专利名称：一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法
一种CIpP基因缺失大肠杆菌制备方法技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法。
背景技术：
在利用工程菌表达重组蛋白过程中，外源蛋白在大肠杆菌中降解是一个经常遇到的问题，导致该问题的主要原因是大肠杆菌的蛋白水解酶识别并切割了外源蛋白的特异性氨基酸序列。目前所用的大肠杆菌工程菌株中，已有Lon蛋白酶缺失的菌株，如BL21 (DE3)等。但不同蛋白酶识别和切割的序列是不一样的，单一蛋白酶的缺失只能针对特定的情况，因此需要针对特定情况建立新的蛋白酶缺失菌株。ClpP属于Clp分子伴侣家族，与ClpA、ClpB和ClpX相结合,能降解大肠杆菌内的一部分蛋白质。其机制是识别蛋白质C端的多肽序列ANDENYALAA，并在ClpA或ClpX的协助下，将含有此序列的肽链降解。
在工程菌的基因敲除工艺中常用的是同源重组技术，而同源重组与非同源重组相比频率要低得多。为了避免大容量地筛选重组基因，一般需要在转运盒中包含筛选标记以利于确认靶点基因区的敲入或敲除。然而，插入的筛选标记(例如FRT或1xP位点)会影响基因组的进一步改造。
目前常用的是敲除目的基因的手段是依赖λ噬菌体的Red重组系统，该系统可以直接利用含同源臂的PCR线形片段，替换出同源臂内的目的基因。Red重组虽然方法比较简单快捷，但同时也存在一些缺点。首先，这种重组方法不适合用于改造非大肠杆菌K系列的菌株，如BL21 (DE3)等。其次，在筛选标记剪切后仍然存在至少一个FRT位点或1xP位点，即所谓的残留痕迹；此外，即使在重组酶不存在的情况下，含有多个残留痕迹的染色体由于痕迹点之间的重组现象，容易导致染色体基因组的随意重排或敲除。因此，需要开发一种能够改造靶基因或基因组序列而没有留下筛选标记或外源DNA序列等残留痕迹的方法。发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法，旨在提供一种可敲除靶基因而不会引入外源DNA序列的方法。
本发明实施例是这样实现的，一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法，包括以下步骤:
分别以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，克隆包括ClpP基因5’端表达序列及其上游序列的第一序列和包括ClpP基因3’端表达序列及其下游序列的第二序列:其中用第一引物对SEQ ID N0:1和SEQ ID NO:2克隆该第一序列；用第二引物对SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4克隆该第二序列；
以质粒PUC-KS为模板，获得kansacB基因作为第三序列；
按照第一序列、第三序列及 第二序列的顺序将该三条序列连接成一段序列得第一组合序列，其中该第一序列3’端与第三序列5’端连接，该第三序列3’端与该第二序列5’端连接；
将该第一组合序列插入至质粒PMAK705,获得第一敲除质粒；
将该第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，经第一次培养及筛选，获得第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)；
按照第一序列及第二序列的顺序将该两条序列连接成一段序列得第二组合序列，其中该第一序列3’端与第二序列5’端连接；
将该第二组合序列插入至质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；
将该第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)中，经第二次培养及筛选，获得目的重组大肠杆菌BL21 (DE3)。
本发明实施例还提供利用本发明的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法制得的大肠杆菌。
本发明的ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法采用大肠杆菌内源性的recA重组系统，操作简便，可广泛应用于不适合使用red重组的菌株的改造；本发明的制备方法未引入任何多余的序列，减少了外源基因对重组蛋白表达的干扰，避免基因敲除后在染色体上留下残留痕迹，有利于菌株的基因组的稳定，且更方面于后续的改造工作；本发明的制备方法无痕敲除了 ClpP基因，优化了大肠杆菌BL21(DE3)，获得一种可高效表达外源蛋白的表达菌株，可提高工业发酵的效率。
