所述引物对和探针的试剂盒。
【专利说明】亚历山大病相关基因突变、其检测方法及其用途
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及遗传神经疾病领域，具体而言涉及亚历山大病。
【背景技术】
[0002]亚历山大病是一种罕见的致命性的遗传神经性退化疾病。1949年由亚历山大首先提出此病，是一种由于星型胶质细胞功能异常导致的脑白质营养不良性疾病。典型病例表现为以额叶为主的白质异常和巨脑，组织学检测显示脑内存在Rosenthal纤维，为中间丝等几种类型细胞细胞骨架的组成部分，包括中枢神经系统星形胶质细胞和室管膜细胞。亚历山大病的诊断标准:以额叶为主的广泛脑白质异常；脑室周缘Tl加权像呈高信号而T2加权像呈低信号；基底节和丘脑异常；脑干异常，特别累及了中脑和延髓；一个或多个结构(包括脑室周缘、额叶白质、视交叉、穹隆、基底节、丘脑、齿状核和脑干)的对比强化。以上5条标准符合4条即可确诊。
[0003]亚历山大病的遗传方式尚不十分清楚，多为散发病例，也有一些家系报道，可能为常染色体显性遗传。根据发病年龄及临床表现的不同，通常可分为婴儿型、青年型和成年型。婴儿型，目前为最常见类型，多在2岁以内起病，表现为智力发育迟缓、肢无力、肌张力降低、吸吮、饮水困难、构音不清、小脑性共济失调，70%的患者有癫痫发作、巨脑。婴儿型亚历山大病的病情严重，常在10岁前死亡。青年型，比婴儿型少见，在4-14岁起病，男女均可发病临床特征与婴儿型有很多相似处，不同点为少见癫痫发作、巨脑表现。青年型亚历山大病的病情发展相对缓慢。成年型，罕见，在20-70岁起病，男女均可发病，首先表现为下丘脑、脑干和脊髓受损的症状。成年型亚历山大病的病情进展缓慢，临床上不易与多发性硬化相鉴别。研究表明，虽然各种类型亚历山大病的临床表型不同，但是截止到目前发现的各种类型亚历山大病的大部分病例均为GFAP基因突变，但是也有部分确诊为亚历山大病患者中并没有发现GFAP基因突变。另外，2%存在GFAP基因突变的人表型正常。对于GFAP基因突变的病例，相同的GFAP突变位点，男女患者临床症状不同，这提示性别可能会影响亚历山大疾病的发展程度。对于GFAP基因突变的家系病例，相同的GFAP基因突变位点，但是家系内患者临床症状不同，这提示可能存在修饰基因或者其他因素导致患者的临床特性不一致。
[0004]因此，有必要深入研究亚历山大病的遗传机制。而且，本领域仍然需要发现亚历山大病相关的基因突变，以及检测亚历山大病的方法。
【发明内容】
[0005]本发明涉及到的一个患病家系，两个患者，同母异父，父母正常。两名患者临床表型不一致，而影像学MRI检测发现两名患者均具有成年型亚历山大疾病的特征。
[0006]本发明人经过不懈的努力，发现了亚历山大病基因的新突变，并由此提供了下述发明:
[0007]本发明涉及亚历山大病基因新的突变，具体为:GFAP基因c.1289G>A (p.R430H)；HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)，其中 GFAP 蛋白突变 p.R430H 发生在 GFAP-ε 上。
[0008]在第一方面，本发明涉及亚历山大病的生物标记物，即突变的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白，所述生物标记物是具有选自如下的突变基因或蛋白:
[0009]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0010]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0011]在一个实施方案中，本发明的突变GFAP基因分别为具有以下突变的SEQ ID N0:1:c.1289G>A。
[0012]在一个实施方案中，本发明的突变HDAC6基因分别为具有以下突变的SEQ IDNO:2:c.2566C>T。
[0013]在一个实施方案中，本发明的突变的GFAP-ε蛋白为具有以下突变的SEQ IDNO:3:p.R430H。
[0014]在一个实施方案中，本发明的突变的HDAC6蛋白为具有以下突变的SEQ ID NO:4:p.P856S。
[0015]在第二方面，本发明涉及一种检测亚历山大病的方法，所述方法包括检测受试者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有亚历山大病或易患亚历山大病，或者其后代会患有亚历山大病或易患亚历山大病，所述突变位点选自如下任一种或其组合:
[0016]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0017]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0018]在一个实施方案中，GFAP基因为SEQ ID N0:1的序列表不。
[0019]在一个实施方案中，GFAP- ε蛋白为SEQ ID NO:3的序列表示。
[0020]在一个实施方案中，HDAC6基因为SEQ ID NO:2的序列表示。
[0021]在一个实施方案中，HDAC6蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。
