专利名称：一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因snp位点的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种能用于快速检测华法林个体化用药相关基因SNP位点的方法，具体说是通过抽取人外周血DNA，通过Taq man探针特异性PCR扩增后进行荧光信号分析，对CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)两个多态性位点进行快速精确基因分型。该方法可以用于临床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、治疗，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。
背景技术：
华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病如:人工瓣膜置换、静脉血栓形成(肺栓塞)、房颤等的口服抗凝治疗，以及降低心肌梗死复发及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危险。但是华法林的剂量很难掌握，因为不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前，CYP2C9和维生素K环氧化物还原酶(VKOR)基因多态性对华法林代谢的影响逐渐被认识，其中CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)与华法林关系最为密切，都与代谢酶的损伤有关，从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。因此，临床上一种快速准确的基因分型方法的应用将对需华法林治疗的患者提供个体化的医疗方案。现在已经证实有30多种基因相互作用决定华法林代谢、转运和药理作用。患者不同的药物基因组学信息是导致华法林剂量差异的重要因素。与遗传因素相关的低凝血酶原患者最常见的原因是CYP2C9代谢活性降低和药物靶标VKORCl (vitamin K epoxidereductase complexl)低表达。这两种基因的遗传多态性在全世界范围内可解释15%和25%的华法林剂量变异。有研究显示基于这两种基因多态性的华法林使用剂量能够有效的减少不良事件的发生和血栓性疾病的预防`[1，2]。因此美国FDA在2007年修改了华法林的使用说明，建议在使用华法林前进行基因分型。而且CYP2C9、VKORCl基因多态性分析已经成为国内外有条件的临床实验室重要检测项目。目前检测CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)遗传多态性的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。荧光定量PCR和多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这两种方法的原理仍然是基于普通PCR的原理，荧光信号的强弱，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序法价格相对昂贵且操作流程繁琐，在人类后基因组时代突飞猛进的今天，这几种方法均不能满足当前对VKORCl (-1639G/A)和CYP2C9 (1075A/C) SNP位点快速准确分析的要求。Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用的前景值得期待。其基本原理是:应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自的基因型；用两种荧光染料FAM，HEX (VIC)分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。所以该方法中引物长度，探针长度，引物特异性，探针特异性对检测结果的特异性和敏感性非常重要。
发明内容
本发明要解决的首要技术问题是提供一种能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的方法。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种快速能精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:一种能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的方法，该方法通过提取人的外周血白细胞基因组DNA，采用Taqman探针的方法测定受试者的CYP2C9*3(1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)两个位点的基因型。一组能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的引物，该引物能特异性的扩增出CYP2C9*3 (1061A/C)和VKORCl (-1639G/A)位点的扩增产物，一组能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的探针，该探针能特异性的结合在目的片段， 通过PCR扩增实现荧光信号的倍增。其核心是利用Taq酶的3’ _5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。