图1是本发明的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21 (DE3)制备方法流程示意图2是本发明实施例提供的第一序列、第二序列、第三序列及第一组合序列的PCR扩增结果电泳图3是本发明实施例提供的制备方法获得的菌株及野生型大肠杆菌BL21 (DE3)基因组Southern杂交结果。
具体实施方式
为了使本 发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，包括以下步骤:
分别以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用第一引物对Pl (SEQ ID NO:1)和Pl (SEQ ID NO:2)克隆第一序列，该第一序列包括ClpP基因5’端表达序列及其上游序列；用第二引物对P3(SEQ ID NO:3)和P4(SEQ ID NO:4)克隆第二序列，该第二序列包括ClpP基因3’端表达序列及其下游序列；
以质粒PUC-KS为模板，获得第三序列，该第三序列为kansacB基因；
将该第一序列、第三序列及第二序列连接成一段序列得第一组合序列，其中该第一序列3’端与第三序列5’端连接，该第三序列3’端与该第二序列5’端连接，即第三序列位于第一序列和第二序列之间；
将该第一组合序列插入至自杀质粒PMAK705，经第一次培养筛选，获得第一敲除质粒;
将该第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中，获得第一次双交换大肠杆菌BL21 (DE3)，即含有标记基因kansacB的大肠杆菌；
将该第一序列及第二序列连接成一段序列得第二组合序列，其中该第一序列3’端与第二序列5’端连接，即第一序列位于第二序列上游；
将该第二组合序列插入至自杀质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；
将该第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌BL21 (DE3)中，经第二次培养筛选，获得ClpP基因缺失大肠杆菌BL21 (DE3)。
在本发明实施例中，除非另外说明，“序列”指DNA序列。在本发明实施例中每次酶切及连接之后均进行检验，验证无误后进行下一步操作，这些操作均为本领域技术人员熟知，以下不再详细描述。
本发明实施例中使用的大肠杆菌为BL21 (DE3)，即含有DE3的BL21菌株，BL21菌株是常用的表达菌株，通常配合以强表达载体来进行目的基因的表达。(DE3)是指宿主为λ DE3，其携带有T7RNA聚合酶基因，其适用于利用ρΕΤ表达系统表达重组蛋白。具体地，上述第一引物对、第二引物对的序列如下所示:
第一引物对:
正向引物Pl:ATAGGATCCTCGTCATCGA ATGATTTA SEQ ID NO:1,
反向引物P2:GCGTGAGGGGAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO:2,
其中引物Pl的下划线部分为BamHI酶切位点；
第二引物对:
正向引物P3:ACGAC GCCCGGGTCAATCATTAGAACAG SEQ ID NO:3，
反向引物 P4:CGCGAGCTCGCAGACGACCAATAAACT SEQ ID NO:4，
其中引物P4的下划线部分为sacl酶切位点。
利用引物对Pl和P2克隆获得的第一序列为SEQ ID NO:5，具体为:
TCGTCATCGAATGATTTACAGTACTTTAGCGGAGGAACTCTCTACTACCGTTCATGCGCTGGCTCTGCATACTTACACTATTAAGGAGTGGGAAGGGTTGCAGGACACCGTCTTTGCCTCTCCTCCCTGTCGTGGAGCAGGAAGCATCGCGTAAAAACGCATTTGCAACTGTCGGCGCTTTTCCAGTATGTTGCTAAAGATTTTATGAAAAACGGCCTGCGGGCCGTTTTGTTTTGTCTGGATTTTGCGCTTTTTGCCCAGCATTCAGACGAAAATTGCCCGGGAATTGTGAAAAAATACGCGACAGCGCGCAATAACCGTTCTCGACTCATAAAAGTGATGCCGCTATAATGCCGCGTCCTATTTGAATGCTTTCGGGATGATTCTGGTAACAGGGAATGTGATTGATTATAAGAACATCCCGGTTCCGCGAAGCCAACAACCTGTGCTTGCGGGGTAAGAGTTGACCGAGCACTGTGATTTTTTGAGGTAACAAGATGCAAGTTTCAGTTGAAACCACTCAAGGCCTTGGCCGCCGTGTAACGATTACTATCGCTGCTGACAGCATCGAGACCGCTGTTAAAAGCGAGCTGGTCAACGTTGCGAAAAAAGTACGTATTGACGGCTTCCGCAAAGGCAAAGTGCCAATGAATATCGTTGCTCAGCGTTATGGCGCGTCTGTACGCCAGGACGTTCTGGGTGACCTGATGAGCCGTAACTTCATTGACGCCATCATTAAAGAAAAAATCAATCCGGCTGGCGCACCGACTTATGTTCCGGGCGAATACAAGCTGGGTGAAGACTTCACTTACTCTGTAGAGTTTGAAGTTTATCCGGAAGTTGAACTGCAGGGTCTGGAAGCGATCGAAGTTGAAAAACCGATCGTTGAAGTGACCGACGCTGACGTTGACGGCATGCTGGATACTCTGCGTAAACAGCAGGCGACCTGGAAAGAAAAAGACGGCGCTGTTGAAGCAGAAGACCGCGTAACCATCGACTTCACCGGTTCTGTAGACGGCGAAGAGTTCGAAGGCGGTAAAGCGTCTGATTTo
利用引物对P3和P4克隆获得的第二序列为SEQ ID NO:6，具体为:
GGTCAATCATTAGAACAGATTGAACGTGATACCGAGCGCGATCGCTTCCTTTCCGCCCCTGAAGCGGTGGAATACGGTCTGGTCGATTCGATTCTGACCCATCGTAATTGATGCCAGAGGCGCAACTGTGCCGCTATACTTATCCAGGGCGGCACAACGCTGTAAGCGGCTTGCGCCTGAGAATGGCATTTGCGTCGTCGTGTGCGGCACAAAGAACAAAGAAGAGGTTTTGACCCATGACAGATAAACGCAAAGATGGCTCAGGCAAATTGCTGTATTGCTCTTTTTGCGGCAAAAGCCAGCATGAAGTGCGCAAGCTGATTGCCGGTCCATCCGTGTATATCTGCGACGAATGTGTTGATTTATGTAACGACATCATTCGCGAAGAGATTAAAGAAGTTGCACCGCATCGTGAACGCAGTGCGCTACCGACGCCGCATGAAATTCGCAACCACCTGGACGATTACGTTATCGGCCAGGAACAGGCGAAAAAAGTGCTGGCGGTCGCGGTATACAACCATTACAAACGTCTGCGCAACGGCGATACCAGCAATGGCGTCGAGTTGGGCAAAAGTAACATTCTGCTGATCGGTCCGACCGGTTCCGGTAAAACGCTGCTGGCTGAAACGCTGGCGCGCCTGCTGGATGTTCCGTTCACCATGGCCGACGCGACTACACTGACCGAAGCCGGTTATGTGGGTGAAGACGTTGAAAACATCATTCAGAAGCTGTTGCAGAAATGCGACTACGATGTCCAGAAAGCACAGCGTGGTATTGTCTACATCGATGAAATCGACAAGATTTCTCGTAAGTCAGACAACCCGTCCATTACCCGAGACGTTTCCGGTGAAGGCGTACAGCAGGCACTGTTGAAACTGATCGAAGGTACGGTAGCTGCTGTTCCACCGCAAGGTGGGCGTAAACATCCGCAGCAGGAATTCTTGCAGGTTGATACCTCTAAGATCCTGTTTATTTGTGGCGGTGCGTTTGCCGGTCTGGATAAAGTGATTTCCCACCGTGTAGAAACCGGCTCCGGCATTGGTTTTGGCGCGACGGTAAAAGCGAAGTCCGACAAAGCAAGCGAAGGCGAGCTGCTGGCGCAGGTTGAACCGGAAGATCTGATCAAGTTTGGTCTTATCCCTGAGTTTATTGGTCGTCTGC。在获得第一组合序列或第二组合序列之后，引物Pl和引物P4对应的序列位于该第一组合序列或第二组合序列5’末端和3’末端，而在引物Pl和P4中加入酶切位点，便于在构建敲除质粒时对第一组合序列或者第二组合序列与载体质粒同时进行双酶切处理，然后进行连接以构建成敲除质粒。本发明实施例中使用BamHI和sacl酶切位点，该两种酶为本领域技术人员熟知的酶。 具体地，在本发明实施例中，上述第一序列、第二序列、第三序列的克隆顺序不分先后，可同时进行，也可先后分别进行。具体地，在本发明实施例中，上述第一敲除质粒、第二敲除质粒的构建顺序不分先后，可同时进行，也可先后分别进行。