[0022]在一个实施方案中，本发明的检测亚历山大病的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤:
[0023]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0024]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0025]在一个实施方案中，本发明的检测亚历山大病的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行:测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色
-1'TfeP曰。
[0026]在本发明第二方面的方法中，优选检测杂合的突变GFAP基因。
[0027]在本发明第二方面的方法中，优选检测纯合的突变HDAC6基因。
[0028]在第三方面，本发明涉及一种检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法，所述方法包括检测受试者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突变位点，所述突变位点选自如下任一种或其组合:
[0029]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0030]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0031]在一个实施方案中，GFAP基因为SEQ ID NO:1的序列表示。
[0032]在一个实施方案中，GFAP- ε蛋白为SEQ ID NO:3的序列表示。[0033]在一个实施方案中，HDAC6基因为SEQ ID NO:2的序列表示。
[0034]在一个实施方案中，HDAC6蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。
[0035]在一个实施方案中，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法包括如下至少一组引物扩增的步骤:
[0036]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0037]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0038]在一个实施方案中，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行:测序、电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。
[0039]在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0040]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0041]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0042]其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。 [0043]在第五方面，本发明涉及与突变GFAP和/或HDAC6基因互补的核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0044]GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
[0045]HDAC6 基因 c.2566C>T。
[0046]所述探针与突变GFAP和/或HDAC6基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位置:GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566位。
[0047]在第六方面，本发明涉及检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0048]GFAP 基因 c.1289G>A (p.R430H);和 / 或
[0049]HDAC6 基因 c.2566C>T (p.P856S)。
[0050]其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和/或HDAC6基因cDNA序列第2566 位。
[0051]在一个实施方案中，所述检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的试剂盒包含选自如下的至少一组引物:
[0052]SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
[0053]SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