具有序列表SEQ ID No:1到10所示的碱基序列:其中SEQ ID No:1是CYP2C9 *3 (1061 A/C)，SEQ ID No:10 是 VKORCl (-1639G/A), SEQIDNo:2 和 3 所示序列为 CYP2C9*3(1061 A/C)位点F和R引物序列，SEQ ID No:4和5所示序列为VKORCl (-1639G/A)位点F和R引物序列。SEQ ID No:6和7所示序列为CYP2C9氺3 (1061A/C)位点FAM和HEX探针序列，SEQ ID No:8和9所示序列为VKORCl (-1639G/A)位点FAM和HEX探针序列。本发明提供第一组引物，其特征在于，所述引物为下列序列所示的引物对:F 引物 5，-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3’ (SEQ ID No:2)R 引物 5，-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3，(SEQ ID No:3)本发明还提供第一组探针，其特征在于，所述探针为下列序列所示的探针:HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ; (SEQ ID No:6)，和FAM 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID No:7)。进一步，本发明的第一组探针的5，端标记有报告基因，3，端标记有荧光淬灭基团。优选所述探针的5’端标记的报告基因是FAM或VIC，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。本发明还提供上述引物或者探针在制备检测CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点的试剂盒中的应用。所述CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点优选和华法林个体化用药相关。本发明提供第一种试剂盒，其特征在于，包括上述检测CYP2C9*3(1061A/C)多态性位点的引物的核酸分子。该试剂盒优选进一步包括上述任一探针，更优选的是，所述试剂盒中引物和探针的含量为F引物0.5 μ 1，R引物0.5 μ 1，FAM探针0.1 μ 1，HEX探针0.1 μ I。本发明还提供一种上述试剂盒在检测CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点中的应用，优选的所述CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点和华法林个体化用药相关。
本发明还提供第二组引物，其特征在于，所述引物为下列序列所示的引物对:F 引物 5，-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3’ (SEQ ID No:4)R 引物 5，-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3，(SEQ ID No:5)。本发明还提供第二组探针，其特征在于，所述探针为下列序列所示的探针:HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ; (SEQ ID No:8)，和FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ ID No:9)。进一步，本发明的第二组探针的5，端标记有报告基因，3，端标记有荧光淬灭基团。优选所述探针的5’端标记的报告基因是FAM或VIC，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。本发明提供一种上述第二组引物或者第二组任一探针在制备检测VKORCl(-1639G/A)多态性位点的试剂盒中的应用。所述VKORCl (-1639G/A)多态性位点优选和华法林个体化用药相关。本发明还提供第二种试剂盒，其特征在于，包括第二组引物的核酸分子。优选，所述试剂盒还包括上述任一第二组探针。进一步，所述试剂盒中的核酸分子含量优选F引物0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，FAM 探针 0.1 μ 1，HEX 探针 0.1 μ I。本发明还提供上述第二种试剂盒在检测VK0RC1(_1639G/A)多态性位点中的应用。优选的，所述VKORCl (-1639G/A)多态性位点和华法林个体化用药相关。本发明还提供第三组引物，其特征在于，所述引物为第一组和第二组引物对:F 引物 5，-TGCAAGACAGGAGCCACATG-3’ (SEQ ID No:2)R 引物 5，-GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3，(SEQ ID No:3)，和F 引物 5，-AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3’(SEQ ID No:4)R 引物 5，-TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3，(SEQ ID No:5)本发明还提供第三组探针，其特征在于，所述探针为第一组和第二组探针:HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ; (SEQ ID No:6)，FAM 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID No:7)，和HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ; (SEQ ID No:8)，FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ I D No:9)。进一步，本发明的第三组探针的5，端标记有报告基因，3，端标记有荧光淬灭基团。优选所述探针的5’端标记的报告基因是FAM或VIC，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。本发明还提供上述第三组引物或者任一探针在制备联合检测CYP2C9*3(1061A/C)多态性位点和VKORCl (-1639G/A)多态性位点的试剂盒中的应用。所述CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点和VKORCl (-1639G/A)多态性位点优选和华法林个体化用药相关。本发明提供第三种试剂盒，其特征在于，包括上述第三组引物的核酸分子。该试剂盒优选进一步包括上述第三组任一探针，更优选的是，所述试剂盒中每对引物和探针的含量为 F 引物 0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，FAM 探针 0.1 μ 1，HEX 探针 0.1 μ I。本发明还提供一种上述第三组试剂盒在联合检测CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点和VKORCl (-1639G/A)多态性位点中的应用，优选的所述CYP2C9*3 (1061A/C)多态性位点和VKORCl (-1639G/A)多态性位点和华法林个体化用药相关。进一步，一种能快速精确进行华法林个体化用药相关SNP位点基因分型的试剂盒(10人份)，由以下试剂组成:
TaqMan* Genotyping Master Mix28 μ I, F 引物 0.5 μ 1，R 引物 0.5 μ 1，FAM 探针
0.1 μ 1，HEX探针0.1 μ 1，余量为超纯水，总体积为50μ I。F和R引物是序列表SEQ ID No:2和3，或SEQ ID No:4和5所示的碱基序列。FAM和HEX探针是序列表SEQ ID No:6和7，或SEQID No:8和9所示的碱基序列。试剂盒保存温度为-20度。本发明具有以下优点:使用了目前国际上普遍认同的TaqMan探针技术对CYP2C9*3 (1061 A/C)和VKORCl (-1639G/A)进行基因分型，其原理主要是，在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5’端标记有报告基因，如FAM，VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’ _5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。
图1CYP2C9*3 (1061 A/C)和 VKORCl (-1639G/A)各基因型的 TaqMan 基因分型图谱。图中红点代表等位基因X，绿点代表等位基因XY，蓝点代表等位基因Y。A图为CYP2C9*3(1075 A/C)(rsl057910)探针分型结果，绿点为 CYP2C9*l/*3，红点为 CYP2C9*1/*1 ;B 图为VKORCl (-1639A/G) (rs9923231)探针分型结果，红点为 VKORCl (-1639A/A)，蓝点为 VKORCl(-1639G/G)，绿点为 VKORCl (-1639A/G)图2CYP2C9*3 (1061 A/C)和 VKORCl (-1639G/A)各基因型的 DNA 测序图谱。a图为VKORCl (-1639G/A)位点的DNA测序图，共有三种基因型分别是-1639A/A, -1639G/A和-1639G/G ；b图为CYP2C9*l/*3位点的DNA测序图，共有两种基因型分别是CYP2C9*1/*1和 CYP2C9*l/*3。下面结合具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
具体实施例方式实施例一种能用于快速精确华法林个体化用药相关基因SNP位点基因分型的试剂盒一、试剂盒成分、使用方法及结果1.PCR扩增试剂:10人份量
权利要求
1.一种引物，其特征在于，所述引物为下列序列所示的一对或者两对引物对:F 引物 5' -TGCAAGACAGGAGCCACATG-3' (SEQ ID No:2),R 引物 5' -GGAGAACACACACTGCCAGACAC-3' (SEQ ID No: 3 )和 / 或F 引物 5' -AACTCCTGACCTCAAGTGATCCA-3' (SEQ ID No:4),R 引物 5' -TGGGAAGTCAAGCAAGAGAAGAC-3' (SEQ ID No:5)。
2.一种探针，其特征在于，所述探针为下列序列所示的一组或者两组探针:HEX 探针 HEX-CAGAGATACCTTGACCTT-MGB ;(SEQ ID No:6), FAM 探针 FAM-AGAGATACATTGACCTTC-MGB (SEQ ID 吣:7)，和/或HEX 探针 HEX-ACCGCACCTGGCCA-MGB ;(SEQ ID No:8), FAM 探针 FAM-ACCGCACCCGGCCA-MGB (SEQ ID No:9)。
3.如权利要求2所述的探针，其中所述探针的5’端标记有报告基因，3’端标记有荧光淬灭基团，优选所述探针的5’端标记的报告基因是FAM或VIC，3’端标记的荧光淬灭基团是 TAMRA。
4.权利要求1所述的引物或权利要求2-3的任一探针在制备检测CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多态性位点的试剂盒中的应用。
如权利要求4的应用，所述CYP2C9*3 (1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多态性位点和华法林个体化用药相关。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物。
6.如权利要求6的试剂盒，其进一步包括如权利要求2-3的任一探针。
7.如权利要求7的试剂盒，所述每个引物和探针的含量为:F引物0.5μ 1，R引物·0.5 μ 1，FAM 探针 0.1 μ I, HEX 探针 0.1 μ I。
8.权利要求6-8任一所述的试剂盒在检测CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl(-1639G/A)多态性位点中的应用。
9.如权利要求10的应用，所述CYP2C9*3(1061A/C)和/或VKORCl (-1639G/A)多态性位点和华法林个体化用药相关。
全文摘要
本发明涉及一种用于快速检测华法林个体化用药相关基因SNP位点的试剂盒及其检测方法，属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术。本发明通过抽取人外周血DNA，通过Taq man探针特异性PCR扩增后进行荧光信号分析，对CYP2C9*3(1061A/C)和VKORC1(-1639G/A)两个多态性位点进行快速精确基因分型。本发明提供检测上述多态性位点的引物、探针和试剂盒，以及该引物和探针制备试剂盒中的用途，以及根据上述多态性位点检测结果确定患者的华法林用量的用途，该用途能够有效的减少华法林用量相关不良事件的发生和血栓性疾病的预防。可以用于临床需要服用华法林的各类患者的辅助诊断、治疗。
文档编号C12Q1/68GK103146692SQ20131005512
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者丁虎, 汪道文 申请人:丁虎, 汪道文