具体地，在本发明实施例中，获得该第三序列，即kansacB基因序列，可通过设计特定PCR引物克隆获得，也可通过序列合成的方式获得，并且该获得的第三序列可通过融合PCR或其他连接方式与该第一序列和第二序列进行连接。本发明实施例中优选使用具有以下序列的引物对P5和P6克隆kansacB基因序列:正向引物P5 TCTGATTTCCCCTCACGCTGCCGCAA SEQ ID NO:7，反向引物P6 ATGATTGACCCGGGCGTCGTGGACTATG SEQ ID NO:8。具体地，kansacB基因序列是指两段串连在一起的两段基因序列:kan基因和sacB基因，其中kan基因为卡那霉素抗性基因，sacB基因表示的是蔗糖果聚糖酶基因。 kan基因序列为SEQ ID NO:9，具体为:CCCCTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGAT
GCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGA
ACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCA
CTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCC
GAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCA
AGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGC
ATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACC
CATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGG
TGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACC
GCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTC
TGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCC
GCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCAT
GCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAGCTTCAAAAGCGCTCT。sacB基因序列为SEQ ID NO: 10，具 体为:TGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCTAGAGGATCGATCCTTTTTAACCCATCACATATACCTGCCGTTCACTATTATTTAGTGAAATGAGATATTATGATATTTTCTGAATTGTGATTAAAAAGGCAACTTTATGCCCATGCAACAGAAACTATAAAAAATACAGAGAATGAAAAGAAACAGATAGATTTTTTAGTTCTTTAGGCCCGTAGTCTGCAAATCCTTTTATGATTTTCTATCAAACAAAAGAGGAAAATAGACCAGTTGCAATCCAAACGAGAGTCTAATAGAATGAGGTCGAAAAGTAAATCGCGCGGGTTTGTTACTGATAAAGCAGGCAAGACCTAAAATGTGTAAAGGGCAAAGTGTATACTTTGGCGTCACCCCTTACATATTTTAGGTCTTTTTTTATTGTGCGTAACTAACTTGCCATCTTCAAACAGGAGGGCTGGAAGAAGCAGACCGCTAACACAGTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAGCAACAGTATTAACCTTTACTACCGCACTGCTGGCAGGAGGCGCAACTCAAGCGTTTGCGAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGAAACATACGGCATTTCCCATATTACACGCCATGATATGCTGCAAATCCCTGAACAGCAAAAAAATGAAAAATATCAAGTTTCTGAATTTGATTCGTCCACAATTAAAAATATCTCTTCTGCAAAAGGCCTGGACGTTTGGGACAGCTGGCCATTACAAAACGCTGACGGCACTGTCGCAAACTATCACGGCTACCACATCGTCTTTGCATTAGCCGGAGATCCTAAAAATGCGGATGACACATCGATTTACATGTTCTATCAAAAAGTCGGCGAAACTTCTATTGACAGCTGGAAAAACGCTGGCCGCGTCTTTAAAGACAGCGACAAATTCGATGCAAATGATTCTATCCTAAAAGACCAAACACAAGAATGGTCAGGTTCAGCCACATTTACATCTGACGGAAAAATCCGTTTATTCTACACTGATTTCTCCGGTAAACATTACGGCAAACAAACACTGACAACTGCACAAGTTAACGTATCAGCATCAGACAGCTCTTTGAACATCAACGGTGTAGAGGATTATAAATCAATCTTTGACGGTGACGGAAAAACGTATCAAAATGTACAGCAGTTCATCGATGAAGGCAACTACAGCTCAGGCGACAACCATACGCTGAGAGATCCTCACTACGTAGAAGATAAAGGCCACAAATACTTAGTATTTGAAGCAAACACTGGAACTGAAGATGGCTACCAAGGCGAAGAATCTTTATTTAACAAAGCATACTATGGCAAAAGCACATCATTCTTCCGTCAAGAAAGTCAAAAACTTCTGCAAAGCGATAAAAAACGCACGGCTGAGTTAGCAAACGGCGCTCTCGGTATGATTGAGCTAAACGATGATTACACACTGAAAAAAGTGATGAAACCGCTGATTGCATCTAACACAGTAACAGATGAAATTGAACGCGCGAACGTCTTTAAAATGAACGGCAAATGGTACCTGTTCACTGACTCCCGCGGATCAAAAATGACGATTGACGGCATTACGTCTAACGATATTTACATGCTTGGTTATGTTTCTAATTCTTTAACTGGCCCATACAAGCCGCTGAACAAAACTGGCCTTGTGTTAAAAATGGATCTTGATCCTAACGATGTAACCTTTACTTACTCACACTTCGCTGTACCTCAAGCGAAAGGAAACAATGTCGTGATTACAAGCTATATGACAAACAGAGGATTCTACGCAGACAAACAATCAACGTTTGCGCCGAGCTTCCTGCTGAACATCAAAGGCAAGAAAACATCTGTTGTCAAAGACAGCATCCTTGAACAAGGACA
ATTAACAGTTAACAAATAACAAATAAAAACGCAAAAGAAAATGCCGATGGGTACCGAGCGAAATGACCGACCAAGCG
ACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCG
GGACGCCCTCGCGGACGTGCTCATAGTCCACGACGCCCG。其中sacB基因的作用是利用培养基进行反选。含有sacB基因的细菌在含有蔗糖的培养基中是致死的，因而在本发明实施例中可以用含有蔗糖的固体培养基来筛选第二次双交换的菌株，即目的重组大肠杆菌。在原来已经插入细菌基因组上的自杀质粒(即PMAK705质粒，含有sacB)在传代中消失时，sacB基因也随之从重组菌的基因组中消失，因而发生第二次双交换的目的菌株能在蔗糖培养基上生长，即实现了对于第二次双交换的菌株的筛选。在本发明实施例中利用了两次双交换操作，在每次双交换操作过程中，先将特定基因序列插入至特定位点，进行单交换，然后利用同源重组，特定基因序列替换掉目的基因序列，实现了双交换。具体地，该第一序列、第三序列和第二序列的连接通过融合PCR进行，融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的DNA片段连接起来，该技术不需要内切酶和连接酶而实现了 DNA片段的连接，操作简便。优选地，在将上述第一序列及第二序列连接成第二组合序列时，使用引物对Pl (SEQ ID N0:1)和P7(SEQ ID NO:11)扩增该第一序列，同时用引物对P8 (SEQ ID NO:12)和P4(SEQ ID NO:4)扩增第二序列，然后利用融合PCR技术，将该第一序列及第二序列连接在一起。其中引物P7和引物P8序 列为具体为:P7 ATGATTGACCAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO:11，P8 CGTCTGATTTGGTCAATCATTAGAACAG SEQ IDNO: 12。