[0054]在第七方面，本发明涉及检测突变GFAP和/或HDAC6基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合:
[0055]GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
[0056]HDAC6 基因 c.2566C>T。
[0057]所述探针与突变GFAP和/或HDAC6基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA序列上的区域互补:GFAP基因cDNA序列弟1289似和/或HDAC6基因cDNA序列弟2566位。
[0058]在第八方面，本发明涉及GFAP基因的突变外显子7A和/或HDAC6基因突变外显子25。
[0059]在本发明中，引物对SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6用于扩增GFAP基因的野生型或突变外显子7A ;引物对SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8用于扩增HDAC6基因的野生型或突变外显子25。
[0060]本发明人发现，本发明的GFAP基因的杂合突变即致病；而本发明的HDCA6基因杂合并不致病，如本文中患者的母亲，本发明的HDCA6基因突变使患者的临床病症不同。
[0061]本发明发现了亚历山大病相关基因的2个新的突变位点，对该基因位点的检测可能用于亚历山大病患者的辅助诊断，并且可能有利于明确亚历山大病患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法可以用于诊断亚历山大病的目的，例如产前诊断、植入前遗传学诊断(PGD)、患者筛查。然而，本发明的方法并不仅限于用于诊断疾病的目的。
[0062]另外，本发明的检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的方法也可以用于非诊断疾病的目的。所述的非检测疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多态性，用于家族演化研究。本发明可以对亚历山大病的发病机理提供重要线索，对亚历山大病的诊断治疗具有十分重要的意义。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。
[0063]例如，根据本文的描述可以看出，有些个体携带本发明所述的突变HDAC6基因但不患亚历山大病，例如仅一条染色体携带突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以任何不涉及诊断疾病的目的，因为这些个体并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为例如有用信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。
【专利附图】
【附图说明】
[0064]图1患者家系图，示出患者(I1-2、I1-4)及其父母(1-1-3)、兄弟姐妹(ΙΙ-1、ΙΙ-3和I1-5-7)和子女(II1-1-4)的关系图。圆表示女性，方框表示男性。
[0065]图2患者脑部MRI图，其中患者Ptl (b、C、d、e、g),患者Pt2 (a、f)。
[0066]图3GFP转录本结构图。
[0067]图4患者Ptl、Pt2及患者母亲GFP突变位点的测序。
[0068]图5患者Ptl、Pt2及患者母亲HDAC6突变位点的测序图。Wt是指野生型。
[0069]图6HDAC6功能验证。Ct指对照。
[0070]野生型HDAC6基因和GFAP基因的cDNA和所编码的蛋白序列说明(下划线示出本发明相关的突变发生的位置):
[0071]GFAPcDNA，示出野生型GFAP基因的cDNA的核苷酸序列，1296nt (SEQ ID NO:1):
[0072]A TGGAGAGGAGACGCATCACCTCCGCTGCTCGCCGCTCCTACGTCTCCTCAGGGGAGATGATGGTGGGGGGCCTGGCTCCTGGCCGCCGTCTGGGTCCTGGCACCCGCCTCTCCCTGGCTCGAATGCCCCCTCCACTCCCGACCCGGGTGGATTTCTCCCTGGCTGGGGCACTCAATGCTGGCTTCAAGGAGACCCGGGCCAGTGAGCGGGCAGAGATGATGGAGCTCAATGACCGCTTTGCCAGCTACATCGAGAAGGTTCGCTTCCTGGAACAGCAAAACAAGGCGCTGGCTGCTGAGCTGAACCAGCTGCGGGCCAAGGAGCCCACCAAGCTGGCAGACGTCTACCAGGCTGAGCTGCGAGAGCTGCGGCTGCGGCTCGATCAACTCACCGCCAACAGCGCCCGGCTGGAGGTTGAGAGGGACAATCTGGCACAGGACCTGGCCACTGTGA
GGCAGAAGCTCCAGGATGAAACCAACCTGAGGCTGGAAGCCGAGAACAACCTGGCTGCCTATAGACAGGAAGCAGAT