具体地，在将该第一组合序列插入至质粒PMAK705时，将该第一组合序列和质粒PMAK705分别进行BamHI和sacl双酶切处理，然后用DNA连接酶连接，获得第一敲除质粒，该DNA连接酶为T4连接酶。具体地，在将该第二组合序列插入至质粒pMAK705时，将该第二组合序列和质粒PMAK705分别进行BamHI和sacl双酶切处理，然后用DNA连接酶连接以获得第二敲除质粒。在本发明实施例中，将该第一敲除质粒和该第二敲除质粒转化至大肠杆菌时均采用电转化的方式，以具有较高的转化效率。具体地，在将第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中之后，该第一敲除质粒与大肠杆菌染色体进行同源重组，如图1所示，左侧图中⑶为第一序列，kansacB为第三序列，CD为第二序列，它们组合在一起构成第一组合序列，该第一组合序列替换掉大肠杆菌BL2KDE3)中含有ClpP基因及其上下游部分序列的一段序列。由于同源重组的效率不可能为100%，因此需对转化后的大肠杆菌进行相应的培养筛选，以获得转化有该第一敲除质粒的第一次双交换大肠杆菌。本发明使用的质粒PMAK705为温度敏感复制子，其在44°C时不表达氯霉素抗性且不能复制，但在该质粒整合至宿主染色体上时，可利用宿主的启动子来启动表达，因此可利用含氯霉素抗性的培养基对转化有质粒PMAK705的菌株进行筛选，以得到转化有该第一敲除质粒的第一次双交换大肠杆菌。
具体地，在将第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌BL21(DE3)中之后，该第二敲除质粒与上述第一次双交换大肠杆菌同源重组，如图1所示，右侧图中第二组合序列，即⑶-⑶，替换掉与之有同源臂的KansacB基因及其上下游序列，通过第二次双交换实现了对KansacB基因的敲除。由于不可能全部实现双交换，因此该敲除后同样需要培养筛选以获得第二次双交换大肠杆菌，即敲除标记基因的KansacB基因的大肠杆菌BL21(DE3)。本发明实施例利用了 RecA重组系统，通过构建携带有目的基因上下游同源臂的自杀质粒(本发明实施例使用PMAK705质粒)，使质粒骨架上两同源臂中的标记基因替代基因组上的目的基因，第一次替换是将ClpP基因替换为KansacB基因，引入卡那霉素抗性，便于筛选，第二次利用相同的同源重组步骤将KansacB基因敲除，最终构建成目的基因突变菌。本发明实施例制备的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)在表达外源蛋白时可减少目的蛋白的降解。以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释。实施例11.第一组合序列的获得(I)按以下序列合成各对引物:第一引物对:正向引物Pl:ATAGGATCCTCGTCATCGAATGATTTA SEQ ID NO:1,反向引物P2:GCGTGAGGGGAAATCAGACGCTTTACCG SEQ ID NO:2,其中引物Pl的下划线部分为BamHI酶切位点；第二引物对:正向引物P3:ACGACGCCCGGGTCAATCATTAGAACAG SEQ ID NO:3，反向引物 P4:CGCGAGCTCGCAGACGACCAATAAACT SEQ ID NO:4，其中引物P4的下划线部分为sacl酶切位点；第三引物对:正向引物P5 TCTGATTTCCCCTCACGCTGCCGCAA SEQ ID NO:7，反向引物P6 ATGATTGACCCGGGCGTCGTGGACTATG SEQ ID NO:8。(2)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，用引物Pl和P2，用fastPfu DNA聚合酶扩增部分ClpP基因5’端部分序列及其上游序列的一部分，得到1051bp上游同源臂(SEQID NO:5)，命名为⑶；同时以引物P3和P4扩增ClpP基因3’端部分序列及其下游序列的一部分，得到1161bp下游同源臂(SEQ ID NO:6)，命名为⑶。再以质粒I3UC-KS为模板，以引物 P5 和 P6 扩增 kansacB 基因序列，得到 3527bp 的 DNA 片段:SEQ ID N0:9_SEQ ID NO: 10,
两者串联在一起。PCR反应体系如下所示:
权利要求