GAAGCCACCCTGGCCCGTCTGGATCTGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGGAGGAGGAGATCCGGTTCTTGAGGAAGAT
CCACGAGGAGGAGGTTCGGGAACTCCAGGAGCAGCTGGCCCGACAGCAGGTCCATGTGGAGCTTGACGTGGCCAAGC
CAGACCTCACCGCAGCCCTGAAAGAGATCCGCACGCAGTATGAGGCAATGGCGTCCAGCAACATGCATGAAGCCGAA
GAGTGGTACCGCTCCAAGTTTGCAGACCTGACAGACGCTGCTGCCCGCAACGCGGAGCTGCTCCGCCAGGCCAAGCA
CGAAGCCAACGACTACCGGCGCCAGTTGCAGTCCTTGACCTGCGACCTGGAGTCTCTGCGCGGCACGAACGAGTCCC
TGGAGAGGCAGATGCGCGAGCAGGAGGAGCGGCACGTGCGGGAGGCGGCCAGTTATCAGGAGGCGCTGGCGCGGCTG
GAGGAAGAGGGGCAGAGCCTCAAGGACGAGATGGCCCGCCACTTGCAGGAGTACCAGGACCTGCTCAATGTCAAGCT
GGCCCTGGACATCGAGATCGCCACCTACAGGAAGCTGCTAGAGGGCGAGGAGAACCGGATCACCATTCCCGTGCAGA
CCTTCTCCAACCTGCAGATTCGAGGGGGCAAAAGCACCAAAGACGGGGAAAATCACAAGGTCACAAGATATCTCAAA
AGCCTCACAATACGAGTTATACCAATACAGGCTCACCAGATTGTAAATGGAACGCCGCCGGCTCGCGGTTAG
[0073]HDAC6cDNA，示出野生型 HDAC6 基因的 cDNA 的核苷酸序列，3648nt(SEQ ID N0:2):
[0074]ATGACCTCAACCGGCCAGGATTCCACCACAACCAGGCAGCGAAGAAGTAGGCAGAACCCCCAGTCGCCCCCTCAGGACTCCAGTGTCACTTCGAAGCGAAATATTAAAAAGGGAGCCGTTCCCCGCTCTATCCCCAATCTAGCGGAGGTAAAGAAGAAAGGCAAAATGAAGAAGCTCGGCCAAGCAATGGAAGAAGACCTAATCGTGGGACTGCAAGGGATGGATCTGAACCTTGAGGCTGAAGCACTGGCTGGCACTGGCTTGGTGTTGGATGAGCAGTTAAATGAATTCCATTGCCTCTGGGATGACAGCTTCCCGGAAGGCCCTGAGCGGCTCCATGCCATCAAGGAGCAACTGATCCAGGAGGGCCTCCTAGATCGCTGCGTGTCCTTTCAGGCCCGGTTTGCTGAAAAGGAAGAGCTGATGTTGGTTCACAGCCTAGAATATATTGATCTGATGGAAACAACCCAGTACATGAATGAGGGAGAACTCCGTGTCCTAGCAGACACCTACGACTCAGTTTATCTGCATCCGAACTCATACTCCTGTGCCTGCCTGGCCTCAGGCTCTGTCCTCAGGCTGGTGGATGCGGTCCTGGGGGCTGAGATCCGGAATGGCATGGCCATCATTAGGCCTCCTGGACATCACGCCCAGCACAGTCTTATGGATGGCTATTGCATGTTCAACCACGTGGCTGTGGCAGCCCGCTATGCTCAACAGAAACACCGCATCCGGAGGGTCCTTATCGTAGATTGGGATGTGCACCACGGTCAAGGAACACAGTTCACCTTCGACCAGGACCCCAGTGTCCTCTATTTCTCCATCCACCGCTACGAGCAGGGTAGGTTCTGGCCCCACCTGAAGGCCTCTAACTGGTCCACCACAGGTTTCGGCCAAGGCCAAGGATATACCATCAATGTGCCTTGGAACCAGGTGGGGATGCGGGATGCTGACTACATTGCTGCTTTCCTGCACGTCCTGCTGCCAGTCGCCCTCGAGTTCCAGCCTCAGCTGGTCCTGGTGGCTGCTGGATTTGATGCCCTGCAAGGGGACCCCAAGGGTGAGATGGCCGCCACTCCGGCAGGGTTCGCCCAGCTAACCCACCTGCTCATGGGTCTGGCAGGAGGCAAGCTGATCCTGTCTCTGGAGGGTGGCTACAACCTCCGCGCCCTGGCTGAAGGCGTCAGTGCTTCGCTCCACACCCTTCTGGGAGACCCTTGCCCCATGCTGGAGTCACCTGGTGCCCCCTGCCGGAGTGCCCAGGCTTCAGTTTCCTGTGCTCTGGAAGCCCTTGAGCCCTTCTGGGAGGTTCTTGTGAGATCAACTGAGACCGTGGAGAGGGACAACATGGAGGAGGACAATGTAGAGGAGAGCGAGGAGGAAGGACCCTGGGAGCCCCCTGTGCTCCCAATCCTGACATGGCCAGTGCTACAGTCTCGCACAGGGCTGGTCTATGACCAAAATATGATGAATCACTGCAACTTGTGGGACAGCCACCACCCTGAGGTACCCCAGCGCATCTTGCGGATCATGTGCCGTCTGGAGGAGCTGGGCCTTGCCGGGCGCTGCCTCACCCTGACACCGCGCCCTGCCACAGAGGCTGAGCTGCTCACCTGTCACAGTGCTGAGTACGTGGGTCATCTCCGGGCCACAGAGAAAATGAAAACCCGGGAGCTGCACCGTGAGAGTTCCAACTTTGACTCCATCTATATCTGCCCCAGTACCTTCGCCTGTGCACAGCTTGCCACTGGCGCTGCCTGCCGCCTGGTGGAGGCTGTGCTCTCAGGAGAGGTTCTGAATGGTGCTGCTGTGGTGCGTCCCCCAGGACACCACGCAGAGCAGGATGCAGCTTGCGGTTTTTGCTTTTTCAACTCTGTGGCTGTGGCTGCTCGCCATGCCCAGACTATCAGTGGGCATGCCCTACGGATCCTGATTGTGGATTGGGATGTCCACCACGGTAATGGAACTCAGCACATGTTTGAGGATGACCCCAGTGTGCTATATGTGTCCCTGCACCGCTATGATCATGGCACCTTCTTCCCCATGGGGGATGAGGGTGCCAGCAGCCAGA
TCGGCCGGGCTGCGGGCACAGGCTTCACCGTCAACGTGGCATGGAACGGGCCCCGCATGGGTGATGCTGACTACCTA
GCTGCCTGGCATCGCCTGGTGCTTCCCATTGCCTACGAGTTTAACCCAGAACTGGTGCTGGTCTCAGCTGGCTTTGA
TGCTGCACGGGGGGATCCGCTGGGGGGCTGCCAGGTGTCACCTGAGGGTTATGCCCACCTCACCCACCTGCTGATGG
GCCTTGCCAGTGGCCGCATTATCCTTATCCTAGAGGGTGGCTATAACCTGACATCCATCTCAGAGTCCATGGCTGCC
TGCACTCGCTCCCTCCTTGGAGACCCACCACCCCTGCTGACCCTGCCACGGCCCCCACTATCAGGGGCCCTGGCCTC
AATCACTGAGACCATCCAAGTCCATCGCAGATACTGGCGCAGCTTACGGGTCATGAAGGTAGAAGACAGAGAAGGAC
CCTCCAGTTCTAAGTTGGTCACCAAGAAGGCACCCCAACCAGCCAAACCTAGGTTAGCTGAGCGGATGACCACACGA
GAAAAGAAGGTTCTGGAAGCAGGCATGGGGAAAGTCACCTCGGCATCATTTGGGGAAGAGTCCACTCCAGGCCAGAC
TAACTCAGAGACAGCTGTGGTGGCCCTCACTCAGGACCAGCCCTCAGAGGCAGCCACAGGGGGAGCCACTCTGGCCC
AGACCATTTCTGAGGCAGCCATTGGGGGAGCCATGCTGGGCCAGACCACCTCAGAGGAGGCTGTCGGGGGAGCCACT
CCGGACCAGACCACCTCAGAGGAGACTGTGGGAGGAGCCATTCTGGACCAGACCACCTCAGAGGATGCTGTTGGGGG
AGCCACGCTGGGCCAGACTACCTCAGAGGAGGCTGTAGGAGGAGCTACACTGGCCCAGACCACCTCGGAGGCAGCC ATGGAGGGAGCCACACTGGACCAGACTACGTCAGAGGAGGCTCCAGGGGGCACCGAGCTGATCCAAACTCCTCTAGC
CTCGAGCACAGACCACCAGACCCCCCCAACCTCACCTGTGCAGGGAACTACACCCCAGATATCTCCCAGTACACTGA
TTGGGAGTCTCAGGACCTTGGAGCTAGGCAGCGAATCTCAGGGGGCCTCAGAATCTCAGGCCCCAGGAGAGGAGAAC
CTACTAGGAGAGGCAGCTGGAGGTCAGGACATGGCTGATTCGATGCTGATGCAGGGATCTAGGGGCCTCACTGATCA
GGCCATATTTTATGCTGTGACACCACTGCCCTGGTGTCCCCATTTGGTGGCAGTATGCCCCATACCTGCAGCAGGCC
TAGACGTGACCCAACCTTGTGGGGACTGTGGAACAATCCAAGAGAATTGGGTGTGTCTCTCTTGCTATCAGGTCTAC
TGTGGTCGTTACATCAATGGCCACATGCTCCAACACCATGGAAATTCTGGACACCCGCTGGTCCTCAGCTACATCGA
CCTGTCAGCCTGGTGTTACTACTGTCAGGCCTATGTCCACCACCAGGCTCTCCTAGATGTGAAGAACATCGCCCACC
AGAACAAGTTTGGGGAGGATATGCCCCACCCACACTAA
[0075]GFP蛋白序列，示出GFAPcDNA序列编码的胶质纤维酸性蛋白的氨基酸序列，43Iaa(SEQ ID N0:3):
[0076]MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRGGKSTKDGENHKVTRYLKSLTIRVIPIQAHQIVNGTPPARG
[0077]HDAC6蛋白序列，示出HDAC6cDNA序列编码的组蛋白去乙酰化酶6的氨基酸序列，1215aa (SEQ ID N0:4):
[0078]MTSTGQDSTTTRQRRSRQNPQSPPQDSSVTSKRNIKKGAVPRSIPNLAEVKKKGKMKKLGQAMEEDLIVGLQGMDLNLEAEALAGTGLVLDEQLNEFHCLWDDSFPEGPERLHAIKEQLIQEGLLDRCVSFQARFAEKEELMLVHSLEYIDLMETTQYMNEGELRVLADTYDSVYLHPNSYSCACLASGSVLRLVDAVLGAEIRNGMAIIRPPGHHAQHSLMDGYCMFNHVAVAARYAQQKHRIRRVLIVDWDVHHGQGTQFTFDQDPSVLYFSIHRYEQGRFWPHLKASNWSTTGFGQGQGYTINVPWNQVGMRDADYIAAFLHVLLPVALEFQPQLVLVAAGFDALQGDPKGEMAATPAGFAQLTHLLMGLAGGKLILSLEGGYNLRALAEGVSASLHTLLGDPCPMLESPGAPCRSAQASVSCALEALEPFWEVLVRSTETVERDNMEEDNVEESEEEGPffEPPVLPILTWPVLQSRTGLVYDQNMMNHCNLWDSHHPEVPQRILRIMCRLEELGLAGRCLTLTPRPATEAELLTCHSAEYVGHLRATEKMKTRELHRESSNFDSIYICPSTFACAQLATGAACRLVEAVLSGEVLNGAAVVRPPGHHAEQDAACGFCFFNSVAVAARHAQTISGHALRILIVDWDVHHGNGTQHMFEDDPSVLYVSLHRYDHGTFFPMGDEGASSQIGRAAGTGFTVNVAWNGPRMGDADYLAAWHRLVLPIAYEFNPELVLVSAGFDAARGDPLGGCQVSPEGYAHLTHLLMGLASGRIILILEGGYNLTSISESMAACTRSLLGDPPPLLTLPRPPLSGALASITETIQVHRRYffRSLRVMKVEDREGPSSSKLVTKKAPQPAKPRLAERMTTREKKVLEAGMGKVTSASFGEESTPGQTNSETAVVALTQDQPSEAATGGATLAQTISEAAIGGAMLGQTTSEEAVGGATPDQTTSEETVGGAILDQTTSEDAVGGATLGQTTSEEAVGGATLAQTTSEAAMEGATLDQTTSEEAPGGTELIQTPLASSTDHQTPPTSPVQGTTPQISPSTLIGSLRTLELGSESQGASESQAPGEENLLGEAAGGQDMADSMLMQGSRGLTDQAIFYAVTPLPWCPHLVAVCPIPAAGLDVTQPC⑶CGTIQENWVCLSCYQVYCGRYINGHMLQHHGNSGHPLVLSYIDLSAWCYYCQAYVHHQALLDVKNIAHQNKFGEDMPHPH
【具体实施方式】
[0079]发明人收集到一个意大利的异父同胞家系，父母(图1中I中的1-3)表型正常，异父同胞的女性患者(I1-2)和男性患者(I1-4)均表现为神经类疾病，但是两者临床症状不同。
[0080]患者Ptl (图1，11-2)，女，68岁。55岁发病，起病隐袭、智力减退伴随中度共济失调、构音障碍、吞咽困难、腭肌阵挛。61岁脑电图EEG检查表现出非特异性刺激性异常、PEV改变、EMG正常、眼球运动正常、简易精神状态检查MMSE得分为22/30。该综合征病程发病缓慢、起病时出现尿失禁。
[0081]患者Pt2 (图1，11_4)，男，60岁。52岁因隐袭性渐进性行走困难就诊、患者46岁时出现右下肢僵硬无力、3-5年后逐渐累及到右上肢和左上下肢。56岁需辅助轮椅行走；发音、吞咽困难；伴随严重四痉挛、双侧踝阵挛；双侧巴宾斯基征；双侧颞肌、骨间肌和胫骨前肌发育不良。感官检验和植物神经系统检查均正常，例如眼球运动正常。肌电图EMG显示神经源性异常、无自发颤动。神经传导研究表明，下肢运动性轴索型神经病变、外周感觉神经传导正常。上述检测结果显示患者具有严重的肢体和延髓区运动神经元疾病(MND);病程呈缓慢、渐进性发展；患者无认知功能减退。
[0082]颅脑MRI (来自患者Ptl和Pt2在医院检查的图像。图2，其中患者Ptl (b、c、d、e、g)，患者Pt2 (a、f))示两个患者均表现出轻微的恶化，包括蝌蚪状的延髓和颈脊髓萎缩，前后中央脑回和额底区呈现萎缩段，齿状核，脑室周缘、皮质下白质异常信号，与文献中亚历山大病患者MRI的症状极为相似。