1.一种ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，包括以下步骤: 分别以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，克隆包括ClpP基因5’端表达序列及其上游序列的第一序列和包括ClpP基因3’端表达序列及其下游序列的第二序列:其中用第一引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2克隆所述第一序列，用第二引物对SEQ ID NO:3和SEQID NO:4克隆所述第二序列； 以质粒PUC-KS为模板，获得第三序列，所述第三序列为kansacB基因； 按照第一序列、第三序列及第二序列的顺序将所述第一序列、第三序列及第二序列连接成一段序列得第一组合序列，其中所述第一序列3’端与第三序列5’端连接，所述第三序列3’端与所述第二序列5’端连接； 将所述第一组合序列插入至质粒PMAK705，获得第一敲除质粒； 将所述第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得第一次双交换大肠杆菌；按照第一序列及第二序列的顺序将所述第一序列及第二序列连接成一段序列得第二组合序列，其中所述第一序列3’端与第二序列5’端连接； 将所述第二组合序列插入至质粒PMAK705,构成第二敲除质粒； 将所述第二敲除质粒转化至所述第一次双交换大肠杆菌中，获得目的重组大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，所述第三序列为利用第三引物对SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6通过PCR扩增获得。
3.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，所述将第一组合序列插入至质粒pMAK705的步骤包括将第一组合序列与质粒pMAK705分别进行双酶切处理，然后进行连接的步骤。
4.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，所述将第二组合序列插入至质粒PMAK705的步骤包括将第二组合序列与质粒PMAK705分别进行双酶切处理，然后进行连接的步骤。
5.如权利要求3或4所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，所述双酶切处理为同时用BamHI和sacl进行处理。
6.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，在获得第一组合序列的步骤中，所述第一序列、第三序列及第二序列采用融合PCR技术连接。
7.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，所述将第一序列及第二序列连接成一段序列得第二组合序列步骤中，使用引物对Pl和Ρ7扩增所述第一序列，使用引物对Ρ8和Ρ4扩增所述第二序列，并利用融合PCR技术将所述第一序列及第二序列连接在一起，其中所述引物Ρ7序列为SEQ ID Ν0:11，所述引物Ρ8为SEQID NO:12ο
8.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，将所述第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)的步骤以及将所述第二敲除质粒转化至所述第一次双交换大肠杆菌BL21 (DE3)的步骤均通过电转化进行。
9.如权利要求1所述的ClpP基因缺失大肠杆菌BL21(DE3)制备方法，其特征在于，将所述第一敲除质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中之后，包括对所得的重组大肠杆菌BL21(DE3)进行筛选的步骤。
10.一种ClpP基因缺失大肠杆菌BL21 (DE3)，其特征在于，利用权利要求1_9中任一项所述的制备方法制 得。
全文摘要
本发明适用于生物技术领域，尤其涉及一种ClpP基因缺失大肠杆菌制备方法，包括克隆第一序列(SEQ ID NO:5)和第二序列(SEQ ID NO:6)；获得kansacB基因作为第三序列；将它们连接成第一组合序列；将第一组合序列插入至质粒pMAK705，获得第一敲除质粒；转化该第一敲除质粒，获得第一次双交换大肠杆菌；将第一序列和第二序列连接成第二组合序列，将其插入至质粒pMAK705，构成第二敲除质粒；将该第二敲除质粒转化至该第一次双交换大肠杆菌中，获得目的大肠杆菌。本发明的制备方法操作简便，且未引入任何多余的序列，避免基因敲除后在染色体上留下残留痕迹，有利于菌株的基因组的稳定，且更方面于后续的改造工作。
文档编号C12N15/09GK103205415SQ201310052630
公开日2013年7月17日 申请日期2013年2月18日 优先权日2013年2月18日
发明者徐东, 吴春艳 申请人:深圳市亚太兴实业有限公司