[0083]由于患者Ptl和Pt2为同母异父，因此对mtDNA进行了测序，未发现mtDNA基因突变，排除了线粒体遗传mtDNA基因突变导致的疾病。发明人对GFAP的9个外显子进行了sanger测序未见突变，因此发明人利用Agilent Sureselect50M Kit结合Solexa高通量测序技术对病例PtI和Pt2进行了外显子组测序，具体方法参见实施列3。
[0084]结果，发明人在病例Ptl中发现有87380个单核苷酸多态性(SNP)和6866处的插入/缺失，在病例Pt2中发现有89065个单核苷酸多态性(SNP)和6760处的插入/缺失。随后通过 dbSNP 数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi)、千人基因组数据库(www.1OOOgenomes.0rg/)、HapMap8 数据库(http://hapmap.ncb1.nlm.nih.gov/)等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。去掉同义突变，将剩下的非同义/剪接位点突变和微小插入缺失进行优先选择:根据患者症状，优先考虑已知亚历山大病致病基因GFAP基因，发明人找到了 GFAP基因上的一个新突变，G到A的错义突变c.1289G>A，导致R430H的氨基酸改变。
[0085]为 了进一步解释Ptl和Pt2临床症状差异是否还有其他突变导致，发明人进一步用 Endeavour software (http://homes.esat.kuleuven.be/bioiuser/endeavour/tool/endeavourweb.php)对候选基因进行优先级排序,位于染色体Xpll.23的HDAC6基因综合排名第一，该基因编码组蛋白去乙酰化酶6。患者Pt2为半合子突变，C到T的错义突变c.25660T,导致P856S氨基酸改变。
[0086]然后，发明人又通过Polyphen2 (http: / / genetics, bwh.harvard.edu/pph2)、SIFT (http: //sift, bi 1.a-star.edu.Sg)、Mutpred (http: //mutpred.mutdb.0rg)、Pmut (http://mmb.pcb.ub.es/PMut)软件按照标准方法进行预测,进一步确认了上述2个
突变基因。
[0087]已知，GFAP基因(0MM:*137780)位于17号染色体，编码胶质纤维酸性蛋白。胶质纤维酸性蛋白被认为是星形胶质细胞的成熟标志。对于健康成人，星形胶质细胞占中枢神经系统细胞总数的40%。GFAP蛋白是细胞质内中间丝蛋白的主要构成部分，在胶质细胞分化中参与细胞骨架的形成。已有实验证实GFAP蛋白在脑损伤发生发展过程中具有重要作用。GFAP基因突变会导致脑内Rosenthal纤维的积累，而脑内Rosenthal纤维是确诊亚历山大病的组织学前提。由于选择性剪接，GFAP基因存在多个转录本，见图3，GFAP-a (GenBank登录号 ΝΡ_002046.1)，含有 9 个外显子。GFAP- ε (GenBank 登录号 ΝΡ_001124491.1)，由于选择性剪接，C末端最后35个氨基酸与GFAP-α不同。GFAP-κ (GenBank登录号NP_001229305.1)C末端与GFAP-α不同，存在7B外显子。最常见的转录本是GFAP-a，截止到目前，GFAP基因的突变都是在这个转录本上。临床上遗传检测通常检测该转录本上9个外显子是否存在突变。但是目前仍有少数确诊的患者该基因未发现突变。发明人在GFAP- a转录本上尚未找到致病突变，通过外显子测序后意外发现，2个患者GFAP-ε转录本外显子7Α编码区上均存在c.1289G>A和p.R430H的杂合突变。这个突变也可以在GFAP-κ转录本的3，-UTR上找到。
[0088]已知HDAC6基因位于X染色体，编码组蛋白去乙酰化酶6，为HDAC家族中b类成员之一，催化组蛋白和非组蛋白的赖氨酸残基去乙酰化。HDAC6蛋白拥有两个独特的催化区域，且高度同源，均有去乙酰化酶活性，决定了它可以使不同底物去乙酰化。C末端有一个保守的半胱氨酸和组氨酸富含区构成锌指结构ZnF-UBP。在体内，HDAC6蛋白能够催化组蛋白和非组蛋白如去乙酰化酶，在体内HDAC6蛋白除有组蛋白去乙酰化酶活性外，还可介导非组蛋白如a-微管蛋白(tubulin)、热休克蛋白90 (HSP90)和抗氧化蛋白去乙酰化。在小鼠和果蝇的模型中，HDAC6基因的突变会导致如帕金森病、亨廷顿病神经退行性变疾病。a -微管蛋白是HDAC6蛋白去乙酰化的底物之一，在体内去乙酰化的微管蛋白快速解聚，而乙酰化的a-微管蛋白易于聚集而有利于微管的稳定。有意思的是，与肌萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis)疾病相关的 RNA 结合调控因子 TDP-43 和 FUS/TLS 以HDAC6mRNA作为特异性底物。在果蝇模型中，沉默TDP-43导致HDAC6基因下调表达，而过量表达HDAC6基因，使患脊髓小脑性共济失调的果蝇症状得到缓解。
[0089]由于外显子组测序存在一定程度的假阳性，接下来，发明人又利用Sanger测序方法，对这两个基因的突变位点在家系内进行了验证，GFAP基因在患者Ptl和Pt2中均为杂合突变，而在家系内1-2 (母亲)、11-6、11-7、111-1、111_4均无突变(见图4)。HDAC6基因在患者Pt2中为半合子突变，患者Ptl中无突变，家系内1-2 (母亲)为杂合突变，11-6、I1-7均无突变(见图5)。EVS外显子数据库(http://evs.gs.Washington.edu/EVS)中未发现这两个位点的突变。
[0090]为了进一步解释HDAC6基因突变导致患者Pt2特有的运动神经元疾病表型，发明人测定了 Ptl和Pt2患者以及正常人成纤维细胞中HDAC6基因的表达量，结果表明两个患者及对照中HDAC6基因表达量并无明显差异(图6A)。接着发明人利用免疫沉淀的方法检测到患者Pt2乙酰化的α-微管蛋白较患者Ptl及对照明显增加(图6B)。免疫细胞化学染色显示患者Pt2成纤维细胞核周区域乙酰化α -微管蛋白成块异常聚集(图6C，上排、中排为20倍镜，下排为100倍镜)。从图6D可以明显地看出患者Pt2成纤维细胞中多叶核/多形核的比例较对照和患者Ptl显著性增加，而对照和患者Ptl之间无显著性差异。因此可以推测HDAC6基因突变，导致微管组织中心功能失调，打破了 α -微管蛋白乙酰化与去乙酰化的动态平衡，最终导致神经退行性病变，使患者表现出运动神经元疾病的症状。
[0091]因此，综上所述，发明人认为本发明找到的GFAP基因的突变是成年型亚历山大疾病的另一致病突变位点，而HDAC6基因的半合子突变使Pt2患者具有不同于患者Ptl的临床表型(见表1)。
[0092]表1.2名患者的基因突变位点
【权利要求】
1.一种亚历山大病的生物标记物，所述生物标记物包括突变的GFAP基因或蛋白: c.1289G>A、p.R430H。
2.权利要求1的生物标记物，所述生物标记物还包括突变的HDAC6基因或蛋白: c.2566C>T、p.P856S。
3.权利要求1或2的生物标记物，所述突变GFAP蛋白为SEQID N0:3的序列中具有以下突变:
p.R430H。
4.权利要求2的生物标记物，所述突变HDAC6蛋白为SEQID N0:4的序列中具有以下突变:
p.P856S。
5.一种检测受试者的GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中是否存在突变位点的方法，所述突变位点选自如下任一种或其组合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S。
6.权利要求5的方法，包括如下至少一组引物扩增的步骤:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
7.检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白中使用的引物对，所述突变是选自如下任一种或其组合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S, 其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上前后设计，使得扩增该位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
8.与突变GFAP和/或HDAC6基因互补的核酸探针，所述突变是选自如下任一种或其组合:
GFAP 基因 c.1289G>A ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T, 所述探针与突变GFAP和/或HDAC6基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA序列上的位置:GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
9.检测突变GFAP和/或HDAC6基因或蛋白的试剂盒，包含一组或多组引物对，并且/或者包含一个或多个核酸探针，其中所述突变是选自如下任一种或其组合:
GFAP 基因 c.1289G>A、p.R430H ;和 / 或
HDAC6 基因 c.2566C>T、p.P856S, 其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置=GFAP基因cDNA序列第1289位和HDAC6基因cDNA序列第2566位。
10.权利要求9的试剂盒，所述引物对选自如下的一组或两组:
SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 ；
SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8。
【文档编号】C12N15/11GK103966226SQ201310047545
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2013年2月6日
【发明者】方明艳, 盖齐·达尼埃莱, 王海荣, 刘轩竹, 王俊, 汪建, 杨焕明 申请人:深圳华大基因研究院